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學
生物科技研究所
碩
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士
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論
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文
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以 C6/36 與 293T 細胞探討四環黴素衍生物對登革熱病
毒二型及日本腦炎病毒繁衍之影響
The effect of tetracycline derivatives on dengue virus type II and
Japanese encephalitis virus in C6/36 and 293T
研 究 生：黃敬淳
學號：9728507
指導教授：楊昀良 博士
中
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以 C6/36 與 293T 細胞探討四環黴素衍生物對登革熱病
毒二型及日本腦炎病毒繁衍之影響
The effect of tetracycline derivatives on dengue virus type II and
Japanese encephalitis virus in C6/36 and 293T
研 究 生：黃敬淳 Student：Ching-Chun Huang 指導教授：楊昀良 Advisor：Dr. Yun-Liang Yang
國 立 交 通 大 學 生物科技研究所
碩 士 論 文
A Thesis
Submitted to Department of Biological Science and Technology National Chiao Tung University
in partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science
in
Biological Science and Technology July 2011
Hsinchu, Taiwan, Republic of China
i
以
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以
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C6/36
C6/36
C6/36 與
C6/36
與
與
與
293T
293T
293T
293T 細胞探討四環黴素衍生物對登革熱病毒二型
細胞探討四環黴素衍生物對登革熱病毒二型
細胞探討四環黴素衍生物對登革熱病毒二型
細胞探討四環黴素衍生物對登革熱病毒二型及日
及日
及日
及日
本腦炎病毒繁衍之影響
本腦炎病毒繁衍之影響
本腦炎病毒繁衍之影響
本腦炎病毒繁衍之影響
研究生：黃敬淳 指導教授：楊昀良 博士 中文摘要 中文摘要 中文摘要 中文摘要 登革熱是目前影響全球健康的重要議題之一，主要分布在熱帶及亞熱帶地區。 根據統計已超過 100 個國家曾經爆發過登革熱疫情並且約有二十五億人口受到登 革熱病毒的威脅。登革熱病毒屬於黃質病毒科黃質病毒屬。對於登革熱目前並沒有 有效且商業化之疫苗，積極開發抗登革熱藥物是當前重要目標之一。 黃質病毒的外膜蛋白對於病毒與宿主細胞結合，進入宿主細胞內都扮演著很重 要的角色。之前實驗室已根據登革熱病毒外膜蛋白篩選出一些四環黴素衍生物在幼 倉鼠細胞 ( BHK-21 ) 有抑制登革熱病毒二型空斑產生的效果。在本研究中，我使 用蚊子細胞 ( C6/36 ) 及 人類胚胎腎臟細胞 ( 293T ) 進行一系列實驗，藉由實驗 結果推測四環黴素衍生物對登革熱病毒抑制效果的標的。結果顯示使用不同細胞株 不會影響四環黴素衍生物對登革熱病毒的抑制效果。初步推斷四環黴素衍生物之抑 制標的應在病毒上。 為了進一步了解四環黴素衍生物抑制的專一性，使用同為黃質病毒的日本腦炎 病毒 ( Japanese encephalitis virus ) 與藥物一起感染 293T 細胞。結果得到除 Chlortetracycline 之外其他四環黴素衍生物對日本腦炎病毒並沒有顯著抑制的效果， 顯示四環藥物衍生物中 Tetracycline、Doxycycline、Rolitetracycline 的抑制效果具 有專一性。
ii
The effect of tetracycline derivatives on dengue virus type II
and Japanese encephalitis virus in C6/36 and 293T
Student：Ching-Chun Huang Advisor：Dr. Yun-Liang Yang
Abstract
Dengue virus, a member of the Flaviviridae family, is now believed to be the most important arthropod-borne disease in the world, especially in tropical and subtropical regions. There were outbreaks reported in more than 100 countries and about 2 billion people lived under the threats. Therefore, control of the dengue viral infections is an urgent issue. However, there is no commercial vaccine or medication available.
Dengue envelop protein (E protein) is responsible for activating “membrane fusion” during the entry of viruses into host cells. Previously research in the laboratory has shown that several tetracycline derivatives have inhibitory effect on the propagation of dengue viruses in mammalian cell BHK21. In this study, I used mosquito cell line C6/36 and human embryonic cell line kidney 293T to perform a series of assay to find out the target of these tetracycline derivatives. All these tetracycline derivatives showed inhibitory effects on dengue virus type 2 in both C6/36 and 293T cell culture, indicating that the inhibitory target might be at virus instead of the host cell.
Furthermore, to understand the specificity of these tetracycline derivatives, Japanese encephalitis virus (JEV), which is also a member of flavivirus was used to infect 293T cell line with or without the present of these four tetracycline derivatives. All these tetracycline derivatives showed no significant inhibitory effects on JEV in 293T cell line except chlortetracycline.
iii 致謝 致謝 致謝 致謝 碩班終於走到這一頁了，心裡真是充滿興奮及不捨，這些年來遇到許多幫助我 的人，首先最需要感謝的當然是指導教授小楊老師，老師很有邏輯的教導我做研究 需要的態度，使我在思考解決問題這方面成長了不少，另外老師課堂及 meeting 上 很生活化的舉例說明都會讓我笑個半天，可以在小楊老師實驗室真的很開心。再來 一定要感謝的是口試委員梁美智老師及徐維莉老師，美智老師在學校碰到我都會親 切的跟我打招呼問候我，維莉老師在兩年後還記得我讓我好感動，謝謝你們抽空來 參加我的碩班口試，給我許多建議讓論文更完整。 能夠完成碩士學業也要謝謝實驗室的成員們的陪伴，親切友善的藍敏書學長， 對一個剛到陌生環境的新人你真的很重要；謝謝耐心帶我做 western 的淑貞學姐； 謝謝原本超 man，上班後超美的高人李淑萍陪我嘻嘻哈哈吵吵鬧鬧；還有謝謝一起 耍白痴哈哈大笑的秀拔，你的笑聲真的超喜感的啦!!謝謝惠菁學姐雖然人在國衛院， 回博愛時也會關心問候我；妍寧!!這次沒有打錯你的妍了，你講英文好好聽窩，謝 謝你在生活上給我的幫助；感謝佳真老師也是身在國衛院，可是都會關心鼓勵我； 一開始以為很兇的桑妮麻麻，其實也是超級可愛跟好笑，謝謝你畢業後也會給我打 氣，督促我快快畢業；我最親愛的酷哥，第一次踏進實驗室真的被你的臉嚇個半死， 但是相處久了也越來越喜歡你，也發現其實你也是少根經大爺啦，在碩班生涯中非 常感謝你一直給我消費，我的高中大學同學都認識你啦，酷哥最棒了!!!小倩倩也 是一開始被我歸類為超兇狠學姐，但是現在我都爬到你頭上一直欺負你了，欺負你 好好玩，但是但是阿，在我心中深深小小的地方，對小倩其實是非常崇拜的唷!! 嘿嘿；最親愛的最親愛的麻麻，首先要謝謝你辛苦帶我做實驗，還有在我心情不好 時陪我說話安慰我，心情好時陪我一起開心丟搞，帶我去台中玩，麻麻也最棒了!!! 謝謝麻麻當然也要謝謝拔拔，拔拔真的超級無厘頭超好笑，雖然全世界大概只有麻 麻跟我欣賞你的笑點啦哈哈；大楊家的咏馨阿姨，面惡心善唱歌超好聽的咏馨阿姨， 在你冷酷的外表下，我知道你是最關心朋友的好阿姨，現在對你我也越來越皮了哈
iv 哈，我會學著長大，不會讓你擔心我受騙的!!一起同甘共苦的洪優優跟重哥哥，還 記得第一天見到洪優優，我就哭給你看嚇了你一大跳，還麻煩你帶我去光復辦網路， 之後這些年也陪我一起起笑當海綿寶派大星二人組，感謝感謝!!謝重哥總是幫忙實 驗室細胞室的大小瑣事，儼然是小楊家水電工，還要謝謝你無限供應我的飲用水跟 蛋黃派，實驗上有問題跟重哥討論就會感覺超安心的啦!!超高音女王阿鋘也是一個 熱心搞笑的好朋友，跟你一起唱歌嘶吼真的很爽快，乾蝦乾蝦；常常聽我發瘋的幸 璇，你的故事也是我碩班生涯一個非常棒的調劑，故事裡的角色都會讓我非常感興 趣，真是太戲劇化了啦!!哈哈；凱薩你的少根經有時候真的讓我很無奈，常常對你 兇搞得不愉快，可是之後你看到我都還是笑嘻嘻，讓我很心虛哈哈，謝謝你陪我去 NOVA 跑來跑去當奧客買硬碟啊；阿白也是常常聽我發瘋的人，感謝你耐心開導我， 但是你不要在虐待你的證件了，交給我保管吧!!包你有超乎所值的感覺；阿賢小可 愛，跟你也是有風有雨啊，謝謝你常常給我依賴，感覺我們某些個性有點像，希望 我們可以一起長大做自己好自在唷!!小善姊姊感謝有你，碩班的最後可以一起共甘 苦，互相討論初稿口試的細節，有你在讓我好安心，還有跟你一起分食讓我食量變 小一點點羞；小氣寶貝，最後一年有你陪伴真好，你也是個冷面笑匠呢，一開始以 為你好文靜，一切都是錯覺哇哈哈哈；春榮電腦神，感謝你重建了網路系統還有架 設 FTP，讓我們傳檔案超方便，還有每次 meeting 聽你報告都覺得好神奇，果然是 電腦神；正咩妍辰，雖然相處的時間不長也很感謝你陪我聊天唷!!還有要感謝阿諾， 有時後來陪我吃冰吃飯，一起聊些有的沒的好開心啊科科。其他還有許多在各方面 幫助過我，陪伴過我的朋友，讓我碩班這些年過得很快樂很充實，謝謝你們!!!!! 最後一部分留給我最親愛的家人，謝謝黃爸爸、黃媽媽跟黃姊姊，你們辛苦了， 讓我可以無慮的學習，也都會給我打氣跟鼓勵，有你們的支持讓我讓我更努力學習， 超~~級感謝你們的!!
v 目錄 目錄 目錄 目錄 中文摘要 ... i 英文摘要 ... ii 致謝 ... iii 目錄 ... v 表目錄 ... ix 圖目錄 ... x 附表目錄 ... xii 附圖目錄 ... xiii 壹、緒論 ... 1 1.1 登革熱疾病概論 ... 1 1.2 登革熱病毒分子生物學背景 ... 2 1.3 登革熱病毒複製史... 3 1.4 登革熱病毒外膜蛋白性質 ... 4 1.5 日本腦炎疾病概論... 5 1.6 日本腦炎病毒外膜蛋白性質 ... 6 1.7 四環黴素衍生物 ( tetracycline derivatives ) 性質 ... 7 1.8 實驗設計與目的 ... 7 貳、材料與方法 ... 9
vi 2.1 細胞株 ... 9 2.2 病毒 ... 9 2.3 藥品 ... 9 2.4 溶劑、緩衝溶液配方 ... 10 2.5 培養液 ... 11 2.6 儀器設備 ... 11 参、方法 ... 14 3.1 細胞繼代培養 ... 14 3.1.1 BHK-21 細胞繼代培養 ... 14 3.1.2 C6/36 細胞繼代培養 ... 14 3.1.3 293T 細胞繼代培養 ... 15 3.2 病毒增殖 ... 15 3.2.1 登革熱病毒增殖 ... 15 3.2.2 日本腦炎病毒增殖 ... 16 3.3 病毒抑制試驗 ... 16 3.3.1 C6/36 細胞病毒抑制試驗 (登革熱病毒) ... 16 3.3.2 293T 細胞病毒抑制試驗 (登革熱病毒) ... 17 3.3.3 293T 細胞病毒抑制試驗 (日本腦炎病毒) ... 18 3.4 空斑試驗 ... 18
vii 3.4.1 登革熱病毒空斑試驗 ... 18 3.4.2 日本腦炎病毒空斑試驗 ... 19 肆、結果 ... 20 4.1 偵測藥物在 C6/36 細胞中對登革熱病毒二型之影響 ... 20 4.1.1 Tetracycline ... 20 4.1.2 Chlortetracycline ... 20 4.1.3 Doxycycline ... 21 4.1.4 Rolitetracycline... 22 4.1.5 Kanamycin ... 22 4.2 偵測藥物在 293T 細胞中對登革熱病毒二型之影響 ... 23 4.2.1 Tetracycline ... 23 4.2.2 Chlortetracycline ... 24 4.2.3 Doxycycline ... 25 4.2.4 Rolitetracycline... 25 4.2.5 Kanamycin ... 26 4.3 偵測藥物在 293T 細胞中對日本腦炎病毒之影響 ... 27 4.3.1 Tetracycline ... 27 4.3.2 Chlortetracycline ... 27 4.3.3 Doxycycline ... 28 4.3.4 Rolitetracycline... 29 4.2.5 Kanamycin ... 29 伍、討論 ... 31 5.1 四環黴素衍生物在 C6/36 細胞中對登革熱病毒二型之影響 ... 31
viii
5.2 四環黴素衍生物在 293T 細胞中對登革熱病毒二型之影響 ... 32
5.3 四環黴素衍生物在 293T 細胞中對日本腦炎病毒之影響 ... 33
陸、結論 ... 36
ix 表目錄 表目錄 表目錄 表目錄 表一 Tetracycline、Chlortetracycline、Doxycycline、Rolitetracycline 及 Kanamycin 在 C6/36 及 293T 細胞中對登革熱病毒二型之 IC50 與在 293T 細胞中 對日本腦炎病毒之 IC50。 ... 39 表二、Tetracycline、Chlortetracycline、Doxycycline、Rolitetracycline 及 Kanamycin 之結構與他們對 C6/36 及 293T 細胞之傷害濃度。 ... 40 表三、Tetracycline、Chlortetracycline、Doxycycline、Rolitetracycline 及 Kanamycin 之結構與他們在 BHK-21、C6/36 及 293T 細胞中對登革熱病毒二型之 IC50。 ... 41 表四、登革熱病毒二型與日本腦炎病毒外膜蛋白之疏水性口袋周圍胺基酸之比 較 ... 42
x 圖目錄 圖目錄 圖目錄 圖目錄 圖一、Tetracycline 在 C6/36 細胞中對於登革熱病毒二型的影響 ... 43 圖二、Tetracycline 對 C6/36 細胞之傷害性 ... 45 圖三、Chlortetracycline 在 C6/36 細胞中對於登革熱病毒二型的影響 ... 46 圖四、Chlortetracycline 對 C6/36 細胞之傷害性... 48 圖五、Doxycycline 在 C6/36 細胞中對登革熱病毒二型之影響 ... 49 圖六、Doxycycline 對 C6/36 細胞之傷害性 ... 51 圖七、Rolitetracycline 在 C6/36 細胞中對登革熱病毒二型之影響 ... 52 圖八、Rolitetracycline 對 C6/36 細胞之傷害性 ... 54 圖九、Kanamycin 在 C6/36 細胞中對登革熱病毒二型之影響 ... 55 圖十、Kanamycin 對 C6/36 細胞之傷害性 ... 57 圖十一、Tetracycline 在 293T 細胞中對於登革熱病毒二型的影響 ... 58 圖十二、Tetracycline 對 293T 細胞之傷害性 ... 60 圖十三、Chlortetracycline 在 293T 細胞中對登革熱病毒二型之影響 ... 61 圖十四、Chlortetracycline 對 293T 細胞之傷害性 ... 63 圖十五、Doxycycline 在 293T 細胞中對登革熱病毒二型之影響 ... 64 圖十六、Doxycycline 對 293T 細胞之傷害性 ... 66 圖十七、Rolitetracycline 在 293T 細胞中對登革熱病毒二型之影響 ... 67 圖十八、Rolitetracycline 對 293T 細胞之傷害性 ... 69
xi 圖十九、Kanamycin 在 293T 細胞中對登革熱病毒二型之影響 ... 70 圖二十、Kanamycin 對 293T 細胞之傷害性 ... 72 圖二十一、Tetracycline 在 293T 細胞中對於日本腦炎病毒的影響 ... 73 圖二十二、Chlortetracycline 在 293T 細胞中對於日本腦炎病毒的影響 ... 75 圖二十三、Doxycycline 在 293T 細胞中對日本腦炎病毒之影響 ... 77 圖二十四、Rolitetracycline 在 293T 細胞中對日本腦炎病毒之影響 ... 79 圖二十五、Kanamycin 在 293T 細胞中對日本腦炎病毒之影響 ... 81
圖 二 十 六 、 Tetracycline 、 Chlortetracycline 、 Doxycycline 、 Rolitetracycline 及 Kanamycin 之 3D 結構圖 ... 83
xii 附表 附表 附表 附表目錄目錄目錄目錄 附表一、Tetracycline、Chlortetracycline、Doxycycline、Rolitetracycline、Kanamycin、
9-Amino-1,2,3,4-tetrahydroacridie hydrochloride hydrate 及 Berberine 之
結構與他們在 BHK-21 細胞中對登革熱病毒二型之 IC50 ... 84
附 表 二 、 Tetracycline 、 Chlortetracycline 、 Doxycycline 、 Rolitetracycline 、
Demeclocycline、Oxytetracycline 及 Minocycline 在 BHK-21 細胞中對登
革熱病毒二型之 IC50 ... 85
附表三、Tetracycline、Chlortetracycline、Doxycycline、Rolitetracycline 在人體內
xiii 附圖 附圖 附圖 附圖目錄目錄目錄目錄 附圖一、登革熱病毒在世界的分布 ... 87 附圖二、2007 年至 2011 年六月台灣登革熱病例數及 2010 年 1 月至 2011 年 6 月登革熱病例發生數 ... 87 附圖三、黃質病毒基因體示意圖及病毒、宿主細胞蛋白酵素作用位置 ... 88 附圖四、登革熱病毒在宿主細胞內的複製史 ... 88 附圖五、登革熱病毒外膜蛋白結構示意圖 ... 89 附圖六、日本腦炎外膜蛋白示意圖 ... 89 附圖七 登革熱病毒二型外膜蛋白與日本腦炎外膜蛋白胺基酸序列比較 ... 90 附圖八、登革熱病毒二型外膜蛋白與日本腦炎外膜蛋白比較 ... 91
壹 壹 壹
壹、、、、緒論緒論緒論緒論
登革熱 ( Dengue fever, DF ) 是一種因感染登革熱病毒 ( Dengue virus, DV ) 所
造成的傳染病。登革熱病毒藉由埃及斑蚊 ( Aedes aegypti ) 及白線斑蚊 ( Aedes
albopictus ) 叮咬的途徑在人跟人之間傳播。登革熱病毒是經由節肢動物感染的 病毒中最重要的一個，主要好發於熱帶及亞熱帶 ( 附圖一 )，居住在此地區的
人口約有 25 億人，占全球人口 40 %，超過 100 個國家都有爆發過登革熱
( World Health Organization, WHO )。全世界每年感染登革熱約有五千萬到一億的
人口，其中登革出血熱 ( Dengue hemorrhagic fever, DHF ) 病例有 50 萬件，死
亡病例則有 2 萬 2 千件 ( World Health Organization, WHO )。台灣位於亞熱帶
且為海島型國家，氣候溫暖潮濕，非常適合病媒蚊孳生。自 1987 年後，每年 都有登革熱的確定病例，其中 2010 年病例集中在八至十二月 ( 附圖二，台灣 疾病管制局，Taiwan CDC )。由於目前尚無有效防治登革熱的商業化疫苗及藥 物，除了減少病媒蚊的孳生，積極研究預防及治療的方法亦是重要課題之一。 1.1 登革熱疾病概論登革熱疾病概論登革熱疾病概論登革熱疾病概論 登革熱根據血清抗原性可分為四個血清型 ( serotype )，分別是 DV1 、DV2、 DV3 及 DV4。人類被帶有登革熱病毒的病媒蚊叮咬後，登革熱病毒在體內的 潛伏期約 3 到 14 天 ( 平均 4 至 7 天 ) ( Gubler, 1998 )。感染登革熱的臨
床症狀可能為無症狀 ( asymptomatic )，或依症狀嚴重程度分為登革熱
( dengue fever, DF )、登革出血熱 ( dengue hemorrhagic fever, DHF ) 及登革休
克症候群 ( dengue shock syndrome, DSS )。
DF 又稱典型登革熱 ( classic dengue fever )，症狀為突然的發燒伴隨頭痛、眼
窩痛、全身肌肉關節痠痛、噁心嘔吐及紅疹……等。典型登革熱發生出血 ( hemorrhage ) 的情況較不常見，通常具有自限性 ( self-limiting )，於症狀發生 後 3 至 7 天會自行痊癒。登革出血熱初期症狀與典型登革熱類似，有急性的 發燒期，所以難與典型登革熱做區分。發燒將退的前後一天，因為血管通透性 增加造成血漿滲出 ( plasma leakage )，微血管破裂，皮膚開始有瘀血、瘀斑出 現。此時若沒有及時給予適當治療，病患血漿滲出過多時會因失血而造成休克 稱為登革休克症候群，死亡率可達 10 ~ 15 % ( Gubler, 1998, 2002 )。 1.2 登革熱病毒分子生物學背景登革熱病毒分子生物學背景登革熱病毒分子生物學背景登革熱病毒分子生物學背景 登革熱病毒為具有外膜 ( envelope ) 的正向單股 RNA 病毒，屬於黃質病毒科
( Flaviviridea ) 黃質病毒屬 ( Flavivirus )，同屬病毒有：西尼羅病毒 ( West Nile
virus )、日本腦炎病毒 ( Japanese encephalitis virus )、黃熱病毒 ( Yellow fever
virus )、TBEV ( tick-borne encephalitis virus )等其他超過七十種病毒
( Lindenbach et al., 2007 )。登革熱病毒顆粒直徑約 50 nm，基因體全長約 10.8
UTR ) 及 3’端非轉譯區 ( 3’untranslated region, 3’ UTR ) 夾住。進行轉譯
時只會合成出一條多肽鏈 ( polyprotein )，經由病毒本身的蛋白質酵素 ( serine
protease ) 及宿主細胞內的蛋白質酵素 ( protease ) ( Clyde et al., 2006 )，將多肽
鏈裂解成十個獨立蛋白，包括三個結構型蛋白 ( structural protein )：衣殼蛋白
( capsid protein, C )、前驅膜蛋白 ( precursor membrane protein, prM ) 及外膜蛋
白 ( envelope protein, E )；七個非結構型蛋白 ( non-structural protein )：NS1、
NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 及 NS5 ( 附圖三，Sampath and Padmanabhan,
2009，Lindenbach et al., 2007 )。 1.3 登革熱病毒複製史登革熱病毒複製史登革熱病毒複製史登革熱病毒複製史 登革熱病毒屬於經由病媒蚊叮咬人類而傳染之黃質病毒，黃質病毒進到人體後 的生活史目前最普遍的看法是：病毒透過病毒表面的外膜蛋白跟宿主細胞表面 的受體 ( receptor ) 結合後，經由胞飲作用 ( endocytosis ) 進到宿主細胞內。 在內體小泡 ( endosomal vesicle ) 中的酸性環境下，病毒及宿主細胞的細胞膜 會進行融合 ( fusion ) 將病毒的 nucleocapsid 釋放到細胞質中，接著去衣殼蛋 白的程序使病毒的基因體進到細胞質中，基因體經由轉錄、轉譯的工作，新合 成的 RNA 及結構型蛋白進入內質網內腔，先在內質網表面組裝形成不具感染
力的未成熟病毒 ( Mackenzie and Westaway, 2001 )，接著運送到反式高基氏體，
1997 )，經由胞泌作用 ( exocytosis ) 釋放到胞外 ( 附圖四，Clyde et al., 2006，，
Allison et al., 2001， Lindenbach et al., 2007 )。
1.4 登革熱病毒外膜蛋白性質登革熱病毒外膜蛋白性質登革熱病毒外膜蛋白性質登革熱病毒外膜蛋白性質
外膜蛋白 ( envelope protein, E protein ) 是成熟黃質病毒顆粒最主要的結構型
蛋白 ( Heinz and Allison, 2001 )。登革熱病毒外膜蛋白由 495 個胺基酸組成，
是一穿膜的醣蛋白 ( glycoprotein )，關係著病毒與宿主細胞的結合，且對於病
毒進入宿主細胞內的過程扮演著很重要的角色 ( Allison et al., 2001，Crill and
Roehrig, 2001 )，屬於第二類的融合蛋白 ( class II viral fusion protein ) ( Heinz
and Allison, 2001 )。
近年來，已有學者利用 X-ray 繞射的方法解出黃質病毒中 DV2 及 TBEV
( tick-borne encephalitis virus ) 的 E protein 結晶結構，此結構只包含位於脂雙
膜 ( lipid bilayer ) 外的蛋白質部分 ( ectodomain ) ( Rey et al., 1995，Modis et
al., 2003 )。根據此結構得知，E protein 在膜外可分為三個區域 ( domain ) ( 附 圖五，Modis et al., 2004 )，分別是 domain I，包含了第 1-52、133-192 及
275-296 的胺基酸，是 E protein 的中央區域；domain II 包含了第 53-132 及
193-274 的胺基酸，負責與另一個 E protein 形成雙體 ( dimer )，且根據黃質
病毒外膜蛋白特性在末端有一個 fusion peptide ( 第 98-110 的胺基酸 )
297-394 的胺基酸，被認為是與宿主細胞表面受體結合的區域 ( Bhardwaj et al.,
2001，Crill and Roehrig, 2001 )，是一個 immunoglobulin-like 區域，病毒中和
試驗中常以此區域為抗原。
E protein 在中性酸鹼值的環境以雙體的形式存在於病毒表面，當病毒經胞飲
作用進到宿主細胞後，會先被包在內體小泡中，內體小泡中的酸性環境會催化
E protein 的構型改變 ( Allison et al., 1995，Lescar et al., 2001 )，雙體結構變成
三體結構 ( trimer )。此構型改變讓 domain II 突出，末端的 fusion peptide 露
出促使病毒的外套膜與內體小泡膜進行融合，病毒的 nucleocapsid 進入細胞
質中 ( Modis et al., 2004 )。
之前有文獻將登革熱病毒外膜蛋白單獨或與分子 N-octyl-β- D -glucoside
( β-OG ) 進行結晶發現，分子 β-OG 會佔據在登革熱病毒外膜蛋白 domain I
跟 domain II 之間的疏水性口袋 ( hydrophobic pocket )。分子 β-OG 的有無會
讓登革熱病毒外膜蛋白 domain II 上的 kl loop 結構產生差異 ( Yang et al.,
2007 )，而這差異會影響登革熱病毒外膜蛋白在低 pH 環境中的構型改變，此
疏水性口袋被認為可當作設計抗登革熱病毒藥物之標的 ( Modis et al., 2003,
2004 )。
1.5 日本腦炎疾病概論日本腦炎疾病概論日本腦炎疾病概論日本腦炎疾病概論
膜炎，每年約有 5 萬個臨床病例，其中約 1 萬名病患最後會死亡，1 萬 5 千
名病患在神經及精神上有永久的後遺症 ( World Health Organization, WHO )。
日本腦炎病毒與登革熱病毒同屬於黃質病毒科 ( Flaviviridea ) 黃質病毒屬
( Flavivirus )，在台灣主要的病媒蚊為三斑家蚊 ( Culex tritaeniorhynchus )。被
日本腦炎病毒感染後的症狀大部分為無症狀，少部分輕微病例頭痛、發燒或無 菌性腦膜炎等症狀，嚴重者除了頭痛發燒，還有腦膜刺激、昏迷及痙攣等症狀， 最後導致精神及神經上後遺症或死亡 ( 台灣疾病管制局，Taiwan CDC http://www.cdc.gov.tw/ )。 1.6 日本腦炎病毒外膜蛋白性質日本腦炎病毒外膜蛋白性質日本腦炎病毒外膜蛋白性質日本腦炎病毒外膜蛋白性質 日本腦炎病毒因為同屬黃質病毒，其外膜蛋白同樣包含三個區域 ( domain )，
根據 NCBI database 資料三個區域分別為：構成 E protein 中央區域的 domain
I，包含了第 1-57、122-222 及 268-298 的胺基酸；含有 fusion peptide 的
domain II 包含了第 58-121 及 223-267 的胺基酸；被認為是與宿主細胞表面
受體結合的 domain III 包含第 299-406 的胺基酸 ( 附圖六，National Center
for Biotechnology Information，NCBI database )。
與登革熱病毒外膜蛋白比較，在 domain I 與 domain II 之間的區域沒有很高
1.7 四環黴素衍生物四環黴素衍生物四環黴素衍生物四環黴素衍生物 ( tetracycline derivatives ) 性質性質性質性質
四環黴素衍生物為一類同樣以四環結構為基礎的廣效型 ( broad-spectrum ) 抗
生素。第一個被發現的為 chlortetracycline，於 1994 年被分離出來，之後其
他四環黴素衍生物陸續被發現，包括 1950 年的 oxytetracycline，1953 年的
tetracycline，以及半合成的 doxycycline 及 minocycloine。四環黴素衍生物藉
由與細菌體內 30S 核醣體上的 A-site 結合，使新的胺基酸單體無法加到胜肽 鏈上干擾細菌蛋白質合成而達到抑菌的效果，主要用於對抗多種革蘭氏陰性及 陽性菌、厭氧菌、立克次氏體及黴漿菌……等等 ( Andre, 2005 )。本實驗中使 用的四環黴素衍生物主要為 tetracycline、chlortetracycline、doxycycline 及 rolitetracycline，其在人體的使用濃度如附表三。 1.8 實驗設計與目的實驗設計與目的實驗設計與目的實驗設計與目的 根據實驗室之前與楊進木老師合作，以生物資訊 Virtual screening 的方式針對
登革熱病毒的外膜蛋白上疏水性口袋在 Comprehensive Medicinal Chemistry
資料庫進行藥物篩選。篩選得到的前 200 個藥物名單中，包含了兩個四環黴
素衍生物 tetracycline 及 rolitetracycline，因為四環黴素衍生物都具有四個環
的基本結構，只是在支鏈上做修飾產生其他衍生物，推測四環結構可能為與疏
實驗室前人 ( 張，2009；杜，2007 ) 研究發現，四種四環黴素衍生物 Tetracycline、Chlortetracycline、Doxycycline、Rolitetracycline，相較於非四環 結構藥物 Kanamycin，在幼倉鼠腎臟纖維母細胞 ( BHK-21 ) 中對於登革熱病 毒二型 PL046 strain 具有抑制空斑 ( plaque ) 形成之效果。根據當初篩選藥物 的方法，假設這些四環黴素衍生物有機會與登革熱病毒外膜蛋白上的疏水性口 袋結合，使外膜蛋白在內體小泡中的低 pH 環境下無法產生構型變化，進而 阻止登革熱病毒進入宿主細胞質中。為了進一步確認這些這個假設，根據以下 兩個方向進行實驗設計。1) 若藥物與病毒作用，對於不同細胞株應該得到類 似的抑制效果。第一步使用不同於哺乳類且為登革熱病毒載體的白線斑蚊細胞 ( C6/36 )，第二步使用人類的胚胎腎臟細胞 ( 293T ) 進行實驗。由於 BHK-21 細胞與 C6/36 及 293T 細胞被登革熱病毒感染之反應不同，BHK-21 會有細 胞溶解 ( cell lyse ) 的現象，C6/36 及 293T 細胞則不會，若四環黴素衍生物 在這些細胞中皆對登革熱病毒有抑制之效果，則可初步排除藥物是針對 BHK-21 細胞有抑制作用。2) 如果藥物是與細胞作用，可能是藉由與細胞內 核醣體結合干擾細胞蛋白質合成而達到抑制效果，則對於不同病毒應得到同樣 的抑制效果。使用同樣為黃質病毒的日本腦炎病毒來觀察藥物是否藉由干擾蛋 白質合成而達到抑制病毒之效果。希望藉由本研究推斷這些四環黴素衍生物作 用的標的。
貳 貳 貳
貳、、、、材料材料材料材料
2.1 細胞株細胞株細胞株細胞株
BHK-21 ( 幼倉鼠腎臟纖維母細胞，baby hamster kidney cell )
C6/36 ( 白線斑蚊細胞，Aedes albopictus larva cell )
293T ( 人類胚胎腎臟細胞，human embryonic kidney cell )
2.2 病毒病毒病毒病毒
Dengue virus type 2 PL046 strain ( Taiwan local strain，lab collection )
Japanese encephalitis virus RP9 strain ( gift from Dr. RY. Chang’s laboratory，
NDHU ) 2.3 藥品藥品藥品藥品 藥品名稱 藥品名稱 藥品名稱 藥品名稱 製造公司製造公司製造公司製造公司 目錄編號目錄編號目錄編號目錄編號 應用應用應用應用 Chlortetracycline Sigma C-4881 病毒抑制試驗
Crystal Violet Sigma C-3886 空斑試驗
DMSO Sigma D-8418 細胞保存
Fetal Bovine Serum Biological industries
04-001-1A 細胞培養
Formaldehyde Riedel-de Haën 33220 固定細胞
Kanamycin Sigma K4000 病毒抑制試驗 MEM GIBCO 41500-034 細胞培養 Methylcellulose Sigma M0512 空斑試驗 NaHCO3 Sigma S-5761 細胞培養 PBS Biological Industries 11-223-1K 細胞培養 Rolitetracycline Sigma R-2253 病毒抑制試驗 Tetracycline Sigma T-7660 病毒抑制試驗
TrypLETM Express GIBCO 12605-010 細胞培養
2.4 溶劑溶劑溶劑、溶劑、、、緩衝溶液配方緩衝溶液配方緩衝溶液配方緩衝溶液配方
1 % crystal violet solution ( 500 ml ) 5 g crystal violet 50 ml 37 % formaldehyde 450 ml H2O 3.7 % formaldehyde 100 ml 37 % formaldehyde 900 ml ddH2O
2.5 培養液培養液培養液培養液
1X MEM
MEM powder ( GIBCO，41500-034 ) 2.2 g NaHCO3
ddH2O to 1000 ml
2X MEM
MEM powder ( GIBCO，41500-034 ) 2.2 g NaHCO3
ddH2O to 500 ml 10 % FBS / MEM
50 ml fetal bovine serum 450 ml 1X MEM
5 % FBS / MEM
25 ml fetal bovine serum 475 ml 1X MEM 1.1 % methylcellulose medium 5.5 g methylcellulose 250 ml ddH2O 250 ml 2X MEM 2.6 儀器設備儀器設備儀器設備儀器設備 -20℃直立冷凍櫃 ( WHITE-WESTINGHOUSE )
開蓋式 -20℃冷凍櫃 311-407-00 ( CARAVELL ) 4℃三門冰藏櫃 KS-101-MS ( MINI KINGKON ) 樣品冷藏櫃 CH-502 ( CHIN HSIN ) -80℃超低溫冷凍櫃 925/926 ( FORMA SCIENTIFIC ) 二氧化碳培養箱 5420-0NEW ( NAPCO ) 二氧化碳培養箱 ( CONTHERM ) 低溫培養箱 701 ( WISOOM ) 加熱攪拌器 PC-420 ( CORNING ) 數字式加熱攪拌器 6795-420D ( CORNING ) 水浴槽 B-101 ( FIRSTEK SCIENTIFIC ) 血球計數器 ( MARIEMFELD ) 研究級倒立項位差螢光顯微鏡 ( NIKON ) 桌上型低溫高速離心機 Centrifuge 5804 R ( eppendorf ) 微量離心機 UFO2100 ( PANTECH ) 電子天秤 PB153-S ( METTLER TOLEDO ) 電子天秤 TB-214 ( DENVER INSTRUMANT ) 超純水製造機 ( MILLIPORE ) 超音波洗淨器 DC200 ( DELTA ) 烘箱 DS45 ( DENG YNG ) 無菌操作台 VCM-420 （ 造鑫 ）
液態氮容器 ( TAYLOR-WHARTON )
参 参 参 参、、、、方法方法方法方法 3.1 細胞繼代培養細胞繼代培養細胞繼代培養細胞繼代培養 3.1.1 BHK-21 細胞繼代培養細胞繼代培養細胞繼代培養細胞繼代培養
培養液為含有 5 % FBS ( Fetal Bovine Serum；Biological Industry，Cat.
04-001-1A) 的 MEM (Minimum Essential Medium；GIBCO，Cat.41500-034)，
培養環境為含有 5 % CO2 的 37 ℃恆溫培養箱。繼代培養程序如下：吸除
培養液，以 PBS (Phosphate Buffer Saline；biological industry，Cat. 11-223-1K）
沖洗一次，加入 1 ml 的 TrypLETM
Express （GIBCO， Cat. 12605-010）於 37
℃、5 % CO2 培養箱中反應 5 分鐘，加入約 3 ml 培養液與 TrypLE TM Express 混合後輕沖培養皿底盤使細胞脫落並均勻散佈於培養液中，留下 1 / 10 體積的細胞液，補入 10 ml 培養液混合均勻，置於培養箱繼續培養。 3.1.2 C6/36 細胞繼代培養細胞繼代培養細胞繼代培養細胞繼代培養 培養液使用含有 10 % FBS 的 MEM，培養於 28 ℃，5 % CO2 恆溫箱中。 繼代培養程序如下：吸除培養液到約剩 1 ml，使用細胞刮勺將培養皿底部 的細胞刮落，加入 3 ml 培養液沖洗培養皿底盤，將細胞沖散並使其均勻分 佈於培養液中。留下約 1 / 3 的細胞液，補入 10 ml 培養液混合均勻，置於
培養箱繼續培養。 3.1.3 293T 細胞繼代培養細胞繼代培養細胞繼代培養細胞繼代培養 培養液為含有 10 % FBS 的 MEM，培養環境為含有 5 % CO2 的 37℃ 恆 溫培養箱。繼代培養程序如下：吸除培養液，以 PBS 沖洗一次，加入 1 ml 的 TrypLETM Express，於 37 ℃、5 % CO2 培養箱中反應 3 分鐘，加入約 3 ml 培養液與 TrypLETM Express 混合後輕沖培養皿底盤使細胞脫落並均勻 散佈於培養液中，留下 1 / 3 體積的細胞液，補入 10 ml 培養液混合均勻，置 於培養箱繼續培養。 3.2 病毒增殖病毒增殖病毒增殖病毒增殖 3.2.1 登革熱病毒增殖登革熱病毒增殖登革熱病毒增殖登革熱病毒增殖 利用白線斑蚊細胞 ( C6/36 ) 增殖登革熱病毒 PL046 strain。將 1 x 107 的 C6/36 細胞置於 15 ml 離心管中，以 1500 rpm 離心 5 分鐘（centrifuge 5804R），去除上清液，加入適量 10 % FBS / MEM 培養液重新混勻細胞後， 加入 1 x 106 病毒 ( 病毒液與培養液的總體積為 2 ml ），即 MOI = 0.1，置 於 37 ℃，5 % CO2 培養箱中培養 2 小時，培養過程中每 20 分鐘搖一次。 將病毒與細胞混合液移入 T75 培養盤中，補入 9 ml 的 10 % FBS / MEM
培養液後，置於 28 ℃ 培養箱中，於感染後四至十二天收集含有病毒之上 清液，以 0.22 µm 孔徑的過濾膜將細胞殘渣過濾掉，最後將過濾後的病毒 液分裝到 1.5 ml 的微量離心管中，保存於 -80 ℃冰箱中。 3.2.2 日本腦炎病毒增殖日本腦炎病毒增殖日本腦炎病毒增殖日本腦炎病毒增殖 利用白線斑蚊細胞 ( C6/36 ) 增殖日本腦炎病毒 RP9 strain。將 1 x 107 的 C6/36 細胞置於 15 ml 離心管中，以 1500 rpm 離心 5 分鐘（centrifuge 5804R），去除上清液，加入適量 10 % FBS / MEM 培養液重新混勻細胞後， 加入 1 x 106 病毒 ( 病毒液與培養液的總體積為 2 ml ），即 MOI = 0.1，置 於 37 ℃，5 % CO2 培養箱中培養 2 小時，培養過程中每 20 分鐘搖一次。 將病毒與細胞混合液移入 T75 培養盤中，補入 9 ml 的 10 % FBS / MEM 培養液後，置於 28 ℃ 培養箱中，於感染後四至十二天收集含有病毒之上 清液，以 0.22 µm 孔徑的過濾膜將細胞殘渣過濾掉，最後將過濾後的病毒 液分裝到 1.5 ml 的微量離心管中，保存於 -80 ℃冰箱中。 3.3 病毒抑制試驗病毒抑制試驗病毒抑制試驗病毒抑制試驗 3.3.1 C6/36 細胞細胞細胞之細胞之之之病毒抑制試驗病毒抑制試驗病毒抑制試驗病毒抑制試驗 ( 登革熱病毒登革熱病毒登革熱病毒登革熱病毒 ) 於實驗前一天在六孔培養盤中置入 2 x 105 的 C6/36 細胞，隔天使用未含血
清之 MEM 培養液將預測試之藥物序列稀釋到不同濃度及將病毒稀釋到每 450 µl 培養液中含有 200 PFU 的病毒，將 450 µl 的藥物與 450 µl 的病毒 混合。以未含血清的 MEM 培養液清洗細胞一次，加入 900 µl 的藥物與病 毒混合液，前後左右搖晃一下，置入 28 ℃，5 % CO2 培養箱中培養 1 小 時後，吸除細胞上之藥物與病毒混合液，加入 5 ml 含有 10 % FBS 之 MEM 培養液，置於 28 ℃，5 % CO2 培養箱中培養 48 小時後，收取細胞的上清 液進行空斑試驗。 3.3.2 293T 細胞細胞細胞之細胞之之之病毒抑制試驗病毒抑制試驗病毒抑制試驗病毒抑制試驗 ( 登革熱病毒登革熱病毒登革熱病毒登革熱病毒 ) 於實驗前一天在六孔培養盤中置入 2 x 105 的 293T 細胞，隔天使用未含血 清之 MEM 培養液將預測試之藥物序列稀釋到不同濃度及將病毒稀釋到每 450 µl 培養液中含有 200 PFU 的病毒，將 450µl 的藥物與 450 µl 的病毒 混合。以未含血清的 MEM 培養液清洗細胞一次，加入 900 µl 的藥物與病 毒混合液，前後左右搖晃一下，置入 37 ℃，5 % CO2 培養箱中培養 1 小 時後，吸除細胞上之藥物與病毒混合液，加入 5 ml 含有 10 % FBS 之 MEM 培養液，置於 37 ℃，5 % CO2 培養箱中培養 48 小時後，收取細胞的上清 液進行空斑試驗。
3.3.3 293T 細胞細胞細胞之細胞之之之病毒抑制試驗病毒抑制試驗病毒抑制試驗病毒抑制試驗 ( 日本腦炎病毒日本腦炎病毒日本腦炎病毒日本腦炎病毒 ) 實驗前一天在六孔培養盤中置入 2 x 105 的 293T 細胞，隔天使用未含血清 之 MEM 培養液將預測試之藥物序列稀釋到不同濃度及將病毒稀釋到每 450 µl 培養液中含有 200 PFU 的病毒，將 450 µl 的藥物與 450 µl 的病毒 混合。以未含血清的 MEM 培養液清洗細胞一次，加入 900 µl 的藥物與病 毒混合液，前後左右搖晃一下，置入 37 ℃，5 % CO2 培養箱中培養 1 小 時後，吸除細胞上之藥物與病毒混合液，加入 5 ml 含有 10 % FBS 之 MEM 培養液，置於 37 ℃，5 % CO2 培養箱中培養 24 小時後，收取細胞 的上清液進行空斑試驗。 3.4 空斑試驗空斑試驗空斑試驗空斑試驗 3.4.1 登革熱病毒空斑試驗登革熱病毒空斑試驗登革熱病毒空斑試驗登革熱病毒空斑試驗 實驗前一天先於六孔培養盤中置入 2 x 105 的 BHK-21 細胞。病毒以未含血 清的 MEM 培養液進行序列稀釋。感染前先以未含血清的 MEM 培養液沖 洗細胞一次，並在細胞上加入 500 µl 未含血清的 MEM 培養液，加入 400 µl 序列稀釋後的病毒液後，置於 37 ℃、5 % CO2 培養箱中培養 1 小時候，
加入 4 ml 的 1.1 % methyl cellulose medium，置入 37 ℃、5 % CO2 培養箱
細胞，室溫靜置 20 分鐘，吸除甲醛後加入適量的 1 % 結晶紫溶液，室溫 靜置隔夜後，以流水沖洗培養盤，於室溫風乾後，計數空斑數目。 3.4.2 日本腦炎病毒空斑試驗日本腦炎病毒空斑試驗日本腦炎病毒空斑試驗日本腦炎病毒空斑試驗 實驗前一天先於六孔培養盤中置入 2 x 105 的 BHK-21 細胞。病毒以未含血 清的 MEM 培養液進行序列稀釋。感染前先以未含血清的 MEM 培養液沖 洗細胞一次，並在細胞上加入 800 µl 未含血清的 MEM 培養液，加入 200 µl 序列稀釋後的病毒液後，置於 37 ℃、5 % CO2 培養箱中培養 1 小時，培 養過程中每 20 分鐘搖一次。 1 小時候，加入 4 ml 的 1.1 % methyl cellulose medium，置入 37 ℃、5 % CO2 培養箱中培養約四至五天。取出細 胞後，吸除培養液，加入適量 3.7 % 甲醛固定細胞，室溫靜置 20 分鐘， 吸除甲醛後加入適量的 1 % 結晶紫溶液，室溫靜置隔夜，以流水沖洗培養 盤，於室溫風乾後，計數空斑數目。
肆 肆 肆 肆、、、、結果結果結果結果 4.1 偵測藥物在偵測藥物在偵測藥物在偵測藥物在 C6/36 細胞中對登革熱病毒二型之影響細胞中對登革熱病毒二型之影響細胞中對登革熱病毒二型之影響細胞中對登革熱病毒二型之影響 4.1.1 Tetracycline 最終藥物濃度為 0 µM、50 µM、150 µM、250 µM、350 µM。每一個藥物濃 度皆有三組重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個藥物 濃度培養皿上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所 得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，相除並乘以 百分之百，計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之三次重複所 得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再將此三組病 毒效價百分比取平均值得到在 50 µM 時為 84.95 %，150 µM 時為 13.10 %， 250 µM 時為 10.70 %，350 µM 時為 19.34 %，顯示藥物濃度在 50 µM 之 後，隨著藥物濃度增加，所得之病毒效價有降低的趨勢。IC50 約為 98.60 µM ( 表一，圖一 )。藥物濃度在 350 µM 以下，計數細胞沒有明顯的減少 ( 表 二，圖二 )。 4.1.2 Chlortetracycline 最終藥物濃度為 0µM、10 µM、25 µM、50 µM。每一個藥物濃度皆有三組
重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個藥物濃度培養皿 上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所得之病毒效 價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，相除並乘以百分之百， 計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之三次重複所得之病毒效 價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再將此三組病毒效價百分 比取平均值得到在 10 µM 時為 107.78 %，25 µM 時為 61.80 %，50 µM 時 為 15.10 %，顯示藥物濃度在 10 µM 之後，隨著藥物濃度增加，所得之病 毒效價有降低的趨勢。IC50 約為 31.31 µM ( 表一，圖三 )。藥物濃度在 51.51 µM 以上時細胞死亡率大於 20 %，對細胞有傷害性 ( 表二，圖四 )。 4.1.3 Doxycycline 最終藥物濃度為 0 µM、50 µM、150 µM、250 µM、350 µM。每一個藥物濃 度皆有三組重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個藥物 濃度培養皿上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所 得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，相除並乘以 百分之百，計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之三次重複所 得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再將此三組病 毒效價百分比取平均值得到在 50 µM 時為 15.14 %，150 µM 時為 2.15 %， 250 µM 時為 0.61 %，350 µM 時為 0.07 %，顯示藥物濃度在 50 µM 之後，
隨著藥物濃度增加，所得到之病毒效價有降低的趨勢。IC50 約為 29.48 µM ( 表一，圖五 )。藥物濃度在 350 µM 以下，計數細胞沒有明顯的減少 ( 表 二，圖六 )。 4.1.4 Rolitetracycline 最終藥物濃度為 0 µM、50 µM、150 µM、250 µM、350 µM。每一個藥物濃 度皆有三組重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個藥物 濃度培養皿上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所 得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，相除並乘以 百分之百，計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之三次重複所 得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再將此三組病 毒效價百分比取平均值得到在 50 µM 時為 88.40 %，150 µM 時為 12.99 %， 250 µM 時為 5.48 %，350 µM 時為 0.44 %，顯示藥物濃度在 50 µM 之後， 隨著藥物濃度增加，所得到之病毒效價有降低的趨勢。 IC50 約為 100.93 µM ( 表一，圖七 )。藥物濃度在 350 µM 以下，計數細胞沒有明顯的減少 ( 表 二，圖八 )。 4.1.5 Kanamycin 最終藥物濃度為 0 µM、50 µM、150 µM、250 µM、350 µM。每一個藥物濃
度皆有三組重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個藥物 濃度培養皿上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所 得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，相除並乘以 百分之百，計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之三次重複所 得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再將此三組病 毒效價百分比取平均值得到在 50 µM 時為 86.07 %，150 µM 時為 115.07 %， 250 µM 時為 127.36 %，350 µM 時為 85.59 %。IC50 數值無法取得。( 表 一，圖九 )。藥物濃度在 350 µM 以下，計數細胞沒有明顯的減少 ( 表二， 圖十 )。 4.2 偵測藥物在偵測藥物在偵測藥物在偵測藥物在 293T 細胞中對登革熱病毒二型之影響細胞中對登革熱病毒二型之影響細胞中對登革熱病毒二型之影響細胞中對登革熱病毒二型之影響 4.2.1 Tetracycline 最終藥物濃度為 0 µM、25 µM、50 µM、100 µM、150 µM。每一個藥物濃 度皆有三組重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個藥物 濃度培養皿上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所 得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，相除並乘以 百分之百，計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之三次重複所 得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再將此三組病 毒效價百分比取平均值得到在 25 µM 時為 81.91 %，50 µM 時為 64.42 %，
100 µM 時為 36.68 %，150 µM 時為 36.20 %，顯示藥物濃度在 25 µM 之 後，隨著藥物濃度增加，所得到之病毒效價有降低的趨勢。IC50 約為 63.33 µM ( 表一，圖十一 )。藥物濃度在 177.53 µM 以上時細胞死亡率大於 20 %， 對細胞有傷害性 ( 表二，圖十二 )。 4.2.2 Chlortetracycline 最終藥物濃度為 0 µM、5 µM、15 µM、25 µM、50 µM、100 µM。每一個藥 物濃度皆有三組重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個 藥物濃度培養皿上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，相除並乘 以百分之百，計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之三次重複 所得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再將此三組 病毒效價百分比取平均值得到在 5 µM 時為 70.15 %，15 µM 時為 25.70 %， 25 µM 時為 5.41 %，50 µM 時為 0.0 %，100 µM 時為 0.0 %，顯示藥物濃 度在 5 µM 之後，隨著藥物濃度增加，所得到之病毒效價有降低的趨勢。IC50 約為 9.54 µM ( 表一，圖十三 )。藥物濃度在 200.20 µM 以下，計數細胞 沒有明顯的減少 ( 表二，圖十四 )。
4.2.3 Doxycycline 最終藥物濃度為 0 µM、5 µM、15 µM、25 µM、50 µM、100 µM。每一個藥 物濃度皆有三組重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個 藥物濃度培養皿上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，相除並乘 以百分之百，計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之三次重複 所得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再將此三組 病毒效價百分比取平均值得到在 5 µM 時為 58.94 %，15 µM 時為 35.83 %， 25 µM 時為 17.99 %，50 µM 時為 3.40 %，100 µM 時為 0.56 %，顯示藥 物濃度在 5 µM 之後，隨著藥物濃度增加，所得到之病毒效價有降低的趨勢。 得到 IC50 約為 8.87 µM ( 表一，圖十五 )。藥物濃度在 216.16 µM 以下， 計數細胞沒有明顯的減少 ( 表二，圖十六 )。 4.2.4 Rolitetracycline 最終藥物濃度為 0 µM、25 µM、50 µM、100 µM、150 µM。每一個藥物濃 度皆有三組重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個藥物 濃度培養皿上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所 得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，相除並乘以 百分之百，計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之三次重複所
得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再將此三組病 毒效價百分比取平均值得到在 25 µM 時為 65.16 %，50 µM 時為 40.70 %， 100 µM 時為 6.42 %，150 µM 時為 0.88 %，顯示藥物濃度在 25 µM 之後， 隨著藥物濃度增加，所得到之病毒效價有降低的趨勢。IC50 約為 40.49 µM ( 表一，圖十七 )。藥物濃度在 212.67 µM 以上時細胞死亡率大於 20 %， 對細胞有傷害性 ( 表二，圖十八 )。 4.2.5 Kanamycin 最終藥物濃度為 0µM、25 µM、50 µM、100 µM、150 µM、250 µM、350 µM。 每一個藥物濃度皆有三組重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。 將每個藥物濃度培養皿上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子， 相除並乘以百分之百，計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之 三次重複所得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再 將此三組病毒效價百分比取平均值得到在 25 µM 時為 78.00 %，50 µM 時 為 89.25 %，100 µM 時為 85.08 %，150 µM 時為 104.58 %，250 µM 時為 81.15 %，350 µM 時為 95.02 %。IC50 數值無法取得 ( 表一，圖十九 )。藥 物濃度在 350 µM 以下，計數細胞沒有明顯的減少 ( 表二，圖二十 )。
4.3 偵測藥物在偵測藥物在偵測藥物在偵測藥物在 293T 細胞中對日本腦炎病毒之影響細胞中對日本腦炎病毒之影響細胞中對日本腦炎病毒之影響細胞中對日本腦炎病毒之影響 4.3.1 Tetracycline 最終藥物濃度為 0µM、25 µM、50 µM、100 µM、150 µM。每一個藥物濃度 皆有三組重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個藥物濃 度培養皿上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所得 之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，相除並乘以百 分之百，計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之三次重複所得 之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再將此三組病毒 效價百分比取平均值得到在 25 µM 時為 79.56 %，50 µM 時為 82.29 %， 100 µM 時為 61.92 %，150 µM 時為 58.95 %，顯示藥物濃度在 25 µM 之 後，隨著藥物濃度增加，所得到之病毒效價有些微降低的趨勢。IC50 數值無 法取得 ( 表一，圖二十一 )。藥物濃度在 177.53 µM 以上時細胞死亡率大 於 20 %，對細胞有傷害性 ( 表二，圖十二 )。 4.3.2 Chlortetracycline 最終藥物濃度為 0 µM、25 µM、50 µM、100 µM、150 µM。每一個藥物濃 度皆有三組重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個藥物 濃度培養皿上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所
得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，相除並乘以 百分之百，計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之三次重複所 得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再將此三組病 毒效價百分比取平均值得到在 25 µM 時為 34.82 %，50 µM 時為 12.75 %， 100 µM 時為 8.41 %，150 µM 時為 2.52 %，顯示藥物濃度在 25 µM 之後， 隨著藥物濃度增加，所得到之病毒效價有降低的趨勢。IC50 約為 22.65 µM ( 表一，圖二十二 )。藥物濃度在 200.20 µM 以上時細胞死亡率大於 20 %， 對細胞有傷害性 ( 表二，圖十四 )。 4.3.3 Doxycycline 最終藥物濃度為 0 µM、25 µM、50 µM、100 µM、150 µM，每一個藥物濃 度皆有三組重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個藥物 濃度培養皿上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所 得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，相除並乘以 百分之百，計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之三次重複所 得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再將此三組病 毒效價百分比取平均值得到在 25 µM 時為 288.25 %，50 µM 時為 277.71 %， 100 µM 時為 165.35 %，150 µM 時為 87.71 %，顯示藥物濃度在 0 - 25 µM 間所得到之病毒效價有上升的趨勢，25 µM 後病毒效價有下降的趨勢。。IC50
數值無法取得 ( 表一，圖二十三 )。藥物濃度在 216.16 µM 以上時細胞死 亡率大於 20 %，對細胞有傷害性 ( 表二，圖十六 )。 4.3.4 Rolitetracycline 最終藥物濃度為 0 µM、25 µM、50 µM、100 µM、150 µM，每一個藥物濃 度皆有三組重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。將每個藥物 濃度培養皿上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所 得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子，相除並乘以 百分之百，計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之三次重複所 得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再將此三組病 毒效價百分比取平均值得到在 25 µM 時為 135.29 %，50 µM 時為 195.52 %， 100 µM 時為 209.37 %，150 µM 時為 130.91 %，顯示藥物濃度在 0 - 100 µM 間所得到之病毒效價有上升的趨勢，100 µM 後病毒效價有些微下降的 趨勢。IC50 數值無法取得 ( 表一，圖二十四 )。藥物濃度在 212.67 µM 以 上時細胞死亡率大於 20 %，對細胞有傷害性 ( 表二，圖十八 )。 4.2.5 Kanamycin 最終藥物濃度為 0 µM、25 µM、50 µM、100 µM、150 µM、250 µM、350 µM， 每一個藥物濃度皆有三組重複的實驗結果，每一組之結果又得自於三次重複。
將每個藥物濃度培養皿上數得之空斑數換算成病毒效價後，以未加入藥物 ( 0 µM ) 所得之病毒效價做為分母，其他藥物濃度所得之病毒效價為分子， 相除並乘以百分之百，計算出不同藥物濃度下之病毒效價百分比。每一組之 三次重複所得之病毒效價百分比取平均值後得到三組病毒效價之百分比，再 將此三組病毒效價百分比取平均值得到在 25 µM 時為 76.56 %，50 µM 時 為 110.92 %，100 µM 時為 74.55 %，150 µM 時為 93.43 %，250 µM 時為 125.55 %，350 µM 時為 87.64 %。IC50 數值無法取得。( 表一，圖二十五 )。 藥物濃度在 350 µM 以下，計數細胞沒有明顯的減少 ( 表二，圖二十 )。
伍 伍 伍 伍、、、、討論討論討論討論 由本實驗室之前之研究得知四種四環黴素衍生物，Tetracycline、 Chlortetracycline、Doxycycline、Rolitetracycline 在幼倉鼠腎臟纖維母細胞 ( BHK-21 ) 中對於登革熱病毒二型 PL046 strain 具有抑制空斑形成的效果 ( 附表一，張，2009；附表二，杜，2007 )。根據當初篩選這些藥物的方法， 推斷這些四環黴素衍生物應該是藉由跟登革熱病毒表面之 E protein 結合，阻 止 E protein 的功能，進而達到抑制病毒感染及複製之效果。 本研究中最主要的目的是確認這些藥物是與病毒作用而非與細胞作用，達到抑 制病毒的效果。如前所述如果是與病毒作用，則使用不同細胞株應該會得到同 樣的效果。本研究中使用白線斑蚊細胞 ( C6/36 ) 與人類胚胎腎臟細胞 ( 293T ) 進行實驗，觀察這些藥物在不同細胞株中對登革熱病毒之影響。 5.1 四環黴素衍生物在四環黴素衍生物在四環黴素衍生物在四環黴素衍生物在 C6/36 細胞中對登革熱病毒二型之影響細胞中對登革熱病毒二型之影響細胞中對登革熱病毒二型之影響細胞中對登革熱病毒二型之影響 將四種四環黴素衍生物 Tetracycline、Chlortetracycline、Doxycycline、 Rolitetracycline 分別與登革熱病毒二型混合後，感染白線斑蚊細胞 ( C6/36 )， 48 小時後於細胞上層液中測定登革熱病毒效價，實驗結果顯示病毒效價皆隨 著藥物濃度增加而有減少的趨勢 ( IC50 分別為 98.60 µM、31.31 µM、29.48 µM、 100.93 µM，表一；48-hr LC20 分別為無法取得、51.51 µM、無法取得、無法 取得，表二 )，相較之下非四環黴素衍生物 Kanamycine 與登革熱病毒混合感
染 C6/36 細胞，上層液中測定之登革熱病毒效價則沒有明顯變化 ( IC50 無法 取得，表一；48-hr LC20 無法取得，表二 )。 5.2 四環黴素衍生物在四環黴素衍生物在四環黴素衍生物在四環黴素衍生物在 293T 細胞中對登革熱病毒二型之影響細胞中對登革熱病毒二型之影響細胞中對登革熱病毒二型之影響細胞中對登革熱病毒二型之影響 將四種四環黴素衍生物 Tetracycline、Chlortetracycline、Doxycycline、 Rolitetracycline 分別與登革熱病毒二型混合後，感染人類胚胎腎臟細胞 ( 293T )，於細胞上層液中測定登革熱病毒效價，實驗結果顯示病毒效價皆隨 著藥物濃度增加而有減少的趨勢 ( IC50 分別為 63.33 µM、9.54 µM、8.87 µM、 40.49 µM，表一；48-hr LC20 分別為 177.53 µM、51.51 µM、216.16 µM、212.67 µM，表二 )，相較之下非四環黴素衍生物 Kanamycine 與登革熱病毒混合感染 293T 細胞，上層液中測定之登革熱病毒效價則沒有明顯變化 ( IC50 無法取得， 表一；48-hr LC20 無法取得，表二 )。 實驗室前人 ( 張，2009；杜，2007 ) 將四環黴素藥物衍生物跟登革熱病毒二 型一起感染 BHK-21 得到抑制登革熱病毒產生空斑之結果。由於本研究與杜 氏所測的藥物不完全相同，在此只與張氏之結果做比較 ( 表三 )。發現這些 四環黴素衍生物中 Tetracycline 在 C6/36、293T 細胞中在濃度低於 150 µM 時可達到抑制 50 % 登革熱病毒效價；Chlortetracycline、Doxycycline 及 Rolitetracycline 在 BHK-21、C6/36、293T 皆在濃度低於 150 µM 時就達到抑 制 50 % 登革熱病毒效價，而在 293T 細胞中之 IC50 又比在 BHK-21 或
C6/36 中來的小，這部分推測其原因為登革熱病毒在不同細胞中之感染、複製、 組裝能力皆有所不同所造成的。在這四種四環黴素衍生物中 Chlortetracycline 及 Doxycycline 之抑制效果較強，推測因為這兩個藥物結構上之氫鍵效應使 構型產生摺角而更適合與登革熱病毒 E protein 結合，所以相較於 Tetracycline 與之結合能力較強。Rolitetracycline 因為結構上帶有一個較大側 鏈，推測由於這個大的側鏈造成 Rolitetracycline 與登革熱病毒二型 E protein 結合能力較不佳 ( 圖二十六 )。 由於這些四環黴素衍生物不論是在幼倉鼠腎臟纖維母細胞 ( BHK-21 )、白線 斑蚊細胞 ( C6/36 ) 或是人類胚胎腎臟細胞 ( 293T ) 中對於登革熱病毒二型
PL046 strain 都是有抑制的效果，且 chlortetracycline 及 doxycycline 相較於
tetracycline 及 rolitetracycline 抑制效果較好這部分在三種細胞株也相同。顯 示更換細胞株並不改變這些四環黴素衍生物對登革熱病毒的抑制效果，推論這 些藥物並非針對 BHK-21 細胞有抑制作用且有極大的機會應是與病毒本身作 用。 由於當初篩選藥物時是針對登革熱病毒進行的，為了瞭解這些藥物的專一性， 並更進一步說明藥物與細胞中核醣體結合而達到抑制效果的可能性，本研究使 用同樣是黃質病毒的日本腦炎病毒在 293T 細胞中進行相同之實驗。 5.3 四環黴素衍生物在四環黴素衍生物在四環黴素衍生物在四環黴素衍生物在 293T 細胞中對日本腦炎病毒之影響細胞中對日本腦炎病毒之影響細胞中對日本腦炎病毒之影響細胞中對日本腦炎病毒之影響 將 Tetracycline、Chlortetracycline、Doxycycline、Rolitetracycline、Kanamycin 這
五種藥物與日本腦炎病毒混合，感染 293T，於細胞上層液中測定登革熱病毒 效價，實驗結果得到日本腦炎病毒效價皆不同。其中 Tetracycline 濃度增加時 日本腦炎病毒效價並沒有觀察到明顯減少的趨勢，IC50 無法取得；而 Chlortetracycline 濃度增加時日本腦炎病毒效價有觀察到明顯減少的現象 ( IC50 = 22.65 µM )；Doxycycline 及 Rolitetracycline 則是觀察到隨著藥物濃度 增加日本腦炎病毒效價有先上升後下降的情形，但 IC50 無法取得； Kanamycine 對日本腦炎病毒效價並沒有明顯的影響 ，IC50 無法取得 ( 表 一 )。 基於原本篩選藥物時，是針對登革熱病毒二型 ( DV2 ) 外膜蛋白之疏水性口 袋。實驗室前人張氏將這四種四環黴素衍生物與不同血清型之登革熱病毒三型 ( DV3 ) 一起感染 BHK-21 細胞觀察空斑的抑制情形，其結果顯示 Tetracycline 在 BHK-21 細胞對於抑制 DV2 與 DV3 並沒有明顯差異； Chlortetracycline、Rolitetracycline 及 Doxycycline 在 BHK-21 細胞中對 DV2 的抑制效果較 DV3 佳。比較 DV2 與 DV 3 外膜蛋白之疏水性口袋周圍的 胺基酸，有 6 個位置之胺基酸不同 ( DV2 之 51、272、274、276、277 及 278 號胺基酸；DV3 之 51、270、272、274、275 及 276 號胺基酸 )，推測為四 環藥物衍生物對 DV2 抑制效果較佳的原因 ( 張，2009 )。 本研究中將這四種四環黴素衍生物與同為黃質病毒的日本腦炎病毒 ( JEV ) 一起感染 293T 細胞，收取上層液觀察藥物對 JEV 效價之影響。由於 DV2
與 JEV 外膜蛋白之疏水性口袋周圍的胺基酸只有 7 個胺基酸相同 ( 表四， 附圖七 )，且其 3D 結構中，在 domain I 與 domain II 之間的疏水性口袋沒 有很高的相似度 ( 表四，附圖七，附圖八 )，推測這四種四環黴素衍生物應 對 JEV 效價不會有影響。本研究之結果中 Tetracycline 符合預期，在細胞未 受傷害之濃度內並沒有觀察到明顯的抑制效果；Doxycycline 與 Rolitetracycline 在低濃度時觀察到 JEV 效價有增加的趨勢，推測其原因為， 293T 細胞在這兩種藥物的環境壓力下改變了細胞生理狀況或病毒感染複製 的情形；Chlortetracycline 在 293T 細胞中對 JEV 則是有顯著的抑制效果， 與預期不相符合，推測 Chlortetracycline 對 JEV 的抑制機制不在疏水性口袋 上，可能在 JEV 外膜蛋白的其他地方有相結合的地方，其機制還需要進一步 做研究。
陸 陸 陸 陸、、、、結論結論結論結論 根據所有的實驗結果，更換細胞株不會影響 Tetracycline、Chlortetracycline、 Doxycycline 、Rolitetracycline 這四種四環黴素衍生物對於登革熱病毒的抑制 效果，初步得知其抑制機制應是針對病毒而非細胞。其中 Chlortetracycline 與 Doxycycline 對登革熱病毒二型的抑制效果較佳，原因可能為其結構上的便利。 另外，Tetracycline、Doxycycline 及 Rolitetracycline 對日本腦炎病毒沒有顯著 抑制效果，初步推測他們對登革熱病毒之抑制能力是具有專一性的； Chlortetracycline 在 293T 細胞中對日本腦炎病毒也有抑制的效果，其機制應 與抑制登革熱病毒之機制不同，但詳細的作用機制還需要更進一步的了解。由 於這四環黴素衍生物是已廣為使用的抗細菌藥物，若能深入了解其對登革熱病 毒二型的抑制機制及抑制濃度，則非常有潛力成為抗登革熱病毒二型的藥物。
台灣疾病管制局，Taiwan CDC <http://www.cdc.gov.tw/> 杜育穎 杜育穎 杜育穎 杜育穎. 2007. 以四環素及其衍生物為第二型登革熱病毒之抑制劑. 國立交通大學碩士論文. 張瀞云 張瀞云 張瀞云 張瀞云. 2009. 表現登革熱 2 型病毒 NS2, NS4 基因及探討四環黴素衍生物對登革熱病毒的 抑制作用. 國立交通大學碩士論文.
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表 表 表
表一一一一 Tetracycline、、、、Chlortetracycline、、、、Doxycycline、、、、Rolitetracycline 及及及及 Kanamycin 在在在在 C6/36 及
及 及
及 293T 細胞中對登革熱病毒二型之細胞中對登革熱病毒二型之細胞中對登革熱病毒二型之細胞中對登革熱病毒二型之 IC50 與在與在與在與在 293T 細胞中對日本腦炎病毒之細胞中對日本腦炎病毒之細胞中對日本腦炎病毒之細胞中對日本腦炎病毒之 IC50。。。。 Name：藥物名；IC50：抑制 50 % 病毒效價時之藥物濃度；NA：無法取得 ( not applicable )；
