由於鰻魚奇特的生活史，一直以來對鰻魚的生態都是個謎，其在演 化上屬於低等原始脊椎動物。鰻魚與鮭魚的習性相反，其會在河川中長 大且成熟後洄游到海洋中產卵。從卵中孵化出的幼苗，最先形成柳葉鰻 (letocephalus)、而後變態為玻璃鰻 (glass eel)、往後為鰻線 (elvers)、黃鰻 (yellow eel)，最後再次變態為銀鰻 (silver eel)，待成熟後洄游降海產卵 (Tzeng et al., 2000)。這樣循環的生活史中，伴隨著許多生理機能及外觀 上變態的改變。其中，解剖型態上最為明顯的變化為雌鰻卵巢的發育，
而由於血管新生作用被誘發，進而使微血管絲佈滿卵巢葉面且明顯可見 (Muller et al., 2004)。然而，另一個血管新生作用旺盛的組織為一氣囊腺 (亦稱紅體, rete mirabile)，為控制氣體分泌及調節深海壓力環境的器官。
其主要由許多動脈及靜脈微血管網組成，然而，降海繁殖時需調節氣囊 增大以應對深海環境，此時紅體組織亦會隨之增長 (Yamada et al., 2001)，日本鰻發育中氣囊腺體紅體組織的質量會與年齡增長呈正相關，
尤其與日本鰻成長階段 (銀鰻，黃鰻) 相關性大，黃鰻紅體組織質量大小 皆比銀鰻小 (Kleckner, 1980; Yamada et al., 2004)，在人工催熟的日本鰻中 亦有相同的現象 (Yamada et al., 2001)。第二，紅體組織的組成中含大量 顯著的內皮細胞 (Krogh, 1959, cited by Wanger et al., 1987, therein)，已有 文獻指出紅體的內皮細胞總量及密度會隨著年齡或是生殖階段而增加，
且其他種類的細胞數會相對被降低 (Kleckner, 1980 ; Bendayan and Rasio, 1997 ; Yamada et al., 2001 ; Huang et al., 2006)。第三，鰻魚爲亞洲重要經 濟養殖魚種之一，然而在一般飼養狀態下，其性腺無法發育。故現階段 鰻魚人工繁殖是將雌鰻以人工催熟的方式使其卵巢 GSI從1.5% 發育至
30-40%，卵巢長滿腹腔兩側使腹腔明顯腫大。然而，在日本鰻人工繁殖 所面臨的問題中，其中有一部分的原因是由於卵細胞發育不同步，所以 我們推測可能為營養或激素獲得不均造成。且卵巢的血管新生對於卵巢 中濾泡成熟以及黃體生成是相當重要的 (Shimizu et al., 2003 ; Kaczmarek et al., 2005)。第四，鰻魚在動物史中被認為是相當接近脊椎動物的起源，
故此研究可以提供一些有關於原始硬骨魚類在調控發育的相關訊息。基 於以上幾點特質，藉由利用外源激素促性腺成熟與紅體發育的實驗，研 究原始硬骨魚類中組織發育與血管新生相互作用的關係。
二、材料與方法
2.1 實驗動物與馴養環境
本實驗所使用的鰻魚購自鰻魚養殖場。為生長二至三年的日本鰻 (Anguilla japonica)。實驗前先馴養在鹽度為 21-23 PPT 的海水中二星期，
不餵食。將鰻魚植入晶片後隨機分組，分別以不同激素處理進行各項實 驗。
2.2 激素及藥品製備
2.2.1鯰魚腦下垂體萃取液(Catfish Pituitary Exacts,CPE)
購自當地養殖場的泰國鯰魚腦下垂體(每顆約 4.2 mg，保存於丙酮 中)，將其磨碎後，與食鹽水溶液混合均勻後，以低速離心去除沉澱。鰻 魚接受的劑量約2 顆腦下垂體/每公斤魚重。
製作流程為：
*依處理樣本量加入食鹽水磨碎所需個數鯰魚腦下垂體後，置入 15ml 離 心管。24℃下，離心 4500rpm ; 5 min，取上清液用於注射。
2.2.2人類絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropins, HCG)
人 類 絨 毛 膜 促 性 腺 激 素 購 自 Intervet Co. (Chorulon,. Intervet International BV Box meer Holland)，以食鹽水 (PBS) 溶解 HCG，注射劑 量200 IU/每公斤魚重。
2.2.3吳郭魚類胰島素生長因子-1(Tilapia Insulin-Like growth factor-1)
* 來源：吳郭魚 IGF-1 (純度 90%，由中央研究院吳金冽老師慷慨提供) Stock 配製：取 1mg 溶於 0.9ml PBS，濃度為 1μg/μl
實驗濃度：取 4μl Stock 溶於 996μl PBS，濃度為 4ng/μl
反應最終濃度：6-well 培養盤中，每個 well 含 2ml 培養液，故每 well 添加 10μl 使最後反應濃度為 20ng/ml
2.2.4胰島素生長因子(Insulin)
* 來源：購自 Sigma Co. (小牛胰臟純化)
Stock 配置：取 1mg 溶於 1ml PBS，濃度為 1μg/μl 實驗濃度：取 4μl Stock 溶於 996μl PBS，濃度為 4ng/μl
反應最終濃度：6-well 培養盤中，每個 well 含 2ml 培養液，故每 well 添加 50μl 使最後反應濃度為 100ng/ml
2.2.5胰島素增敏劑 (Troglitazone)
* 來源：購自 CALBIOCHEM
Stock 配置：取 5mg 溶於 5ml DMSO，濃度為 2mM 實驗濃度：取 5μl Stock 溶於 2ml 培養液
反應最終濃度：6-well 培養盤中，每個 well 含 2ml 培養液，故每 well 濃度為5μM。
2.3 組織與細胞樣品
將實驗鰻以0.05%二苯氧基乙醇 (2-phenoxyethanol) 麻醉，固定於解
剖盤上進行解剖。依實驗需求取得目標組織，如卵巢、紅體、肝臟、腎 臟、眼睛。
2.3.1紅體、眼球及肝細胞的取得
在三角錐瓶中混合胰凝乳蛋白脢 (chymotrypsin，0.25mg/ml)、膠原蛋白 脢 (collagenase，0.25mg/ml)於 1x 分解脢 (dispase)中(總體積 20ml)，再 經由0.2μm的無菌過濾膜至 50ml離心管後，置於冰上備用。在PBS中使 用滅菌解剖剪將組織剪成細碎狀後，放入配置好的酵素混合液中，反應 條件為4℃過夜 (overnight) 作用。倒除酵素並以少量PBS清洗碎片組織 之後，吸除PBS並加入 5ml M199 培養液，以 1ml針筒(拔除針頭部分)沖 刷細胞，再以過濾網(0.5mm)過濾，反覆三次置入 15ml離心管，以 4℃下 離心4000rpm，10min。倒除上清液並以含 10%胎牛血清培養液(M199) 打散細胞且補至15ml，最後將細胞液倒入 75cm2細胞培養瓶，完成細胞
中，輕搖使覆蓋培養瓶底部後開始拍打三分鐘，過程中以倒立顯微鏡觀 察細胞切除的狀態調整酵素作用的時間，經酵切可見細胞漂浮於液面 後，立即加入10% 胎牛血清培養液 5~6ml中止酵素活性 (於冰上作業)，
均勻混合後倒入15ml離心管並以PBS將總體積補至 15ml。而後，使其在 4℃下離心 4000rpm、8 分鐘，離心後吸除上清液並加入 3~4ml 10%胎牛 血清打散細胞(此處添加量以細胞量及實驗設計而定)。取出 100μl的細胞 懸浮液與100μl的trypan blue均勻混合，取出混合後的細胞 10μl放入細胞 計數器(hemacytometer)中，以顯微鏡觀察細胞數量，並計算細胞計數器 生殖腺重指數(Gonado-Somatic Index ; GSI)
*GSI (%) = 100×(生殖腺重/體重) 紅體重指數(Rete Mirabile Index ; RMI)
*RMI (%) = 100×(紅體總重/體重) 肝臟重指數(Hepatosomatic index ; HIS)
*HIS (%) = 100×(肝臟總重/體重)
2.7 組織全 RNA 的抽取
將約60mg的組織放入 1.5ml eppendorf中，加入 1ml TRI® Reagent，
於冰上以研磨棒將組織完全磨碎後，以12000rpm，4℃的條件離心 10 分 鐘。使用微量滴管取上清液，移入新1.5ml eppendorf中，加入 200μl氯仿，
輕輕搖晃混合均勻且靜置於室溫10 分鐘後，以 12000rpm，4℃離心 15 分鐘。此時上層為水相(內含RNA)，下層為有機相，兩相之間有白色的蛋 白質層且包含DNA，小心地吸取上清液，移入新 1.5ml eppendorf中，加 入500μl異丙醇混合均勻後，以同樣條件離心 10 分鐘。移去上清液，以 液並以PBS沖洗兩次。6-well的培養盤中，每個well加入 700μl的RX buffer(每一毫升的RX buffer含有 10μl的β-mercaptoethanol)，輕輕敲打後靜 置5 分鐘。將作用後的RX混合液吸取至 1.5ml微量離心管後，加入同體 積(700μl)75%酒精(需以高純度酒精配置)並均勻混合，將混合液置入Total
RNA Mini column中，而後反應於室溫下離心 13000rpm、1 分鐘(此步驟 需重覆兩次，因一次吸入column量最多只能 700μl)。離心後倒除下清液，
加入0.5ml WF buffer反應於室溫下離心 13000rpm、1 分鐘(WF的作用為 使RNA鍵結於column)。離心後倒除下清液，加入 0.7ml WS buffer反應於 室溫下離心13000rpm、1 分鐘(WF的作用為沖刷非鍵結於column的物 質)。離心後倒除下清液，空管反應於室溫下 13000rpm、3 分鐘後(此步驟 目的在於更完全去除酒精成分)，將column放入新的 1.5ml 微量離心管中 並加入10μl的RNase-free ddH2O(盡量加至column中央)，靜置 1 分鐘後反 應於室溫下離心9000rpm、2 分鐘。離心後的下清液即為細胞全RNA，需 置於-70℃下保存。
2.9 cDNA 的製備
取出2μl RNA溶液並以二次水稀釋二百倍，以分光光度計量測 260nm 與 280nm UV 波 長 吸 光 值 ， 計 算 出 RNA 的 濃 度 (RNA 量 μg/ml=
O.D.260×40×稀釋倍數)。個別算出含有 5μg RNA所需的RNA溶液體積，
以 規 格 化 (Normalize) 所 有 的 樣 本 ， 利 用 SuperScript™II Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen Corporation, USA)透過反轉錄合成所有mRNA 的First-strand cDNAs：首先在RNase-free之 250μl PCR eppendorf 中依序 加入 5μg total RNA後，用滅菌水將總體積補至 11μl，最後加入 1μl Vial8(Roche)引子及 1μl dNTP mix，將此反應溶液混合均勻後，置於PCR 反應器中以65℃加熱 5 分鐘後，快速置於冰上冷卻 1 分鐘後，加入 4μl 5X First-strand buffer、2.5μl 0.1M DTT及 0.5μl SuperScript™II RTase(總反應體
積 20μl)，混合均勻並短暫離心後於PCR 反應器中，反應條件為 42℃反 應 52 分鐘，70℃反應 15 分鐘。最後產物即為First-strand cDNAs，可用 於基因選殖及聚合脢連鎖反應的模板。
若有條帶出現則進行切膠純化(Viogene Gel-M Kit)
↓
以 yT&A 載體進行 T-A 選殖
(Invitrogen TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen Co., USA).
↓
2.排除可能在相同位子大小的條帶是由單一引子 Forward 3’RACE 實驗(Roche Applied Science, Germany)。
其中日本鰻PTEN 基因選殖的引子是由斑馬魚的序列(GeneBank accession number : CAD60625)中設計出，引子序列為：
Forward: 5'-GATGACGTCGTTCGGTTTCTGG-3' Reverse: 5'-GGTAATGATCCGGCTCGTTGTC-3'
反 應 條 件 為 ： 94℃,2 分 鐘 (denaturing),1 cycle ; 94℃,30 秒 (denaturing),55℃,30 秒 (annealing),72℃,1 分 鐘 (elongation),30 cycle ; 72℃,15 分鐘,1 cycle。
2.11 PTEN 5’/3’RACE
2.11.1 PTEN 5’RACE
首先，設計三段特異性 Reverse 引子(sp1、sp2、sp3)，以 sp1 為反轉 錄作用引子製作特異性基因 PTEN cDNA，以 Viogene Gel-M Kit 純化 cDNA(20μl)後，放置於 94℃,3 分鐘反應再置入冰中反應 1 分鐘。接著以 尾端轉移脢(Invitrogene TdT recombinant)進行加 A 反應，反應條件為 37℃,30 分鐘、70℃,10 分鐘後置入冰中。最後，以引子 sp2 及 OligodT15
進行第一次PCR 反應，以 sp3 及 OligodT15 進行第二次 PCR 反應。往後 步驟如同2.10 選殖基因方法。
2.11.2 PTEN 3’RACE
首先，設計特異性 Forward 引子，以全組織 RNA 所轉錄的 cDNA 為 模板，接著以Vial 9 和特異性 Forward 引子進行 PCR 反應。往後步驟如 同2.10 選殖基因方法。
2.11.3 Primers
PTEN Long form-Like 5’RACE primer Sp1: 5'- CTGAACCCGTGTGGAATCTGC -3' Sp2: 5'- CACGCTCCGAGCTCTCGATTC -3'
PTEN Short form-Like 5’RACE primer Sp1: 5'-CCCGTAGAAGTCGAGCGCCGTCCTG-3' Sp2: 5'-AGTGGAATGGCGGCCACGTGATTGG-3' Sp3: 5'-GTTGTGGTCTTCAAACGGGTACTGTGCA-3'
PTEN Long form-Like 3’RACE primer
long PTEN F：5’-GCAGATTCCACACGGGTTCAG-3’
PTEN Short form-Like 3’RACE primer
Short PTENf：5’-GGCTGCTTCCTCCCCTCGAGC-3’
2.12 RT-PCR (reverse transcriptase PCR) 分析表現量
將不同處理的實驗鰻或實驗細胞抽取全RNA 逆轉錄為 cDNA 後，以 cDNA 為模板及欲分析基因的專一性引子經由 PCR 反應提升樣品濃度以 進行分析。PCR 反應產物經 DNA 電泳分析後，利用 Ezlab 膠片影像分析 軟體比較實驗組與對照組之間表現量差異。其中，以cytochrome b 作標 準基準基因(Internal standard)。最後，以 Sigma Plot 軟體進行數據分析。
分析基因各設計引子為：
VEGF(F12 , R340)
F12：5’-ATGAACTTTGCTGCCAGCTTG-3’
R340：5’-AATTGTGTTGCGTCACATGC-3’
PTEN Long form-Like(pf , long PTEN R)
pf：5’-GATGACGTCGTTCGGTTTCTGG-3’
long PTEN R：5’-CTGAACCCGTGTGGAATCTGC-3’
PTEN Short form-Like(pf , pr)
pf：5’-GATGACGTCGTTCGGTTTCTGG-3’
pr：5’-GGTAATGATCCGGCTCGTTGTC-3’
FLK-1(Eflk-1 F3016 , Eflk-1 R3307)
Eflk-1 F3016：5’-TTATCGTGGAATTCTGCAAGTATGG-3’
Eflk-1 R3307：5’-AGAACTCCATGCCTTTAGCCACTT-3’
Cytochrome b(eelcytb rv , eelcytb fw)
eelcytb rv：5’-GTAAAGGTATGAGCCGTAGTAAAG-3’
eelcytb fw：5’-CACAAATCCTTACAGGACTATTCC-3’
IGF-1(Ea1F , Ea1R)
Ea1F：5’-GAGACCCTGTGTGGGGCA-3’
Ea1R：5’-TTCTGATGCACCTCCTTCTGGGTT-3’
2.13 卵巢石蠟組織切片染色
2.13.1 石蠟包埋
2.13.1.1 將部份組織浸泡於固定液中(Bouin’s fluid)過夜
(overnight)，存放於 4℃。隔天，使用 50%酒精洗滌數次 之後浸泡於50%酒精 4 小時且放置平衡儀搖晃(此步驟目 的為移除苦味酸(Picric acid)以防傷害組織)，完成後儲存於 70%酒精中。
2.13.1.2 進行修片(Trimming)步驟，修整組織厚度為 3mm 後置於脫 水器內充分水洗。
2.13.1.3 脫水(Dehydration)步驟，以 70%酒精浸泡 1 小時、80%酒 精浸泡1 小時、95%酒精浸泡 1 小時、100%酒精浸泡 50min(因酒精會使組織皺縮或變形，因此不能浸泡於高濃 度久經過久，尤其是100%酒精)，以上皆需放置平衡儀搖 晃。
2.13.1.4 清洗(Cleaning)步驟，使用二甲苯(Xylene)浸泡組織於室溫 1 小時以脫除酒精部份，且二甲苯可溶於石蠟中。
2.13.1.5 浸潤(Infiltration)步驟，將浸泡二甲苯於室溫 1 小時的組織 換至65℃二甲苯中浸泡 1 小時，之後，換至二甲苯：石蠟 (1：1)的比例混和液中於 65℃浸泡 1 小時，最後，換至全 蠟中於65℃浸泡 1 小時(次步驟為使用硬石蠟(溶點
52~62℃)，若石蠟過熱，組織與石蠟將產生裂痕)。
52~62℃)，若石蠟過熱，組織與石蠟將產生裂痕)。