方法 - 去醣基人類絨毛膜促性腺β次單元體之菌體表現

3-1 實驗流程

去醣基hCGβ和hCG’ β次單元體之大量表現 (large-scale expression)

去醣基hCGβ和hCG’ β(NG-hCGβ和NG-hCG’ β ) 之純化以西方墨點法鑑定目標次單元體

去醣基hCGβ和hCG’ β 次單元體 (subunits) 之小量表現 (small-scale expression)

決定目標次單元體之溶解性 pQE30

hCG’β cDNA (Hcg

’

pQE-30

M15[pREP4] M15[pREP4]

hCG’B/pQE30 hCGB/pQE-30

HindⅢ BamHⅠ

hCGβ cDNA (hCGB)

HindⅢ BamHⅠ

3-2 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR)

hCG 由胎盤滋養層所合成並作用於胎盤中，所以實驗設計上以實驗室現有的commercial “human Placenta Marathon-Ready cDNA ” 作 為選殖 hCG 基因的模版 (template) ，利用 PCR 方式分別放大 hCGB 和 hCG’B，而 DNA polymerase 在 PCR 產物 3’端會多加一個腺嘌呤 (Adenine) ，因此便可將此兩段 cDNA 分別構築到 yT&A 轉殖載體中 [在其間 3’端多一獨立胸腺嘧啶 (Thymidine) ，如此形成 A-T 配對] ， 接著藉由轉形技術 (Transformation) 將 hCGB 和 hCG’B 殖入 E. coli JM109 及 M15，作為長期保存和往後實驗上之利用。

3-2-1 引子設計

名稱寡核苷酸序列鹼基數

hCGB (F) 5’-CGGGATCCTCCAAGGAGCCGCTTCGGC-3’ 27

hCGB (R) 5’-CCCAAGCTTTTGTGGGAGGATCGGGGTGT-3’ 29

hCG’B (F) 5’-CGGGATCCTCCAGGGAGCCGCTTCGG-3’ 26

hCG’B (R) 5’-CCCAAGCTTGAGGAAGAGGAGGCCTGAG-3’ 28

表 2. 聚合酶連鎖反應之引子

 如表 4 所述， hCGB (F) 為放大 hCGB 片段之前置引子，hCGB (R) 同樣為反置引子；hCG’B (F) 為放大 hCG’B 片段之前置引子，

hCG’B (R) 同樣為反置引子。【註：標線處為限制酶切位 (restriction cutting site) 】

 如同緒論所提，hCGβ 和 hCG’β 次單元體之結構皆由訊息胜肽 (signal peptide) 加上成熟胜肽 (mature peptide) 所組成。但在大腸桿菌表現系統中，並無藉由訊息胜肽將成熟胜肽帶至內質網

(endoplasmic reticulum) 之過程，所以在設計引子上去除訊息胜肽之核苷酸部分，直接從成熟胜肽之N’端進行放大。

 hCGB (F)、hCGB (R) 之限制酶切位分別為 BamH

Ⅰ

和 Hind

Ⅲ

，設 計於往後利於 hCGB 構築於表現載體 pQE-30；而 hCG’β (F)、hCG’β (R) 之限制酶切位亦分別為 BamH

Ⅰ

和 Hind

Ⅲ

，亦設計於往後利 於 hCG’β 構築於表現載體 pQE-30。

 引子儲存濃度配製為 50 μM，而作用濃度 (working concentration) 則為5 μM，平時儲存於-20 ℃。

3-2-2 PCR 材料與程式

表 5 之藥品混合均勻之後總體積為 50 μl，置於 0.2 ml “thin walled tube” (ABgene Ltd.) ，放入 PCR machine 進行聚合反應，圖 10 為本實驗採用之反應程式。

材料體積 (μl)

Human Placenta Marathon-Ready cDNA 0.5 5 M Forward primer 1.5 5 M Reversward primer 1.5

10x PCR buffer 5

1 mM dNTPs 5

ddH2O 36

Taq DNA polymerase 0.5

Total volume 50

表 3. 聚合酶連鎖反應之材料

圖 12. 聚合酶連鎖反應之反應程式

3-3 yT&A 載體構築

3-3-1 PCR 產物之瓊脂洋菜膠體電泳 (Agarose gel electrophoresis)

 配製 1 %瓊脂洋菜膠 (agarose gel)：

將 gel-casting tray 置放於 tape 上，插入 well-forming comb。取 1 g agarose 溶於 100 ml 0.5×TBE buffer，搖晃均勻後微波 1 分鐘，拿出搖晃均勻再微波至完全溶解。之後將稍微冷卻的洋菜膠溶液小心倒入 casting trap，避免產生氣泡，靜置 30 分鐘待其凝固。當電泳膠完全凝固後，小心移開 comb 並去除電泳膠下方之 casting tray，電泳膠保存於 0.5× TBE buffer 中。

 電泳：

將電泳膠放置於 trap 上，再置於電泳槽之平台，此時膠體孔洞 (agarose well) 的一端須在負極的位置。電泳槽注滿 0.5× TBE buffer，

將 PCR 產物與 6× gel-loading buffer 混合均勻 (體積比 5:1) ，然後立

 電泳膠染色：

將跑完電泳後之洋菜膠放入染色用之盒子中。倒入 ethidium bromide solution (1

g/ml) 覆蓋膠體，盒子置於水平迴轉式震盪器

(orbital shaker) 上染色 30 分鐘，之後將 ethidium bromide solution 倒回儲存容器中。接著膠體以二次水搖晃退染，約置於震盪器 10 分鐘以上。便可將膠體置於紫外光光照裝置 (ultraviolet transilluminator) 上觀看。另注意 Ehidium bromide 為有毒污染物質，需全程避免碰觸身體及沾染其它乾淨區域。

3-3-2 PCR 產物之純化

經電泳後染完色的 PCR 產物接著利用 “GFX^TM PCR DNA and Gel Band purification kit” 進行純化。首先從洋菜膠上切下所需之 DNA 片段大小 (hCGB 為 435 base pairs；hCG’β 為 363 base pairs) 置 入微量離心管。之後秤量切下洋菜膠之重量並加入與重量等體積之 capture buffer (1 mg gel slice =1 μl capture buffer) 。置放微量離心管於 60 ℃乾浴加熱器中 10~15 分鐘，每隔 3 分鐘翻轉數次，直到洋菜膠完全溶解。然後將 GFX column 置放於 collection tube 上，並將溶解後之樣品轉注入 GFX column 中，放置室溫 1 分鐘。以 13,000 rpm 離心 30 秒，之後倒掉過濾液，並以 0.5 ml 的 wash buffer 清洗 GFX column，再以 13,000 rpm 離心 30 秒。倒掉過濾液，再重複離心一次，

確保殘留的乙醇完全去除。取出 GFX column 並置放於乾淨的 1.5 ml 微量離心管。加入 15~50 l 二次水復溶 DNA，靜置 1 分鐘後，再以 13,000 rpm 離心 1 分鐘，最後將沖提 (elute) 下來的 DNA 水溶液儲存於-20 ℃。

3-3-3 與 yT&A 載體進行接合反應 (Ligation)

取 5 l 純化後的 PCR 產物與 1 l 的 yT&A 載體混合，接著加入 1 l ligation buffer A、1 l ligation buffer B 以及 1 l 的 T4 DNA ligase 和 1 l 的 ddH2O，混合均勻後放置於室溫 2 小時或 4 ℃隔夜反應。

3-3-4 大腸桿菌 JM109 之轉形 (Transformation)

 勝任細胞 (competent E.coli JM109) 之製備：

以接菌環在 JM109 培養皿中挑一單一菌落，養於 5 ml 的 LB 培養基中，隔夜培養於 37 ℃、200 rpm 之迴轉式振盪培養箱。取 500 l 的隔夜菌液接種至 50 ml 的 LB 培養基中繼續培養，直到菌液濃度 OD550達到 0.6 ~ 0.8。將錐形瓶置於冰上 5 分鐘，然後將菌液轉移至 50 ml 的無菌離心管中，以 2800 rpm、4 ℃離心 5 分鐘。小心去除上清液，再將菌塊復溶於 20 ml 的 TfbⅠ，置於冰上 5 分鐘 (TfbⅠ須先置放於 4℃冰箱中) ，再以 2800 rpm、4 ℃離心 5 分鐘。小心去除上清液，再將菌塊復溶於 3 ml 的 TfbⅡ，置於冰上 5 分鐘 (TfbⅡ亦須先置放於 4 ℃冰箱中) 。稍微混合均勻後，接著每 100 l 分裝於 1.5 ml 微量離心管，置入液態氮中快速冷卻，之後長期儲存於-80 ℃。

 大腸桿菌 JM109 之轉形：

將 5 l 的接合反應產物和 50 l 的勝任細胞 (JM109) 混合於 1.5 ml 的無菌微量離心管，置於冰上 30 分鐘。將離心管由冰上移出並迅速置放於 42 ℃的水浴槽中 90 秒，接著快速將離心管移回冰上靜置 5 分鐘。然後將離心管中的菌液培養於 800

l 的 LB 培養基中，以 37

℃、200 rpm 震盪培養 1 小時。濃縮成 100

l~150 l 的菌液塗佈於

LB/Ampicillin 培養皿。之後將培養皿反置於 37 ℃的迴轉式振盪培養

箱中 15~17 個小時，待菌落生成之後便可用石臘封膜 (parafilm) 密封培養皿並保存於 4 ℃冰箱。

3-3-5 質體 DNA 之微量製備 (miniprep)

本實驗利用波士特公司 “Gene-Spin^TM -V²” miniprep kit 製備質體 DNA。首先從轉形後之 JM109 培養皿上挑一株單一菌落養於 3 ml 的 LB 培養基中，並加入適量的抗生素 (Ampicillin 50μg/ml) ，隔夜培養於轉速 200 rpm、37 ℃的迴轉式振盪培養箱。將 1.5 ml 的菌液加到 1.5 ml 微量離心管中，13,000 rpm 離心 1 分鐘，小心移除上清液之後再加入 1.5 ml 的菌液重複離心一次。之後加入冷藏之 200

l

“SolutionⅠ” 反覆震盪復溶菌塊。接著加入 200

l 的 “Solution

Ⅱ” ，輕微翻轉離心管 5 次，靜置 1 分鐘。再加入 200 l 的 “Solution

Ⅲ” ，同樣輕微翻轉 5 次混合均勻，以 13,000 rpm 離心 5 分鐘，之後將澄清的 lysate 轉移到置於 collection tube 上的 spin column 中，13,000 rpm 離心 30 秒，倒去 collection tube 中的濾液。加入 700 l 的 washing solution 並以 13,000 rpm 離心 1 分鐘，同樣倒去 collection tube 中的濾液後再次 13,000 rpm 離心 3 分鐘，用以去除多餘乙醇。將 spin column 轉移到另一新的微量離心管上，加入 50 l 二次水置於室溫 1 分鐘復溶 DNA，最後以 13,000 rpm 離心 1 分鐘沖提出質體 DNA，並儲存於 -20 ℃。

3-4 pQE30 載體構築

3-4-1 質體 hCGB-yT&A 之限制酶切割 (Digestion)

構築好之質體 hCGB-yT&A 先經由洋菜膠電泳觀察片段大小是 否正確，之後 hCGB-yT&A 則利用 BamH

Ⅰ

和 Hind

Ⅲ

限制酶進行截

切，使其成為 hCGB 和 yT&A 兩段 DNA，反應藥品如表 6 所述，以

Restriction enzyme BamH

Ⅰ

₁ Restriction enzyme Hind

Ⅲ

₁

ddH2O 2

Restriction enzyme BamH

Ⅰ

₁ Restriction enzyme Hind

Ⅲ

₁

ddH2O 2

Total volume 10

表 5. pQE-30 之切割反應材料

3-4-3 與表現載體 pQE-30 進行接合反應 (Ligation)

切割完之 hCGB、hCG’β、和 pQE-30 經由洋菜膠體電泳分離和純 化之後，即可進行接合反應。類似前面所提 yT&A 之接合，取 7

l

純化後的 BamH

Ⅰ

-hCGB-Hind

Ⅲ

與 1

l 的 BamH Ⅰ

-pQE-30-Hind

Ⅲ

混合，接著兩者分別加入 1

l ligase 10× buffer 以及 1 l 的 T4 DNA

ligase，混合均勻後放置於 4 ℃隔夜反應；而 hCG’β 條件與 hCGB 相 同。

3-4-4 大腸桿菌 M15[pREP4]之轉形 (Transformation)

與前述 JM109 之轉形相同，hCGB-pQE-30 和 hLHB-pQE-30 轉形 至 M15[pREP4]，培養於 LB/Kanamycin/Ampicllin 培養基，保存於 4 ℃ 冰箱。

3-4-5 選殖鑑定及 DNA 定序 (DNA sequencing)

上述轉形完帶有表現載體的菌株抽取其微量質體 DNA，利用限 制酶 BamH

Ⅰ

和 Hind

Ⅲ

切割，之後經由洋菜膠體電泳觀察正反接合情形，選取片段大小正確無誤之單一菌落分別送至生工有限公司和源資國際生物科技股份有限公司進行 DNA 定序進一步確定 insert DNA 序列。

3-5 去醣基 hCGβ-及 hCG’β-次單元體之表現[78]及純化

此時轉殖菌類型，如下表 8 所示。

菌株類型抗藥性

(antibiotic resistance) 1.hCGB-pQE-30 [M15 (pREP4)] Kanamycin/Ampicillin 2. hCG’β-pQE-30 [M15 (pREP4)] Kanamycin/Ampicillin

表 6. 轉形後之菌株類型

3-5-1 去醣基 hCGβ-和 hCG’β-次單元體次單元體之小量表現 (small-scale expression)

從上述菌株培養皿中挑單一菌落培養於 5 ml 含有適當抗生素的 LB 培養基中 (LB/Kanamycin 濃度：25 μg/ml、LB/Ampicillin 濃度：

50μg/ml) ，隔夜培養於 37 ℃、200 rpm。取 50

l 的隔夜菌液接種

200~500 l 的 bacterial lysis buffer (視菌塊大小決定適量 buffer) ，快速震盪再懸浮菌塊。待溶液澄清後，取 10 l bacterial lysate 加入 10l 1× SDS gel-loading buffer，之後以 15 % SDS-PAGE 分析蛋白質表現並以西方墨點法進一步確認。

3-5-2 SDS-PAGE

 SDS-polyacrylamide gel 之製備：

a. 4 ml 15 % Resolving-gel solution

b. 3 ml 5 % Stacking-gel solution

表 7. SDS-polyacrylamide gel 之藥品配方：a. 15 % resolving-gel solution；b. 5 % stacking-gel solution

材料體積 (ml)

ddH2O 0.88

30 % Acrylamide mixture 2 1.5 M Tris (pH 8.8) 1.04

10 % SDS 0.04

TEMED 0.0016

10 % APS 0.04

材料體積 (ml)

ddH2O 2.1

30 % Acrylamide mix 0.5 1 M Tris (pH 6.8) 0.38

10 % SDS 0.03

TEMED 0.003

10 % APS 0.03

此 SDS-PAGE 實驗使用 BIO-RAD 迷你垂直電泳槽系統。首先將兩玻璃片依造操作手冊組裝起來，注入 3.5 ml 的 resolving-gel solution 於玻璃間的溝槽，再以 300 l 的異丙醇覆蓋其上使之水平凝固，靜置 30 分鐘待其凝結完全。倒去覆蓋的異丙醇並側立等待其完全蒸發。

注入適當體積的 stacking-gel solution 於凝結完全的 resolving gel 上，

立即將 Teflon comb 斜插入 stacking-gel solution，小心避免產生氣泡。

靜置 5~10 分鐘，待其凝結後小心移開 comb，然後立即以二次水清洗以去除殘留未凝結的丙烯醯胺 (acrylamide)。

 樣品之電泳：

將凝結完全的 SDS-polyacrylamide gel 連同玻璃架設於電泳槽上，小心倒入 Tris-glycine electrophoresis buffe，並去除藏匿於 gel 下方的氣泡。將樣品與 1× SDS gel-loading buffer 混合後，以 96 ℃沸水

小心切下 stacking gel，並將 resolving gel 浸泡於 Coomassie Blue 染色液中 30 分鐘，之後回收染色液，並將丙烯醯胺膠以二次水清洗 2 次。然後將丙烯醯胺膠浸泡於 destain solution Ⅰ，並置放於緩慢擺動的水平迴轉式震盪器 30 分鐘。倒去 destain solution Ⅰ，再將丙烯醯胺膠浸泡於 destain solution Ⅱ，並置放於緩慢擺動的水平迴轉式震盪器至隔夜，直到完全去除背景。待退染完成後，將丙烯醯胺膠浸泡於二次水中，之後以玻璃紙密封起來長期儲存。

3-5-3 西方墨點法

 蛋白質轉漬 (protein transfer)：

剪下一塊與膠體相同大小的 polyvinylidene difluoride (PVDF) 轉漬膜。將剪下的轉漬膜以甲醇潤溼 3 秒，然後浸泡於二次水 1 分鐘，

最後置放於 transfer buffer 中。將 2 片 Whatman 3MM paper 及多孔性襯墊 (Porous pad) 浸泡於 transfer buffer 中。當 SDS-PAGE 完成後，

將 resolving gel 以二次水清洗，然後同樣浸泡於 transfer buffer 中。之後按照圖 11 將 transfer cassette 組合起來 (本實驗使用 BIO-RAD 濕式電泳膠轉漬器) ，組合期間需不時以 transfer buffer 潤溼並避免氣泡產生，注意不可讓 PVDF 轉漬膜乾掉。組合好 cassette 連同冰寶一起放入 transfer apparatus 中並注滿 transfer buffer，打開電源供應器，在 4 ℃ 中以 40 mA 電流轉漬 40 分鐘。最後關掉電源供應器並取出 transfer cassette，取出其中的 PVDF 轉漬膜，進行接下來之 blocking。

圖 13. Transfer cassette --- 負極(黑色)

 墨點 (blotting)：

 ECL 免疫偵測 (immunodetection)：

整個壓片過程皆於暗房中避光操作。首先將等體積 (1:1) 的 Western lighting^TM “Ennanced luminal reagent” 和“Oxidizing reagent”

(PerkinElmer Life Sciences, lnc.) 混合均勻，並將轉漬膜浸泡於 ECL

並移入 “GBX fixer and replenisher” 溶液中，直到完全定影，再以清水清洗並晾乾底片。

3-5-4 決定去醣基 hCG β-及 hCG’β-次單元體之溶解性 (soluble form

或 inclusion body)

如同前面所提之蛋白質小量表現，當菌液 OD600 達 0.6 之後加入 1 mM IPTG 誘導培養 6 小時。在 4 ℃下，以 13,000 rpm 離心 5 分鐘，

在文檔中去醣基人類絨毛膜促性腺β次單元體之菌體表現 (頁 37-54)