2-1 菌株與細胞株
大腸桿菌株
y Escherichia coli DH5αTM，購自於 Invitrogen 公司。
y Escherichia coli NovaBlue (DE3) ，購自於 Novagen 公司。
y Escherichia coli BL21 (DE3) ，購自於 Novagen 公司。
y Escherichia coli BL21 trxB (DE3) ，購自於 Novagen 公司。
y Escherichia coli OrigamiTM (DE3) ，購自於 Novagen 公司。
品種 (Strain) 基因型 (Genotype)
DH5αTM F-ψ80dlacZ∆M15∆ (lacZYA-argF) U169 deoR recA1 endA1 hsdR17 (rk -, mk +) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1
NovaBlue (DE3) endA1 hsdR17 (rK12– mK12+) supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lacF' [ proA+B+ lacIqZ
∆M15 ::Tn10 (TcR)] (DE3)
BL21 (DE3) F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm (DE3) BL21 trxB (DE3) F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm trxB15::kan
(DE3)
OrigamiTM (DE3) ∆ara-leu 7697 ∆lacX74 ∆phoAPvull phoR araD139 galE galK rpsL F’ [lac+(lacIq)pro]
gor522::Tn10 (TcR) trxB::kan (DE3) 表2. 使用之大腸桿菌品種與其基因型類別
細胞株
y 人類卵巢癌細胞株－SKOV-3，獲於陽明大學黃娟娟教授贈與。
名稱 SKOV-3
ATCC 編號 HTB-77
生物體 人種 (Homo sapiens) 器官 卵巢 (ovary)
形態 上皮 (epithelial)
癌症類別 腺癌 (adenocarcinoma)
培養基 90 % DMEM 加上 10 %胎牛血清
培養環境 額外加入5 % CO2培養於37 ℃細胞培養箱 繼代條件 細胞密度介於105 ~106 cells/ml 時即刻繼代 凍管保存 95 %培養基加上 5 % DMSO
表3. SKOV-3 細胞株基本資料表
2-2 培養基
菌株培養
y Luria-Bertani (LB) broth
10 g tryptone、5 g yeast extract 和 10 g NaCl (購自於 Sigma 公司) 溶 於900 ml 二次水，利用 NaOH 調整 pH 值至 7.0，之後補水至最 後體積為1 公升。高壓滅菌 30 分鐘。
y LB agar plate
配法和LB broth 相同，另多添加 15 g bactoagar (購自 Sigma 公 司) 。
y Ampicillin，購自於生工公司
將 Ampicillin 溶於二次水，最後濃度達到 50 mg/ml，再以 0.22 µm filter 過濾滅菌，之後分裝儲存於-20 ℃。
y Kanamycin，購自於生工公司
將 Kanamycin 溶於二次水，最後濃度達到 10 mg/ml，再以 0.22 µm filter 過濾滅菌，之後分裝儲存於-20 ℃。
y Chloramphenicol，購自於生工公司
將 Chloramphenicol 溶於 100 %乙醇，最後濃度達到 34 mg/ml，
再以0.22 µm filter 過濾滅菌，之後分裝儲存於-20 ℃。
y Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) ，購自於生工公司
將2.383 g IPTG 溶於 8 ml 二次水，調整至其最後體積為 10 ml。
再以 0.22µm filter 過濾滅菌，然後分裝儲存於-20℃。
細胞培養
y Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) ，購自於 Sigma 公 司。將DMEM 培養液粉末溶於 500 ml 的二次水，以二次水反覆 沖洗殘留於袋中的粉末，再加入1.5 g NaHCO3，加水至800 ml，
調整pH 值至 7.2，補水到最後體積 900 ml。以 0.22 µm filter 過 濾滅菌並儲存於4 ℃。
y Fetal Bovine Serum (FBS) ，購自於 GIBCOTM公司 平時儲存於-20 ℃，使用前一天先置於 4 ℃冰箱回溫。
y Trypsin/EDTA
Working concentration：以 PBS 稀釋 10 倍 y Dimethyl sulfoxide (DMSO)
開封後若未使用完可冰於 4 ℃儲存，待下次使用時置於室溫回
溫，若DMSO 於 4 ℃狀況下不會凝結成固態，則應丟棄不再使用。
2-3 人類腦下腺 cDNA 庫 (cDAN library)
y Human Pituitary Gland Marathon-Ready cDNA，購自於 CLONTECH 公司。
2-4 轉殖載體
y yT&A cloning vector，購自於益生生技股份有限公司。 (附錄 A) y pET30a，購自於 Novagen 公司。 (附錄 B)
y pACYCDuet-1，購自於 Novagen 公司。 (附錄 C)
2-5 藥品試劑
PCR 引子
y 引子 (oligonucleotide primer) 製備由生工有限公司和百力生物科 技股份有限公司合成。
質體DNA 微量製備純化套組
y Gene-SpinTM -V2，購自於波士特生物科技股份有限公司。
DNA 瓊脂洋菜膠純化套組
y GFXTM PCR DNA and Gel Band purification kit，購自於 Amersham Biosciences Ltd.。
酵素
y Taq DNA polymerase，購自於 Violet 公司。
y Restriction enzyme BamHⅠ，購自於Promega 公司 y Restriction enzyme EcoRⅤ，購自於 Promega 公司 y Restriction enzyme HindⅢ，購自於Promega 公司
y YEA T4 DNA Ligase，購自於益生生技開發股份有限公司。
y T4 DNA Ligase，購自於 Promega 公司
DNA ladder 標準品
y 1 kp plus DNA ladder，購自於 Violet 公司 y Gen-100 DNA ladder，購自於 GeneMark 公司
Protein marker 標準品
y Protein molecular weight standards broad range MW 6500-205000，
購自於Amersham Biosciences Ltd.。
y BenchMarkTM unstained protein standards，購自於 Invitrogen 公司。
y Prestained protein Ladder,～10-160 kDa，購自於 Fermentas 公司。
一級抗體
y Rabbit anti-follicle stimulating hormone/lutenizing hormone polyclonal antibody，購自於 CHEMICON international, Inc.。
y Mouse anti-His monoclonal antibody，購自於 Amersham Biosciences Ltd.。
二級抗體
y Goat anti-Rabbit IgG HRP conjugated affinity purified antibody，購 自於CHEMICON international, Inc.。
y Goat anti-Mouse IgG HRP conjugated affinity purified antibody，購 自於CHEMICON international, Inc.。
野生型 (wild-type) 人類濾泡刺激素標準品
y Follicle stimulating hormone from human pituitary, 購自於 Sigma-aldrich CO.
HypercassetteTM 和 HrperfilmTM (Amersham Biosciences Ltd.)
其它用於配製試劑與緩衝液之藥品皆購自於Sigma-aldrich CO.或 Merck LTD.。
2-6 溶液與緩衝液
E.coli 勝任細胞 (competent cell) 之製備 y Transformation bufferⅠ (TfbⅠ)
30 mM CH3COOK、100 mM KCl、10 mM CaCl2、50 mM MnCl2 和 15 % glycerol，將所有成份混合均勻，利用 0.2 M acetic acid 調整 pH 至 5.8，再以 0.22 µm filter 過濾滅菌，儲存於 4 ℃。
y Transformation bufferⅡ (TfbⅡ)
10 mM MOPS、10 mM KCl、75 mM CaCl2和15 % glycerol，將所 有成份混合均勻，利用KOH 調整 pH 至 6.5，再以 0.22 µm filter 過濾滅菌，儲存於4 ℃。
DNA 電泳
y 5× Tris-borate-EDTA (TBE) electrophoresis buffer
將54 g Tris base 和 27.5 g boric acid 溶於 800 ml 的二次水，加入 20 ml 0.5 M EDTA (pH8.0)，以水調整至最後體積為 1 L，儲存於室 溫中。使用時稀釋為0.5×。
y 6× Gel-loading buffer
以二次水配製0.25 % bromophenol blue、0.25 % xylene cyanol FF 和30 % glycerol，將所有成份混合均勻後，儲存於 4 ℃。
y 0.8 % Agarose gel
取 0.8 g Agarose 粉末溶於 100 ml 二次水加熱沸騰，之後待其冷 卻，儲存於 TBE buffer 中備用。
SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) y 4× SDS gel-loading buffer
200 mM Tris-Cl (pH 6.8) 、400 mM dithiothreitol、8 % SDS、0.4 % bromophenol blue 和 40 % glycerol。Dithiothreitol 未添加前可長期 儲存於室溫，使用前再添加Dithiothreitol。
y Bacterial lysis buffer
50 mM Tris-Cl、1 mM EDTA 和 100 mM NaCl，調整 pH 值至 8.0。
y 5× Tris-glycine electrophoresis buffer
125 mM Tris base 和 1.25 M glycine 溶於 900 ml 二次水，加入 0.5 % SDS，調至 pH 值 8.3，最後以水調整至體積 1 公升。
y Coomassie Blue staining solution
將0.25 g Coomassie Brilliant Blue R-250 溶於 90 ml 的 methanol:
H2O (1:1) 混合液，再加入 10 ml glacial acetic acid。以 Whatman No.1 filter 過濾後儲存於室溫。
y Destain solution Ⅰ
600 ml ddH2O、300 ml methanol 和 100 ml glacial acetic acid 混合 均勻，儲存於室溫。
y Destain solution Ⅱ
800 ml ddH2O、100 ml methanol 和 100 ml glacial acetic acid 混合 均勻，儲存於室溫。
西方墨點法 (Western blotting) y 1× Transfer buffer
39 mM glycine、48 mM Tris base、0.037 % SDS 和 20 % methanol 混合均勻，調整pH 值至 8.0。
y Phosphate-buffered saline (PBS)
將8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4溶於 800 ml 的二次水，利 HCl 調至 pH 值 7.4，加水至最後體積 1 公升。
高壓滅菌30 分鐘。
y Blocking Solution
5 % skim milk 溶於 PBS 中。
y PBST
取PBS 溶液加入 0.05 % Tween-20。
y GBX developer and replenisher，購自於 Kodak 公司
取200 ml “developer and replenisher ” 與 718 ml 的二次水混合。
y GBX fixer and replenisher，購自於 Kodak 公司
取200 ml “fixer and replenisher ” 與 718 ml 的二次水混合。
6x His-tag 蛋白質純化 (QIAGEN Ltd.) y 管柱
Ni-NTA Agarose 和 5 ml bed-volumn column (QIAGEN Ltd.) y Lysis buffer A
100 mM NaH2PO4、10 mM Tris-HCl、10 mM imidazole 和 6 M GuHCl 混合均勻，利用 NaOH 調整 pH 值至 8.0。
y Lysis buffer B
100 mM NaH2PO4、10 mM Tris-Cl、10 mM imidazole 和 8 M urea 混合均勻，利用NaOH 調整 pH 值至 8.0。
y Wash buffer C
100 mM NaH2PO4、10 mM Tris-Cl、10 mM imidazole 和 8 M urea 混合均勻，利用NaOH 調整 pH 值至 6.1。
y Elution buffer D
100 mM NaH2PO4、10 mM Tris-Cl、250 mM imidazole 和 8 M urea 混合均勻，利用NaOH 調整 pH 值至 6.1。
y Elution buffer E
100 mM NaH2PO4、10 mM Tris-Cl、500 mM imidazole 和 8 M urea 混合均勻，利用NaOH 調整 pH 值至 6.1。
y Regeneration buffer
6 M GuHCl 和 0.2 M acetc acid 混合均勻。
去醣基hFSH 變異體 (NG-hFSH variant) 之再組成 (reconstitution) [50]
y Dialysis buffer
100 mM NaH2PO4、10 mM Tris-Cl 和 0~7 M 尿素 y Dimerization buffer
50 mM Tris-HCl (pH 8.7) 和 1 mM EDTA，另外加入 6.4 mM cysteamine 和 3.6 mM cystamine
陽離子交換層析法 y 樹脂
SP-Sepharose 4 Fast Flow ion exchange resin (Amersham Ltd.) y Equilibrium Buffer
20 mM Tris-HCl 加上 50 mM 醋酸鈉，利用 HCl 調整 pH 至 3.5。
y Elution Buffer
20 mM Tris-HCl 加上不同濃度之醋酸鈉，本實驗採用的濃度分別 為0.7 M、0.9 M、1.2 M、1.5 M、2 M 醋酸鈉，利用 HCl 調整 pH 至3.5。
生物活性測試 y MTT solution
儲存溶液 (5 mg/ml) 為 0.25 g MTT 加上約 50 ml PBS，以 0.22 µm filter 過濾，避光儲存於 4 ℃。待用時則取 10 ml 之儲存溶液加上 40 ml DMEM only 混合均勻，避光儲存於 4 ℃。
2-7 儀器
y Polymerase Chain Reaction (PCR) machine：iCycleTM Thermal Cycler, Bio-Rad, Inc.
y DNA 迷你膠電泳槽：upid-2, COSMO BIO CO., LTD y 無菌操作臺：JW-4NEW, Lian Shen Enterprise Co., LTD y 桌上型離心機：Biofuge pico, Heraeus Instruments, Inc.
y 高速離心機：GS-15R centrifuge, Backman Coulter, Inc.
y 迴轉式振盪培養箱：S300D, 一升科技(股)公司
y 迷你垂直電泳槽：Mini-Protein 3 cell, Bio-Rad Laboratories, Inc.
y 濕式電泳膠轉漬器：Mini Trans-Blot cell, Bio-Rad Laboratories, Inc.
y 細胞培養箱：CO2 water-Jacketed incubator, NuAIR US Autoflow.
y 倒立式顯微鏡：BI503, OPTIMA.
y 酵素免疫吸附分析儀：Model 550 microplate reader, Bio-Rad, Inc.
y 恆溫水浴槽：B206, 一升科技(股)公司
y 分光光度計：OPRON-3000 , HANSON TECHNOLOGY Co., LTD