結果與討論

4-1 放大 hCGB 和 hCG’B

我們欲表現去醣基 hCGB 和 hCG’B 的首要工作便是放大 hCGB 和 hCG’B 此兩段基因，因此本論文利用聚合酶連鎖反應 (PCR) 作為 選殖並放大此兩段 cDNA 作為整個架構之啟始。Commercial “Human Placenta Marathon-Ready cDNA” 作為選殖 hCG 次單元體基因的模 版，至於引子設計則以核苷酸資料庫搜尋出 hCG β-

和

基因。在這裡需要特別注意的是 PCR 反應時 annealing 的溫度，因為 內。本論文一開始就選擇大腸桿菌 M15[pREP4] 作為 hCGβ-pQE30 和 hCG’ β- pQE30 兩質體之表現宿主[78]。

因本論文利用 BamH

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Ⅲ

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Ⅲ

之用，期望截切完之產物可呈現出 hCGβ 與 pQE30 兩段 DNA。同理，

演化而來[59-61]。因此，我們希望能得到 hLH 序列長度的 hCG 基因。

比對 hCG’β 和 hCGβ 基因，我們發現序列 5 及 350 的位子有點突變，

序列 5 突變產生的結果為其對應之胺基酸密碼子從 AAG code 變為 AGG code，經由胺基酸對照之結果發現 AAG 為 Lysine(Lys 離胺酸)，

但 AGG 卻為 Arginine(Arg 精胺酸)。而序列 350 突變產生的結果為其 證明確實為 hCGβ-pQE30 和突變基因 hCG’β-pQE30。

4-4 去醣基 hCGβ-和 hCG’β-次單元體之表現

為了觀察是否確實表現出 hCGβ-和 hCG’β-次單元體之存在，先 以大腸桿菌小量表現此兩次單元體。所謂小量表現蛋白質之含意為培 養 5 ml 之菌液加以 IPTG 誘導之，本論文在去醣基 hCGβ-和 hCG’β-次 單 元 體 方 面 分 別 先 以 0.5 mM 和 1 mM 的 IPTG 濃 度 處 理 hCGβ-pQE30-M15[pREP4] 和 hCG’β-pQE30-M15[pREP4] 來 進 行 測 詴，於 37 ℃、200 rpm 下分別培養 4 小時、6 小時和 8 小時來觀察。

由圖 20 和 21 我們發現。兩種濃度的 IPTG 蛋白質表現量沒有明顯的 差別。關於培育的時間方面也僅有 hCG’β-pQE30-M15[pREP4]在 4 小 時之蛋白質表現量較差；6 小時和 8 小時的表現量就比較接近。因此 我們取 1 mM 的 IPTG 誘導 6 小時，之後將菌體用 Bacterial lysis buffer

復溶，再用超音波打破細胞後，分為兩部分：水溶性之上清液和包涵

圖 23 則顯現另一個結果，假若不使用一般的 Bacterial lysis buffer 改用 Lysis Buffer B(含有 8M 的尿素)，我們發現在 lysate pellet 中幾乎

設的 hCG’β-次單元體之微量存在，且其位於 13 kDa 左右之位置。 表現量[79]。而 QIAGEN 公司 QIAexpression Syatem 提供的實驗手冊 也提到在某些例子的 cDNA 序列 5’端確實會形成 “Stem-loop” 而干 擾到轉譯過程，建議之改善方式為如果必要的話需重新修飾過 DNA 序列或者修飾培養基、誘導條件或改用不同的大腸桿菌表現宿主。在

考慮到不重新修改 hCGβ-和 hCG’β-次單元體 cDNA 序列的前提下， 抗生素 Ampicillin 和 Kanamycin，挑一顆菌落於培養液中，用 1mM IPTG 於 37 ℃、200 rpm 下培養 6 小時，之後將菌體用 Bacterial lysis buffer 復溶，再用超音波打破細胞，後分為兩部分：水溶性之上清液 和包涵體 (inclusion body) 之沈澱再懸浮部分。上清液保存於-20℃冰 箱中，包涵體(inclusion body) 加入 4ml Lysis Buffer B，於室溫下攪拌 一小時，先取 2ml 直接離心，上清液進行 SDS-PAGE 檢驗，見圖 27、

28 (B)；另外的 2ml 用超音波振 3 min (打 2 sec、休 1 sec) ，離心取上 清液進行 SDS-PAGE 檢驗，見圖 27、28 (A)。純化方法 B：同樣以 50ml LB 培養液加入適量的抗生素 Ampicillin 和 Kanamycin，挑一顆 菌落於培養液中，用 1mM IPTG 於 37 ℃、200 rpm 下培養 6 小時，

之後將菌體用 4ml Lysis Buffer B 復溶，於室溫下攪拌一小時，先取 2ml 直接離心，上清液進行 SDS-PAGE 檢驗，見圖 29、30 (A)；另外 的 2ml 用超音波振 3 min (打 2 sec、休 1 sec) ，離心取上清液進行 SDS-PAGE 檢驗，見圖 29、30 (B)。綜合上述所進行的實驗，我們可 以發現以下的結論。第一點：無論是否有用 Bacterial lysis buffer 進行 預處理，效果都不明顯。第二點：因為 Lysis Buffer B 本身即可打破 細胞，此法為化學破細胞法，因此使用 Lysis Buffer B 時，有沒有再 用超音波振，其結果也是一樣地。第三點：使用 Ni-NTA 純化蛋白質

時，應注意濃縮的倍數，雖然 QIAGEN 公司手冊上說最好濃縮 50~100 倍，但假若本身蛋白質表現量不佳的情況下，在復溶時最好可以儘可 能地少用溶劑。第四點：初步放大到 50ml 的培養液去培養，我們發 現表現的蛋白質還是不明顯，因此我們繼續放大到 150ml 培養，且使 用 150：1 的濃縮倍率，發現效果稍微好些，如圖 31 所示。所以我們 可以判定在做蛋白質純化時，預先處理其影響純化的效果不大，濃縮 倍率的影響會較大一些。

含有 6xHis tag 的 hCGβ-和 hCG’β-次單元體能在低 pH 值值被沖 提出來，這個原理主要是依據 6xHis tag 上的 histidine residue 的 pKa 大約是在 6.0。當 pH 下降(pH 4.5~5.3)，會變成 protonated。在這樣的 條件下，hCGβ-和 hCG’β-次單元體便無法和 nickel ion 繼續鍵結，因 此便可從 Ni-NTA resin 上解離(dissociate)下來。更進一步地分析 Ni-NTA 純化結果，發現僅與蛋白質的量有關，目標蛋白越多，可被 nickel ion 抓到的更多，此一部份可以從圖 32 中看出，圖 32 為 hCG’β-次單元體蛋白經 Ni-NTA 純化結果，所有的條件都相同，只有其培養 液放大到 500ml 培養。以一個競爭反應而言，目標蛋白越多，其他雜 的蛋白就比較不容易附著在 nickel ion 內，如此在流洗的時候就很容 易被沖提出來，而在更低的 pH 值時，就可以得到高純度的目標蛋白。