結果與討論

4-1 放大 hFSHA 和 hFSHB

我們欲表現去醣基 hFSH 的首要工作便是放大 hFSHA 和 hFSHB 此兩段基因，因此本論文利用聚合酶連鎖反應 (PCR) 作為選殖並放 大此兩段cDNA 作為整個架構之啟始。Commercial “human Pituitary Gland Marathon-Ready cDNA” 作為選殖 hFSH 次單元體基因的模 版，至於引子設計則以核苷酸資料庫搜尋出hFSH α- 和 β-次單元體 之 cDNA 序列原始文獻 [12-14] ，參照其詳細 cDNA 序列當中的成 熟胜肽 (mature peptide) 部分之 N’端設計出 PCR 引子，之後此兩對 寡核苷酸引子交付廠商進行合成。

當所需材料混合均勻之後便可進行聚合反應。PCR 之反應程式首 先以95 ℃、4 分鐘進行一個週期，其目的是確保雙股 DNA 完全變性 分離成單股 DNA。之後根據引子之 Tm 值選取適當之緩冷黏合溫度 (annealing temperature) 並進行 1 分鐘共 30 個週期之反應，其目的為 使引子黏合到單股DNA 之正確位置以進行後續之聚合作用，本實驗 經由反覆測試則以 59 ℃達到最佳結果。接著便以 72 ℃進行聚合反 應，其作用是使 DNA 聚合酶根據單股模版複製放大出所期望之 hFSHA 和 hFSHB 兩段 cDNA。

實驗五次以上之放大之後的hFSHA 和 hFSHB 經由 0.8 %瓊脂洋 菜膠體電泳之染色結果如圖 12 所示。此結果可以清楚觀察到放大之 後的DNA 片段存在稍低於 500 bp 的位置，而根據設計之引子所預測 的hFSHA 和 hFSHB 大小各分別為 316 bp 和 375 bp，雖然電泳之結果 顯示比預測之cDNA 大小稍大了約 100 bp，因此猜測有兩因素影響此 結果：一、DNA 迷你膠電泳槽之電壓不穩，導致電泳膠兩端和中央

之電流速度不一致。二、因片段大小不到 400 bp 的 hFSHA 和 hFSHB 在進行電泳接近至洋菜膠末端時，與 DNA ladder 標準品比較之後預 估的位置有如此稍許差異存在是可以接受之範圍。之後反覆電泳驗證 及接續之實驗皆能證明放大的 DNA 片段確實為所期望之 hFSHA 和 hFSHB 兩基因。

另外圖12-A 和 12-B 比較可以觀察到 hFSHA 之亮度比 hFSHB 明 顯低了許多，意即hFSHA 放大之後的濃度比 hFSHB 低，這牽涉到最 佳黏合溫度的選擇。經反覆實驗十次之結果 (55~64 ℃) ，發現選擇 59 ℃對於 hFSHB 之引子來說為最適宜溫度，但對於 hFSHA 之引子卻 不是如此適宜，因此PCR 結果顯示出如此差異。雖然 59 ℃之黏合溫 度對於放大 hFSHA 不是如此適宜，但考量到兩段基因同時進行 PCR 需設定相同反應程式且hFSHA 基因 PCR 後的濃度尚夠用於後續的實 驗，因此如此之結果可為我們所接受。

4-2 yT&A 選殖載體之構築

放大之後的hFSHA 和 hFSHB 因聚合酶之作用可在 3’端多加一個 腺嘌呤 (Adenine) ，因此可方便地將此兩段 cDNA 分別構築到 3’端 多一獨立胸腺嘧啶 (Thymidine) 的 yT&A 選殖載體中。我們利用此 特性可簡單地將 “insert DNA” 嵌入選殖載體中，之後以大腸桿菌 DH5α 之轉形殖入菌體內，如此大腸桿菌 DH5α 分別大量複製的 hFSHA 和 hFSHB，並可作為長久保存。

之後經由質體 DNA 之微量製備 (miniprep) 以二次水沖提出 hFSHA-yT&A 和 hFSHB-yT&A 兩段質體，接著以限制酶切割作為確 認是否順利構築。根據圖 13 之切割產物電泳之結果顯示確實順利將 hFSHA (316 bp) 和 hFSHB (375 bp) 兩段基因構築於 yT&A 選殖載體

中，這也意味著我們已成功利用所設計之引子選殖到 hFSH α-和 β-次 單元體之cDNA。後續實驗便是進一步轉殖到表現載體中，藉由大腸 桿菌系統表現去醣基之hFSH 兩次單元體。

4-3 pET30a 和 pACYCDuet-1 表現載體之構築

首先hFSHA-yT&A 和 pET30a 兩質體皆以 BamHⅠ限制酶進行切 割；而 hFSHB-yT&A 和 pACYCDuet-1 兩質體則以 HindⅢ限制酶進 行切割反應。選用此兩不同之表現載體有利於往後可同時將此兩質體 轉形到同一株大腸桿菌宿主中，此兩載體之基因型分別屬於不同來 源，因此在同一桿菌體內並不會隨著宿主數代繁延而剔除其中之一個 載體，但本實驗後來因兩者表現宿主之表現量有所差異而未同時轉形 進同一宿主中。待同時表現出來之後經由T4 DNA ligase 進行接合反 應，其產物再轉形至大腸桿菌體內。本論文一開始選擇大腸桿菌 NovaBlue (DE3) 作為 hFSHA-pET30a 和 hFSHB-pACYCDuet-1 兩質體 之表現宿主，亦考慮將此兩段質體同時轉形至同一株NovaBlue (DE3) 菌體內。此時轉形後之NovaBlue (DE3)先進行質體 DNA 微量製備，

並分別利用 BamHⅠ和 HindⅢ限制酶切割確認，其分別之電泳結果 如圖14 所示。

因本論文利用BamHⅠ作為hFSHA 與 pET30a 表現載體兩端之接 合點，因此以BamHⅠ截切反應作為再確認之用，期望截切完之產物 可呈現出hFSHA 與 pET30a 兩段 DNA。同理，我們利用 HindⅢ作為 hFSHB 與 pACYCDuet-1 表現載體兩端之接合點，所以也以 HindⅢ進 行再確認工作。而至於 hFSHA 和 hFSHB 兩段基因如何構築於表現載 體之相關示意圖可參照第三章3-1 之實驗流程。

圖 14-A 為 BamHⅠ切割 hFSHA-pET30a 之產物電泳結果，我們

可清楚觀察到5422 bp 的 pET30a 表現載體和 316 bp hFSHA 的存在。

另外以EcoRV 切割 hFSHA-pET30a 之結果如圖 14-B 所示，因整個構 築好之 hFSHA-pET30a 質體其間只有一個 EcoRV 切割位 (cutting site) ，故我們利用此酵素可將質體切割成線性 DNA，目的為驗證整 個質體的大小是否符合兩段DNA 相加的 5738 bp，而圖 14-B 電泳結 果確實如此。

同 理 可 證 ， 在 圖 14-C 可 觀 察 到 經 HindⅢ切 割 hFSHB- pACYCDuet-1 質體產物存在著預期的 4008 bp pACYCDuet-1 和 375 bp hFSHB 兩 DNA 片段，而圖 14-D 則以 BamHⅠ切割證明了 4383 bp hFSHB-pACYCDuet-1 質體的存在。整合圖 14 四張電泳圖便可明確指 出各轉形後之菌體內抽出的質體經由各限制酶切割的產物與預期結 果確實相當吻合，到此我們已成功地將hFSHα-和 β-次單元體之 cDNA 轉殖到大腸桿菌表現系統當中，接著便是進行蛋白質表現與純化。另 一方面為確保選殖到的cDNA 序列正確無誤，故將選殖到的菌株交付 廠商進行DNA 定序作為再次確認之用。

本 論 文 將 廠 商 定 序 完 成 之 序 列 與 我 們 所 預 測 接 合 完 成 的 hFSHA-pET30a 序列利用 European Bioinformatics Institute 線上之 Clustal W 軟體進行關係比對 [52] ，圖 15 為 hFSHA-pET30a 之 DNA 定序與預期序列之比對結果，而圖16 為 hFSHB-pACYCDuet-1 之 DNA 定序與預期序列之比對結果。我們分析比對結果可發現圖 15 在 stop codon 以前之序列兩者毫無誤差，此數據即表示 DNA 定序結果 100 % 符 合 預 期 之 hFSHA-pET30a 序 列 。 此 外 ， 圖 16 於 預 期 之 hFSHB-pACYCDuet-1 序列第 108 個核苷酸 C 突變成 A，其對應之胺 基酸密碼子從 ACC 變成 ACA，但經由胺基酸對照之結果發現 ACC 和ACA 同樣轉譯成 Threonine (Thr) ，所以此核苷酸點突變不影響往 後表現出來的蛋白質結構，經由計算得知圖 16 的數據顯示了 DNA

定序結果有99.73 %符合預期之 hFSHB-pACYCDuet-1 序列。圖 15 和 16 之結果得知轉殖到大腸桿菌表現系統當中的質體胺基酸序列 100

% 符 合 預 期 結 果 ， 因 此 可 證 明 確 實 為 hFSHA-pET30a 和 hFSHB-pACYCDuet-1。

值得注意的是hFSHA-pET30a 和 hFSHB-pACYCDuet-1 當中的 6x His․Tag 序列和次單元體序列之間接合了一胺基酸片段，其為一蛋白 酶切位 (thrombin cutting site) 和 S․Tag 序列，可提供另一純化方式 且待其蛋白質表現出來之後可利用蛋白酶將前端純化用之多胜肽切 除以更符合生物體之狀態。

4-4 去醣基 hFSH α- 和 β-次單元體之表現

為了觀察是否確實表現出hFSH α- 和 β-次單元體之存在，先以 大腸桿菌小量表現此兩次單元體。所謂小量表現蛋白質之含意為培養 3 ml 之菌液加以 IPTG 誘導之，本論文在去醣基 hFSH α-次單元體方 面先以濃度0.5 mM 的 IPTG 處理 NovaBlue (DE3) 進行測試，於 37

℃、200 rpm 下培養 4 小時觀察之。之後將菌體分解打破後分為兩部 分：水溶性之上清液和包涵體 (inclusion body) 之沈澱再懸浮部分，

此兩產物再和正、負對照組進行 SDS-PAGE 和西方墨點法鑑定之，

圖 17 為 SDS-PAGE 之結果，圖 18 則呈現出西方墨點法呈色反應之 後的數據。首先就PAGE 圖來看，明顯在 Lane 2：以 0.5 mM 的 IPTG 處理4 小時之後的破碎菌體全產物和 Lane 3：以 0.5 mM 的 IPTG 處 理4 小時之後的破碎菌體包涵體部分之中觀察到去醣基 hFSH α-次單 元體的蛋白質帶存在於約20 kDa 之位置，至於未加以 IPTG 誘導處理 的Lane 1 和誘導 4 小時的破碎菌體上清液之 Lane 4 也在同樣位置存 在著微量之蛋白質。此外負對照組方面，大腸桿菌 NovaBlue (DE3) 本 身 (Lane 6) 和只轉殖 pET30a 而不會表現出 hFSH α-次單元體的

NovaBlue (DE3) (Lane 5) 兩菌株則為有約 20 kDa 位置的蛋白質存在 著，根據以上各結果都說明了 SDS-PAGE 可看出 α-次單元體的表現 情形。圖 18 之西方墨點法結果則提供直接之證據，無論利用抗 6x His 之一級抗體或者抗 FSH 之一級抗體皆顯示著與 SDS-PAGE 同樣之結 果，從圖18 可知抗體已辨識到所期望之目標蛋白質：hFSH α-次單元 體。

而hFSH β-次單元體方面則以濃度 0.5 mM 的 IPTG 處理 NovaBlue (DE3) 進行測試，於 37 ℃、200 rpm 下培養 4 小時之後卻無法於 SDS-PAGE 觀察到明顯之蛋白質帶，故 β-次單元體後來多測試了 1.0 mM IPTG 的條件，亦無法觀察到，圖 19 指出了以上之結果，這表示 NovaBlue (DE3) 菌株表現出來 β-次單元體含量的甚為微弱，故將 hFSHB-pACYCDuet-1 額外轉殖至其他三種表現型大腸桿菌宿主：

BL21 (DE3) 、BL21 trxB (DE3) 和 Origami (DE3) ，試圖尋找出 β-次單元體之最佳表現量。可惜的是如圖 20-22 所示其 SDS-PAGE 結果 皆與圖 19 相同無法明確觀察到明顯蛋白質帶，為了證明 β-次單元體 確實被大腸桿菌所表現則進一步以西方墨點法鑑定之。利用抗6x His 作為一級抗體的西方墨點法結果呈現於圖 23，根據此數據正符合了 我們假設的β-次單元體之微量存在，且其位於 18 kDa 左右之位置。

根據小量表現測試的結果，實驗進行到此已證明了兩點事實：第 一點是hFSH α-次單元體可被 NovaBlue (DE3) 表現甚多，最佳表現 條件為0.5 mM 的 IPTG 以 37 ℃誘導 4 小時，又因為 hFSH α-次單元 體迅速大量累積在系菌體內導致形成包涵體，故往後 hFSH α-次單元 體的大量表現之後序處理將以高濃度的變性劑-8 M 尿素溶解包涵 體 ， 得 到 菌 體 內 全 部 變 性 (denature) 之 α- 次 單 元 體 後 再 折 疊 (refolding) 恢復之。第二點為 hFSH β-次單元體也可被細菌表現出

來，但其表現量甚微，此問題關係到如此微量的表現是否能夠支持後

來，但其表現量甚微，此問題關係到如此微量的表現是否能夠支持後