3.4 空斑試驗
3.4.2 日本腦炎病毒空斑試驗
實驗前一天先於六孔培養盤中置入 2 x 105 的 BHK-21 細胞。病毒以未含血 清的 MEM 培養液進行序列稀釋。感染前先以未含血清的 MEM 培養液沖 洗細胞一次，並在細胞上加入 800 µl 未含血清的 MEM 培養液，加入 200 µl 序列稀釋後的病毒液後，置於 37 ℃、5 % CO2 培養箱中培養 1 小時，培 養過程中每 20 分鐘搖一次。 1 小時候，加入 4 ml 的 1.1 % methyl cellulose medium，置入 37 ℃、5 % CO2 培養箱中培養約四至五天。取出細 胞後，吸除培養液，加入適量 3.7 % 甲醛固定細胞，室溫靜置 20 分鐘，
吸除甲醛後加入適量的 1 % 結晶紫溶液，室溫靜置隔夜，以流水沖洗培養 盤，於室溫風乾後，計數空斑數目。
肆
重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個藥物濃度培養皿
隨著藥物濃度增加，所得到之病毒效價有降低的趨勢。IC50 約為 29.48 µM
度皆有三組重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個藥物
100 µM 時為 36.68 %，150 µM 時為 36.20 %，顯示藥物濃度在 25 µM 之 後，隨著藥物濃度增加，所得到之病毒效價有降低的趨勢。IC50 約為 63.33 µM ( 表一，圖十一 )。藥物濃度在 177.53 µM 以上時細胞死亡率大於 20 %，
對細胞有傷害性 ( 表二，圖十二 )。
4.2.2 Chlortetracycline
最終藥物濃度為 0 µM、5 µM、15 µM、25 µM、50 µM、100 µM。每一個藥 物濃度皆有三組重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個 藥物濃度培養皿上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，相除並乘 以百分之百，計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之三次重複 所得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再將此三組 病毒效價百分比取平均值得到在 5 µM 時為 70.15 %，15 µM 時為 25.70 %，
25 µM 時為 5.41 %，50 µM 時為 0.0 %，100 µM 時為 0.0 %，顯示藥物濃 度在 5 µM 之後，隨著藥物濃度增加，所得到之病毒效價有降低的趨勢。IC50
約為 9.54 µM ( 表一，圖十三 )。藥物濃度在 200.20 µM 以下，計數細胞 沒有明顯的減少 ( 表二，圖十四 )。
4.2.3 Doxycycline
得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再將此三組病
4.3 偵測藥物在
偵測藥物在偵測藥物在偵測藥物在293T 細胞中對日本腦炎病毒之影響
細胞中對日本腦炎病毒之影響細胞中對日本腦炎病毒之影響細胞中對日本腦炎病毒之影響得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，相除並乘以
數值無法取得 ( 表一，圖二十三 )。藥物濃度在 216.16 µM 以上時細胞死
將每個藥物濃度培養皿上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，
相除並乘以百分之百，計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之 三次重複所得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再 將此三組病毒效價百分比取平均值得到在 25 µM 時為 76.56 %，50 µM 時 為 110.92 %，100 µM 時為 74.55 %，150 µM 時為 93.43 %，250 µM 時為 125.55 %，350 µM 時為 87.64 %。IC50 數值無法取得。( 表一，圖二十五 )。
藥物濃度在 350 µM 以下，計數細胞沒有明顯的減少 ( 表二，圖二十 )。
伍 伍 伍
伍、、、、討論討論討論討論
由本實驗室之前之研究得知四種四環黴素衍生物，Tetracycline、
Chlortetracycline、Doxycycline、Rolitetracycline 在幼倉鼠腎臟纖維母細胞 ( BHK-21 ) 中對於登革熱病毒二型 PL046 strain 具有抑制空斑形成的效果
染 C6/36 細胞，上層液中測定之登革熱病毒效價則沒有明顯變化 ( IC50 無法 取得，表一；48-hr LC20 無法取得，表二 )。
5.2 四環黴素衍生物在
四環黴素衍生物在四環黴素衍生物在四環黴素衍生物在293T 細胞中對登革熱病毒二型之影響
細胞中對登革熱病毒二型之影響細胞中對登革熱病毒二型之影響細胞中對登革熱病毒二型之影響將四種四環黴素衍生物 Tetracycline、Chlortetracycline、Doxycycline、
Rolitetracycline 分別與登革熱病毒二型混合後，感染人類胚胎腎臟細胞 ( 293T )，於細胞上層液中測定登革熱病毒效價，實驗結果顯示病毒效價皆隨 時可達到抑制 50 % 登革熱病毒效價；Chlortetracycline、Doxycycline 及 Rolitetracycline 在 BHK-21、C6/36、293T 皆在濃度低於 150 µM 時就達到抑 制 50 % 登革熱病毒效價，而在 293T 細胞中之 IC50 又比在 BHK-21 或
C6/36 中來的小，這部分推測其原因為登革熱病毒在不同細胞中之感染、複製、
組裝能力皆有所不同所造成的。在這四種四環黴素衍生物中 Chlortetracycline 及 Doxycycline 之抑制效果較強，推測因為這兩個藥物結構上之氫鍵效應使 構型產生摺角而更適合與登革熱病毒 E protein 結合，所以相較於
Tetracycline 與之結合能力較強。Rolitetracycline 因為結構上帶有一個較大側 鏈，推測由於這個大的側鏈造成 Rolitetracycline 與登革熱病毒二型 E protein 結合能力較不佳 ( 圖二十六 )。
由於這些四環黴素衍生物不論是在幼倉鼠腎臟纖維母細胞 ( BHK-21 )、白線 斑蚊細胞 ( C6/36 ) 或是人類胚胎腎臟細胞 ( 293T ) 中對於登革熱病毒二型 PL046 strain 都是有抑制的效果，且 chlortetracycline 及 doxycycline 相較於 tetracycline 及 rolitetracycline 抑制效果較好這部分在三種細胞株也相同。顯 示更換細胞株並不改變這些四環黴素衍生物對登革熱病毒的抑制效果，推論這
將 Tetracycline、Chlortetracycline、Doxycycline、Rolitetracycline、Kanamycin 這
五種藥物與日本腦炎病毒混合，感染 293T，於細胞上層液中測定登革熱病毒 效價，實驗結果得到日本腦炎病毒效價皆不同。其中 Tetracycline 濃度增加時 日本腦炎病毒效價並沒有觀察到明顯減少的趨勢，IC50 無法取得；而
Chlortetracycline 濃度增加時日本腦炎病毒效價有觀察到明顯減少的現象 ( IC50 = 22.65 µM )；Doxycycline 及 Rolitetracycline 則是觀察到隨著藥物濃度
Chlortetracycline、Rolitetracycline 及 Doxycycline 在 BHK-21 細胞中對 DV2 的抑制效果較 DV3 佳。比較 DV2 與 DV 3 外膜蛋白之疏水性口袋周圍的
與 JEV 外膜蛋白之疏水性口袋周圍的胺基酸只有 7 個胺基酸相同 ( 表四，
附圖七 )，且其 3D 結構中，在 domain I 與 domain II 之間的疏水性口袋沒 有很高的相似度 ( 表四，附圖七，附圖八 )，推測這四種四環黴素衍生物應 對 JEV 效價不會有影響。本研究之結果中 Tetracycline 符合預期，在細胞未 受傷害之濃度內並沒有觀察到明顯的抑制效果；Doxycycline 與
Rolitetracycline 在低濃度時觀察到 JEV 效價有增加的趨勢，推測其原因為，
293T 細胞在這兩種藥物的環境壓力下改變了細胞生理狀況或病毒感染複製 的情形；Chlortetracycline 在 293T 細胞中對 JEV 則是有顯著的抑制效果，
與預期不相符合，推測 Chlortetracycline 對 JEV 的抑制機制不在疏水性口袋 上，可能在 JEV 外膜蛋白的其他地方有相結合的地方，其機制還需要進一步 做研究。
陸 陸 陸
陸、、、、結論結論結論結論
根據所有的實驗結果，更換細胞株不會影響 Tetracycline、Chlortetracycline、
Doxycycline 、Rolitetracycline 這四種四環黴素衍生物對於登革熱病毒的抑制 效果，初步得知其抑制機制應是針對病毒而非細胞。其中 Chlortetracycline 與 Doxycycline 對登革熱病毒二型的抑制效果較佳，原因可能為其結構上的便利。
另外，Tetracycline、Doxycycline 及 Rolitetracycline 對日本腦炎病毒沒有顯著 抑制效果，初步推測他們對登革熱病毒之抑制能力是具有專一性的；
Chlortetracycline 在 293T 細胞中對日本腦炎病毒也有抑制的效果，其機制應 與抑制登革熱病毒之機制不同，但詳細的作用機制還需要更進一步的了解。由 於這四環黴素衍生物是已廣為使用的抗細菌藥物，若能深入了解其對登革熱病 毒二型的抑制機制及抑制濃度，則非常有潛力成為抗登革熱病毒二型的藥物。
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表 表 表
表一一一一 Tetracycline、、、、Chlortetracycline、、、、Doxycycline、、、、Rolitetracycline 及及及及 Kanamycin 在在在在 C6/36 及及
及及 293T 細胞中對登革熱病毒二型之細胞中對登革熱病毒二型之細胞中對登革熱病毒二型之細胞中對登革熱病毒二型之 IC50 與在與在與在與在 293T 細胞中對日本腦炎病毒之細胞中對日本腦炎病毒之細胞中對日本腦炎病毒之細胞中對日本腦炎病毒之 IC50。。。。 Name：藥物名；IC50：抑制 50 % 病毒效價時之藥物濃度；NA：無法取得 ( not applicable )；
DV2：dengue virus type 2；JEV：Japanese encephalitis virus。
表 表 表
表二二二二 Tetracycline、、、、Chlortetracycline、、、、Doxycycline、、、、Rolitetracycline 及及及及 Kanamycin 之結構之結構之結構之結構 與他們對與他們對
與他們對與他們對 C6/36 及及及及 293T 細胞之傷害濃度細胞之傷害濃度細胞之傷害濃度細胞之傷害濃度。。。。
Name：藥物名；48-hr LC20：藥物接觸細胞後 48 小時照相計數細胞數，細胞死亡率達到 20
% 時之藥物濃度；NA：無法取得 ( not applicable )。
表 表 表
表三三三三 Tetracycline、、、、Chlortetracycline、、、、Doxycycline、、、、Rolitetracycline 及及及及 Kanamycin 之結構之結構之結構之結構 與他們在與他們在
與他們在與他們在 BHK-21、、、、C6/36 及及及及 293T 細胞中對登革熱病毒二型之細胞中對登革熱病毒二型之細胞中對登革熱病毒二型之細胞中對登革熱病毒二型之 IC50。。。。
*此濃度為此濃度為此濃度為重新校正計算之結果此濃度為重新校正計算之結果重新校正計算之結果重新校正計算之結果.
Name：藥物名；IC50：抑制 50 % 病毒效價時之藥物濃度；NA：無法取得 ( not applicable )；
Name：藥物名；IC50：抑制 50 % 病毒效價時之藥物濃度；NA：無法取得 ( not applicable )；