本研究將實驗分成兩大部分，第一部分是檢測 Paclitaxel 對人類肝癌細胞 株(HA 22 T/VGH)生長的影響，包括檢測此藥物對人類肝癌細胞株的細胞毒性 (cytotoxicity)、細胞週期及 cyclins 的影響。第二部分包括 1.在整個活細胞方 面，我們檢測 Paclitaxel 對人類肝癌細胞株(HA 22 T/VGH) NAT 活性，基因序 列、對(HA 22 T/VGH)細胞內 NAT 蛋白表現的影響。2.在細胞質液方面：我們 檢測 Paclitaxel 對人類肝癌細胞株(HA 22 T/VGH)細胞質液中 NAT 活性的影 響。而本實驗所用藥物 Paclitaxel 以 100% DMSO 當溶劑，製備了 5 µM, 50 µM, 500 µM, 2.5 mM, 5 mM 五種同濃度。
一、 檢測Paclitaxel 對人類肝癌細胞株生長方面的影響
1.檢測 Paclitaxel 對人類肝癌細胞株(HA 22 T/VGH)細胞毒性(cytotoxicity) 的影響
rpm，5 分鐘，4℃後，倒掉上清液並輕拍管壁再加入 5ml PBS，使細 胞懸浮在 PBS 中，再離心 1500 rpm，5 分鐘，4℃後，倒掉上清液留 下 100-200μl PBS 並輕拍管壁，使細胞懸浮在 PBS 中，加入 500 ml 4 μg / ml 之 Propidium iodine (PI)，再以流式細胞儀(Flow cytometry)分 析存活細胞數。 胞計數儀(Flow cytometry；FACS)分析 G0/G1、S、G2 & M 期 DNA 含 量。
sodium citrate 100 µL 並置於冰上 45 分鐘，再以含 0.1% BSA 的 PBS 清 胞內 poly (ADP-ribose) polymerase 的影響
當 細 胞 DNA 受 損 時 ， 細 胞 會 產 生 poly (ADP-ribose) polymerase(PARP)來作為修補之用。準備二個 6 well 培養皿，將人類肝 癌細胞株(HA 22 T/VGH)細胞植入培養，每一 well 培養 1×106細胞，並
PBS 中，再離心 1500 rpm，5 分鐘，4℃後，倒掉上清液留下 100-200 ADP-ribose 的單株抗體(monoclonal antibody to poly ADP-ribose)之 5%
脫脂牛奶 PBS 溶液，並在 4℃下反應隔夜，以 PBS 洗細胞， 離心 1500 rpm， 4 分 鐘 ， 4℃，倒掉上清液再加入 50μ l 之 1% 二次抗體 (FITC-conjugated goat anti-mouse IgG antibody)，避光反應 30 分鐘後，
以 PBS 洗細胞並以螢光顯微鏡觀察並照相。 24 well plate (含 1 mL RPMI 1640 培養基，1% glutamine，10%胎牛血清)
中，再加入 arylamin 受質(2-AF)及分別有無加入不同濃度的 Paclitaxel 試劑(5 µM, 50 µM, 500 µM, 2.5 mM, 5 mM)，一起在 37℃，95%空氣，
5%二氧化碳，經過不同的時間(分別為 6，12，24，48 小時)反應終結，
將細胞及培養基移取離心。上清液立即以 ethylacetate / methanol (95:5) 萃取，此溶液冷凍揮發乾燥後，再溶於 50μL methanol 中混合均勻，
取 20μL 打入高效液相層析儀，再經由 HPLC 分析乙醯化受質(2-AAF) 和未乙醯化受質(2-AF)的量。
2. 檢測 Paclitaxel 對人類肝癌細胞株(HA 22 T/VGH)細胞內 NAT 基因的影 響
(1) 反轉錄酵素(Reverse Transcriptase)反應
取 5×106細胞置於培養皿中，再移入 37℃ 5% CO2培養箱，加 入不同濃度藥物後，經 24 小時培養後將細胞收集離心，以 RNA kit 抽出細胞全部 RNA 並於 260 nm 下測 OD 值(假設 OD 值=1 時，
RNA=40 ng/μL)，再每管各取 1.5μg 的 RNase 並加入 RNA free water 使體積達 11.5μL，再各加入 1μL (0.5μg/μL) oligo (dT)且 置於 70℃反應 10 分鐘後快速置於冰上且 spin down，再各加入 7.5 μl 的反應溶液(2μL 100 mM DDT + 1μL dNTP + 0.5μL RT+ 4μ L 5X buffer)且靜置 42℃下 1 小時。
(2) 聚合酵素連鎖反應(Polymerase Chain Reaction)
接著取 1 μL cDNA 加入 24 μL 反應溶液(19.05 μL dd H2O + 2.5 μL 10X buffer + 0.75μL MgCl2 + 0.5μL dNTP + 0.5μL Primer 1 + 0.5μL Primer 2 + 0.2μL Taq DNA polymerase)，經混合 及 spin down 後放入 94℃ 3 分，再進行 35 個循環期：94℃ 45 秒，
55℃ 30 秒，72℃ 1 分 30 秒，結束後放置於 72℃ 10 分鐘後再置 於 4℃，加入 loading DNA dye 5μL 且混合及 spin down 後，跑 1.5%
agarose 電泳膠，以 ethedium bromide 染色後照相。所使用的 Primer 如(表 2)。
表 2. Primers used for RT-PCR
primer Sequence: (5’ –3’) Size
(bp)
Act-b1 5’-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3’ 21
Act-b2 5’-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3’ 25
B-MDIEA-NAT1 5’- CACCCGGATCCCGGGATCATGGACATTGAAGC-3’ 31
VPKHGD-X-NAT1 5’-GGTCCTCGAGTCAATCACCATGTTTGGGCAC-3’ 31
FP1-NAT2 5’-CTAGTTCCTGGTTGCTGGCC-3’ 20
RP1-NAT2 5’-TAACGTGAGGGTAGAGAGGA-3’ 20
3. 檢測 Paclitaxel 對人類肝癌細胞株(HA 22 T/VGH)細胞內 NAT 蛋白表現 的影響
取 1×106細胞放入培養皿中，再移入 37℃ 5% CO2培養箱，加入 不同濃度 Paclitaxel，經 24 小時培養後收集離心，以福馬林及甲醇固 定細胞，再以 Triton X-100 及 sodium citrate 增加細胞膜滲透性，再加 入本實驗室自製的對抗人類 NAT 多株抗體(polyclonal anti-human NAT antibody)，再加入接有螢光的二次抗體，最後放入 FACS 分析。
4. 檢測人類肝癌細胞株(HA 22 T/VGH)在加入不同濃度 Paclitaxel 後暴露 於細胞外的 NAT 活性
取 1×105細胞置於培養皿中，再移入 37℃ 5% CO2培養箱。反應混 合液組成總共體積 90μL：包括取 50μL 的(HA 22 T/VGH) 胞質液，
加入 20μL 的 Acetyl-coenzyme A recycling mixture [(50 mM Tris-HCL，
PH7.5)，0.2 mM EDTA，2 mM DTT，15 mM acetyl carnitine，2 U/mL carnitine acetyltransferase]，以一定量的 AF 或 PABA 當受質，最後加了 20μL 的 Acetyl-Co A 及 10μL 不同濃度的 Paclitaxel (5µM, 50µM, 500µM, 2.5mM, 5mM)。控制組不加 Acetyl-Co A，而加入蒸餾水。培育 於 37℃，10 分鐘，再加入 100μL acetonitrile 終止 2-AF 或 PABA 反應。
實驗組及控制組均作 3 次，再經由 HPLC 分析，得出 Paclitaxel 對人類 肝癌細胞胞質液中不同濃度的 Paclitaxel 對 NAT 活性測定。加入不同濃
度 Paclitaxel 後，經 24 小時培養，各取 60μL 上清液並各加入 20μL RCM 及 Acetyl CoA，混合後置於 37℃恆溫水槽反應 10 分鐘，再加入 50μL Acetonitrile，混合並離心後吸取 20μL 上清液打入 HPLC 分析。
為維持 NAT 活性，實驗必需在冰上操作。