for Biotechnology Information，NCBI database )。
與登革熱病毒外膜蛋白比較，在 domain I 與 domain II 之間的區域沒有很高 的相似度 ( 附圖七，附圖八 )。
1.7 四環黴素衍生物
四環黴素衍生物四環黴素衍生物四環黴素衍生物( tetracycline derivatives ) 性質
性質性質性質四環黴素衍生物為一類同樣以四環結構為基礎的廣效型 ( broad-spectrum ) 抗 生素。第一個被發現的為 chlortetracycline，於 1994 年被分離出來，之後其 他四環黴素衍生物陸續被發現，包括 1950 年的 oxytetracycline，1953 年的 tetracycline，以及半合成的 doxycycline 及 minocycloine。四環黴素衍生物藉 由與細菌體內 30S 核醣體上的 A-site 結合，使新的胺基酸單體無法加到胜肽 鏈上干擾細菌蛋白質合成而達到抑菌的效果，主要用於對抗多種革蘭氏陰性及 陽性菌、厭氧菌、立克次氏體及黴漿菌……等等 ( Andre, 2005 )。本實驗中使 用的四環黴素衍生物主要為 tetracycline、chlortetracycline、doxycycline 及 rolitetracycline，其在人體的使用濃度如附表三。
1.8 實驗設計與目的
實驗設計與目的實驗設計與目的實驗設計與目的根據實驗室之前與楊進木老師合作，以生物資訊 Virtual screening 的方式針對 登革熱病毒的外膜蛋白上疏水性口袋在 Comprehensive Medicinal Chemistry 資料庫進行藥物篩選。篩選得到的前 200 個藥物名單中，包含了兩個四環黴 素衍生物 tetracycline 及 rolitetracycline，因為四環黴素衍生物都具有四個環 的基本結構，只是在支鏈上做修飾產生其他衍生物，推測四環結構可能為與疏 水性口袋結合的條件之一。
實驗室前人 ( 張，2009；杜，2007 ) 研究發現，四種四環黴素衍生物
貳 C6/36 ( 白線斑蚊細胞，Aedes albopictus larva cell )
293T ( 人類胚胎腎臟細胞，human embryonic kidney cell )
2.2 病毒
病毒病毒病毒Dengue virus type 2 PL046 strain ( Taiwan local strain，lab collection )
Japanese encephalitis virus RP9 strain ( gift from Dr. RY. Chang’s laboratory，
NDHU )
Chlortetracycline Sigma C-4881 病毒抑制試驗 Crystal Violet Sigma C-3886 空斑試驗
DMSO Sigma D-8418 細胞保存
Doxycycline Sigma D-9891 病毒抑制試驗
Fetal Bovine Serum Biological industries
04-001-1A 細胞培養
Formaldehyde Riedel-de Haën 33220 固定細胞 Kanamycin Sigma K4000 病毒抑制試驗 MEM GIBCO 41500-034 細胞培養 Methylcellulose Sigma M0512 空斑試驗 NaHCO3 Sigma S-5761 細胞培養 PBS Biological
Industries
11-223-1K 細胞培養
Rolitetracycline Sigma R-2253 病毒抑制試驗 Tetracycline Sigma T-7660 病毒抑制試驗 TrypLETM Express GIBCO 12605-010 細胞培養
2.4 溶劑
溶劑溶劑、溶劑、、、緩衝溶液配方緩衝溶液配方緩衝溶液配方緩衝溶液配方1 % crystal violet solution ( 500 ml ) 5 g crystal violet
50 ml 37 % formaldehyde 450 ml H2O
3.7 % formaldehyde
100 ml 37 % formaldehyde 900 ml ddH2O
2.5 培養液
培養液培養液培養液1X MEM
MEM powder ( GIBCO，41500-034 ) 2.2 g NaHCO3
ddH2O to 1000 ml
2X MEM
MEM powder ( GIBCO，41500-034 ) 2.2 g NaHCO3
ddH2O to 500 ml
10 % FBS / MEM
50 ml fetal bovine serum 450 ml 1X MEM
5 % FBS / MEM
25 ml fetal bovine serum 475 ml 1X MEM
1.1 % methylcellulose medium 5.5 g methylcellulose
250 ml ddH2O 250 ml 2X MEM
2.6 儀器設備
儀器設備儀器設備儀器設備-20℃直立冷凍櫃 ( WHITE-WESTINGHOUSE )
開蓋式 -20℃冷凍櫃 311-407-00 ( CARAVELL )
液態氮容器 ( TAYLOR-WHARTON ) 數位相機 C-5050Z ( OLYMPUS )
参
培養液為含有 5 % FBS ( Fetal Bovine Serum；Biological Industry，Cat.
04-001-1A) 的 MEM (Minimum Essential Medium；GIBCO，Cat.41500-034)，
培養環境為含有 5 % CO2 的 37 ℃恆溫培養箱。繼代培養程序如下：吸除 培養液，以 PBS (Phosphate Buffer Saline；biological industry，Cat. 11-223-1K）
沖洗一次，加入 1 ml 的 TrypLETM Express （GIBCO， Cat. 12605-010）於 37
培養箱繼續培養。
3.1.3 293T 細胞繼代培養
細胞繼代培養細胞繼代培養細胞繼代培養培養液為含有 10 % FBS 的 MEM，培養環境為含有 5 % CO2 的 37℃ 恆 溫培養箱。繼代培養程序如下：吸除培養液，以 PBS 沖洗一次，加入 1 ml 的 TrypLETM Express，於 37 ℃、5 % CO2 培養箱中反應 3 分鐘，加入約 3 ml 培養液與 TrypLETM Express 混合後輕沖培養皿底盤使細胞脫落並均勻 散佈於培養液中，留下 1 / 3 體積的細胞液，補入 10 ml 培養液混合均勻，置 於培養箱繼續培養。
3.2 病毒增殖
病毒增殖病毒增殖病毒增殖3.2.1 登革熱病毒增殖
登革熱病毒增殖登革熱病毒增殖登革熱病毒增殖利用白線斑蚊細胞 ( C6/36 ) 增殖登革熱病毒 PL046 strain。將 1 x 107 的 C6/36 細胞置於 15 ml 離心管中，以 1500 rpm 離心 5 分鐘（centrifuge 5804R），去除上清液，加入適量 10 % FBS / MEM 培養液重新混勻細胞後，
加入 1 x 106 病毒 ( 病毒液與培養液的總體積為 2 ml ），即 MOI = 0.1，置 於 37 ℃，5 % CO2 培養箱中培養 2 小時，培養過程中每 20 分鐘搖一次。
將病毒與細胞混合液移入 T75 培養盤中，補入 9 ml 的 10 % FBS / MEM
培養液後，置於 28 ℃ 培養箱中，於感染後四至十二天收集含有病毒之上 清液，以 0.22 µm 孔徑的過濾膜將細胞殘渣過濾掉，最後將過濾後的病毒 液分裝到 1.5 ml 的微量離心管中，保存於 -80 ℃冰箱中。
3.2.2 日本腦炎病毒增殖
日本腦炎病毒增殖日本腦炎病毒增殖日本腦炎病毒增殖利用白線斑蚊細胞 ( C6/36 ) 增殖日本腦炎病毒 RP9 strain。將 1 x 107 的 C6/36 細胞置於 15 ml 離心管中，以 1500 rpm 離心 5 分鐘（centrifuge 5804R），去除上清液，加入適量 10 % FBS / MEM 培養液重新混勻細胞後，
加入 1 x 106 病毒 ( 病毒液與培養液的總體積為 2 ml ），即 MOI = 0.1，置 於 37 ℃，5 % CO2 培養箱中培養 2 小時，培養過程中每 20 分鐘搖一次。
將病毒與細胞混合液移入 T75 培養盤中，補入 9 ml 的 10 % FBS / MEM 培養液後，置於 28 ℃ 培養箱中，於感染後四至十二天收集含有病毒之上 清液，以 0.22 µm 孔徑的過濾膜將細胞殘渣過濾掉，最後將過濾後的病毒 液分裝到 1.5 ml 的微量離心管中，保存於 -80 ℃冰箱中。
3.3 病毒抑制試驗
病毒抑制試驗病毒抑制試驗病毒抑制試驗3.3.1 C6/36 細胞
細胞細胞之細胞之之之病毒抑制試驗病毒抑制試驗病毒抑制試驗病毒抑制試驗( 登革熱病毒
登革熱病毒登革熱病毒登革熱病毒)
於實驗前一天在六孔培養盤中置入 2 x 105 的 C6/36 細胞，隔天使用未含血
清之 MEM 培養液將預測試之藥物序列稀釋到不同濃度及將病毒稀釋到每 450 µl 培養液中含有 200 PFU 的病毒，將 450 µl 的藥物與 450 µl 的病毒 混合。以未含血清的 MEM 培養液清洗細胞一次，加入 900 µl 的藥物與病 毒混合液，前後左右搖晃一下，置入 28 ℃，5 % CO2 培養箱中培養 1 小 時後，吸除細胞上之藥物與病毒混合液，加入 5 ml 含有 10 % FBS 之 MEM 培養液，置於 28 ℃，5 % CO2 培養箱中培養 48 小時後，收取細胞的上清 液進行空斑試驗。
3.3.2 293T 細胞
細胞細胞之細胞之之之病毒抑制試驗病毒抑制試驗病毒抑制試驗病毒抑制試驗( 登革熱病毒
登革熱病毒登革熱病毒登革熱病毒)
於實驗前一天在六孔培養盤中置入 2 x 105 的 293T 細胞，隔天使用未含血 清之 MEM 培養液將預測試之藥物序列稀釋到不同濃度及將病毒稀釋到每 450 µl 培養液中含有 200 PFU 的病毒，將 450µl 的藥物與 450 µl 的病毒 混合。以未含血清的 MEM 培養液清洗細胞一次，加入 900 µl 的藥物與病 毒混合液，前後左右搖晃一下，置入 37 ℃，5 % CO2 培養箱中培養 1 小 時後，吸除細胞上之藥物與病毒混合液，加入 5 ml 含有 10 % FBS 之 MEM 培養液，置於 37 ℃，5 % CO2 培養箱中培養 48 小時後，收取細胞的上清 液進行空斑試驗。
3.3.3 293T 細胞
細胞細胞之細胞之之之病毒抑制試驗病毒抑制試驗病毒抑制試驗病毒抑制試驗( 日本腦炎病毒
日本腦炎病毒日本腦炎病毒日本腦炎病毒)
細胞，室溫靜置 20 分鐘，吸除甲醛後加入適量的 1 % 結晶紫溶液，室溫 靜置隔夜後，以流水沖洗培養盤，於室溫風乾後，計數空斑數目。
3.4.2 日本腦炎病毒空斑試驗
日本腦炎病毒空斑試驗日本腦炎病毒空斑試驗日本腦炎病毒空斑試驗實驗前一天先於六孔培養盤中置入 2 x 105 的 BHK-21 細胞。病毒以未含血 清的 MEM 培養液進行序列稀釋。感染前先以未含血清的 MEM 培養液沖 洗細胞一次，並在細胞上加入 800 µl 未含血清的 MEM 培養液，加入 200 µl 序列稀釋後的病毒液後，置於 37 ℃、5 % CO2 培養箱中培養 1 小時，培 養過程中每 20 分鐘搖一次。 1 小時候，加入 4 ml 的 1.1 % methyl cellulose medium，置入 37 ℃、5 % CO2 培養箱中培養約四至五天。取出細 胞後，吸除培養液，加入適量 3.7 % 甲醛固定細胞，室溫靜置 20 分鐘，
吸除甲醛後加入適量的 1 % 結晶紫溶液，室溫靜置隔夜，以流水沖洗培養 盤，於室溫風乾後，計數空斑數目。
肆
重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個藥物濃度培養皿
隨著藥物濃度增加，所得到之病毒效價有降低的趨勢。IC50 約為 29.48 µM
度皆有三組重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個藥物
100 µM 時為 36.68 %，150 µM 時為 36.20 %，顯示藥物濃度在 25 µM 之 後，隨著藥物濃度增加，所得到之病毒效價有降低的趨勢。IC50 約為 63.33 µM ( 表一，圖十一 )。藥物濃度在 177.53 µM 以上時細胞死亡率大於 20 %，
對細胞有傷害性 ( 表二，圖十二 )。
4.2.2 Chlortetracycline
最終藥物濃度為 0 µM、5 µM、15 µM、25 µM、50 µM、100 µM。每一個藥 物濃度皆有三組重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個 藥物濃度培養皿上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，相除並乘 以百分之百，計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之三次重複 所得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再將此三組 病毒效價百分比取平均值得到在 5 µM 時為 70.15 %，15 µM 時為 25.70 %，
25 µM 時為 5.41 %，50 µM 時為 0.0 %，100 µM 時為 0.0 %，顯示藥物濃 度在 5 µM 之後，隨著藥物濃度增加，所得到之病毒效價有降低的趨勢。IC50
約為 9.54 µM ( 表一，圖十三 )。藥物濃度在 200.20 µM 以下，計數細胞 沒有明顯的減少 ( 表二，圖十四 )。
4.2.3 Doxycycline
得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再將此三組病
4.3 偵測藥物在
偵測藥物在偵測藥物在偵測藥物在293T 細胞中對日本腦炎病毒之影響
細胞中對日本腦炎病毒之影響細胞中對日本腦炎病毒之影響細胞中對日本腦炎病毒之影響得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，相除並乘以
數值無法取得 ( 表一，圖二十三 )。藥物濃度在 216.16 µM 以上時細胞死
將每個藥物濃度培養皿上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，
相除並乘以百分之百，計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之 三次重複所得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再 將此三組病毒效價百分比取平均值得到在 25 µM 時為 76.56 %，50 µM 時 為 110.92 %，100 µM 時為 74.55 %，150 µM 時為 93.43 %，250 µM 時為 125.55 %，350 µM 時為 87.64 %。IC50 數值無法取得。( 表一，圖二十五 )。
藥物濃度在 350 µM 以下，計數細胞沒有明顯的減少 ( 表二，圖二十 )。
伍 伍 伍
伍、、、、討論討論討論討論
由本實驗室之前之研究得知四種四環黴素衍生物，Tetracycline、
Chlortetracycline、Doxycycline、Rolitetracycline 在幼倉鼠腎臟纖維母細胞 ( BHK-21 ) 中對於登革熱病毒二型 PL046 strain 具有抑制空斑形成的效果
染 C6/36 細胞，上層液中測定之登革熱病毒效價則沒有明顯變化 ( IC50 無法 取得，表一；48-hr LC20 無法取得，表二 )。