4.6 VEGF與PTEN之表現比值與卵徑分佈之關聯
鰻魚爲亞洲重要經濟養殖魚種之一，在一般飼養狀態下，其性腺無 法發育完全。故現階段鰻魚人工繁殖是將雌鰻以人工催熟的方式使其卵 巢GSI從1.5% 發育至30-40%，如此刺激卵巢成熟進而排卵。哺乳類動物 中卵巢的濾泡細胞受到HCG的刺激後會分泌VEGF (Lee et al., 1997)，且 PTEN與VEGF的相互作用可調控血管新生(Huang and Kontos, 2002)。然 而，在日本鰻人工催熟的過程中，最主要的的問題之一就是卵質不均的
升的確可刺激血管新生，並藉由血管提供組織細胞獲得營養，但此時 PTEN 表現量亦上升則會抑制了組織或細胞的增生，因而使得卵徑分佈 略集中於初始大小;我們結果顯示PTEN 的表現量下降且VEGF表現量同 時上升時，卵均質度最佳，與我們的推測相符; 然而PTEN 表現量下降雖 可促使細胞或組織的增生，但若VEGF表現量亦下降，則將使細胞或組織 缺乏營養和激素的來源。我們經由分析卵截面積大小分佈與VEGF及 PTEN表現量的關係大致得到四種分佈型態：
1.PTEN ↑,VEGF↓(圖54,卵徑分佈僅集中於初始大小,有萎縮現象) 2.PTEN ↑,VEGF↑(圖54,卵徑分佈略集中於初始大小)
3.PTEN ↓,VEGF↑(圖54,平均卵徑雖為次大但分佈較為集中，推測此型最 適催熟)
4.PTEN ↓,VEGF↓(圖54,平均卵徑最大，但分佈過廣，均質度差)
根據以上結果觀察到卵均質度與 PTEN 和 VEGF 表現量的微妙關係 以及兩者動態平衡在調控卵細胞大小上可能扮演重要的角色。總合以 上，我們推論在原始脊椎動物中，組織與細胞發育似乎受到 VEGF/PTEN 比值平衡關係的影響。
五、結論
1. 選殖出日本鰻 PTEN Long- and Short form 基因。
2. 在離體實驗中，PPARγ agonist (Troglitazone 在哺乳類中已被證實可刺 激PTEN 表現) 不僅刺激日本鰻 PTEN 表現量增加，同時也抑制了 VEGF 的表現。
3. 離體實驗結果顯示，PTEN 表現量似乎受到 IGF-1 的負調控，雖然目 前IGF-1 並無直接證據顯示是否會影響 PTEN 基因表現。
4. CPE 催熟實驗中，卵巢組織增長與 PTEN 表現量呈負相關，與 VEGF 表現量呈正相關。紅體組織增長亦與PTEN 表現量呈負相關，但 VEGF 表現量在催熟後期被抑制，同時Flk-1 表現量亦被抑制。因此，我們 推測PTEN 對於卵巢與紅體組織生長較 VEGF 有顯著的關聯。
5. 我們推測鰻魚 VEGF 和 PTEN 的相互關係影響其卵巢與紅體組織發 育，其中VEGF/PTEN 比值可用於表示其生長狀態。
六、未來展望
1. 構築 PTEN Long form-Like、PTEN Short form-Like 及 VEGF 表現載 體，研究不同 PTEN 如何影響細胞功能。
2. 純化 VEGF 重組蛋白，以期利用於鰻魚人工繁殖，包含卵質改善與促 進幼苗發育。
七、圖表
來源：Nick and Peter,2004
圖1、人類PTEN蛋白
人類PTEN蛋白一共有403個胺基酸。其中包括兩個必要活性區：N端去磷 酸脢活性區(7~185胺基酸)及C2活性區(186~351胺基酸)。在磷酸化活性區 中參與氧化還原反應的Cystein胺基酸分別位於71及124號位子，而其前端 為PtIns(4,5)P2 結合位。在C端最後有一段PDZ結合位且其與C2活性區之 間具有磷酸化活性。
來源：Das et al., 2003
圖2、藉由磷酸化調控PTEN活性的示意圖
PTEN去磷酸化反應使其蛋白上裸露之正電可與細胞內膜酸性磷酸脂負 電形成結合，有助於PDZ活性區進行蛋白與蛋白間的相互作用。反之，
磷酸化反應將造成PTEN蛋白自身電性屏蔽，導致PTEN蛋白留置於細胞 質中且PDZ活性區無法裸露作用。
圖3、人類PTEN啟動子
人類PTEN啟動子上遊約10kb處之兩個PPARγ的鍵結位。
六、參考文獻
Gene mRNA expression(arbitrary unit)
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
CTL 1 Month 2 Month
圖4、處理HCG兩個月之鰻魚卵巢組織VEGF表現量。
卵巢中VEGF表現量在處理HCG兩個月期間有先升後降的趨勢。其中，控
制組表現量為0.18±0.03(Mean±S.D., n=6)、第一個月表現量相對控制組
增加2.3倍(0.42±0.12，Mean±S.D., n=6)、第二個月表現量相對控制組
增加1.2倍(0.22±0.03，Mean±S.D., n=6)。
Gene mRNA expression(arbitrary unit) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
CTL 1 Month 2 Month
圖5、處理HCG兩個月之鰻魚紅體組織VEGF表現量。
紅體組織中VEGF表現量在處理HCG兩個月期間有先降後升的趨勢。其
中，其中，控制組表現量為0.38±0.04(Mean±S.D., n=6)、第一個月表現
量相對控制組增加0.73倍(0.28±0.02，Mean±S.D., n=6)、第二個月表現
量相對控制組增加0.92倍(0.35±0.07，Mean±S.D., n=6)。
0 16.1
2 4
6 8
10 12
14 16
Human Mouse.pro
Gallus.pro
Zebrafisha.pro protein Long form-like.PRO
Zebrafishb.pro protein Short form-like.pro
圖6、PTEN物種親緣性樹狀圖
DQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTI protein Long f DQWLSEDTNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFPKAQDALDFYGEVRTTDKKGVTI protein Short DQWLSEDENHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRKKFAEAQEALDFYGEVRTRDKKGVTI Zebrafisha.pro DKWLSENDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFKKAQEALDFYDEVRTRDKKGVTI Zebrafishb.pro DQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTI Mouse.pro
LSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTI Gallus.pro DQW
圖7、PTEN相對不同物種胺基酸比對圖
PSQRRYVYYYSYLLKNQLEYKPAALLFHKMVFETVPMFSGGTCRDTAVKNKSVQIPHGFR protein Long f PSQRRYVLYYSFLLKNQLDYKPVALLFHKMMFETVPMFSGGTC--- protein Short RRYVYYYSYLLKNKLDYKPVALLFHKMVFQTLPMFSGGTCRDSTVKNRSEVNPQGFK Zebrafisha.pr
PSQ o
PSQRRYVYYYSYLLRNKLEYKPVALLFHKMVFETVPMFSGGTC--- Zebrafishb.pro PSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTC--- Mouse.pro PSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTC--- Gallus.pro
KGNWHWDPQFVVYQLKVKIHTSNPAHTRREDKYMFFEFPQPLPVCGDIKVEFFRKQNKMM protein Long f ---NPQFVVYQLKVKIHTSNPMHTRREDKYLFFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMM protein Short KGSWHWDPQFVVYQLKVKIHTSNPAHTRREEKHMIFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQSKMM Zebrafisha.pro ---NPQFVVYQLKVKIHTSNPAHTRREEKYMFFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMM Zebrafishb.pro ---NPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKML Mouse.pro ---NPQFVVYQLKVKIFTSPSGPSRREDKYMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKML Gallus.pro
KKDKMFHFWVNTFFIPGPEENSEKVENGSLV--KE--- protein Long f KKDKMFHFWVNTFFIPGPEENFERMESGSLLREMEGL--- protein Short KKDKMFHFWINTFFIPGPEEAGDKVENGSVVNDVDSLSCQSQSSPAERDREKERAVAAAA Zebrafisha.pro KKEKMFHFWVNTFFIPGSEESTEKVENGGLV--KD--- Zebrafishb.pro KKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLC-DQE--- Mouse.pro KKDKMFHFWVNTFFI-GLDENSDKVENGSLVADQE--- Gallus.pro
LDGIQSSERGENDKEYLILALTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNSEA protein Long f ---LPPLERAD-DRDYLILSLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLFFTKTVEELSNSDA protein Short LDRERGEQRADGEKDYLILTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNSEA Zebrafisha.pro LDGIQTAERGENDKDYLILTLSKTDLDKANKDKANRYFSPNFKVKMFFTKTVEEPSNSEA Zebrafishb.pro IDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEA Mouse.pro LDGIFSTERSDNDKEYLILTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLFFTKTVEEPSNPEA Gallus.pro
STSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEEQHTQITKV protein Long f STSASITPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDAENYLFDEEQHVQITKV protein Short STSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEEQHAQITKV Zebrafisha.pro STSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEQYDEE---QITKV Zebrafishb.pro SSS
SSS
TSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHSQITKV Mouse.pro TSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV Gallus.pro Decoration 'Decoration #1': Shade (with black at 10% fill) residues that m
0% 0.1% 0.5% 1% 5% 10%
血 清 濃 度
VEGF mRNA expression
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
圖8、鰻魚眼球細胞以不同血清濃度測試結果
分別在0%、0.1%、0.5%、1%、5%、10%不同血清濃度條件下，以VEGF 表現量作為測試基因，進而挑選最佳實驗血清濃度。
CTL 20 100 IG F-1濃 度 (ng/m l)
Gene mRNA expression
0 1 2 3 4
圖9、鰻魚眼球細胞以不同濃度IGF-1測試結果
分別以20ng/ml及100ng/ml作為實驗濃度，以PTEN Short form-Like表現量 作為測試基因，進而選擇較佳反應濃度及藥物毒性測試。
CTL 200 1000 Insulin濃 度 (ng/m l)
Gene mRNA expression
0 1 2 3
圖10、鰻魚眼球細胞以不同濃度Insulin測試結果
分別以200ng/ml及1000ng/ml作為實驗濃度，以PTEN Short form-Like表現 量作為測試基因，進而選擇較佳反應濃度及藥物毒性測試。
CTL 5 10 20 30 50 Troglitazone濃 度 (μΜ )
Gene mRNA expression
0 1 2 3 4
圖11、鰻魚眼球細胞以不同Troglitazone濃度測試結果
分別在0、5、10、20、30、50μM不同Troglitazone濃度條件下，以PTEN
Short form-Like表現量作為測試基因，進而挑選最佳實驗濃度。
CTL 6 12 16 20 24 Time (hr)
Gene mRNA expression
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
* *
* *
*
圖12、以20ng/ml IGF-1進行24小時定時觀察VEGF表現量之變化
20ng/ml IGF-1濃度進行實驗，分別在0、6、12、16、20、24小時定時分
析VEGF表現量之變化。實驗數據計算的表示方法為平均值±平均標準誤
差(mean±SEM)，實驗數據結果以Student’s t-test分析統計(SigmaPlot
2000,USA)。P<0.05(P value)時視為有統計上的差異，
*
表P<0.05。CTL 6 12 16 20 24 Time (hr)
Gene mRNA expression
0 1 2
* *
* *
圖13、以20ng/ml IGF-1進行24小時定時觀察PTEN Short form-Like表現量 之變化
20ng/ml IGF-1濃度進行實驗，分別在0、6、12、16、20、24小時定時分
析PTEN Short form-Like表現量之變化。實驗數據計算的表示方法為平均
值±平均標準誤差(mean±SEM)，實驗數據結果以Student’s t-test分析統計
(SigmaPlot 2000,USA)。P<0.05(P value)時視為有統計上的差異，
*
表P<0.05。
CTL 6 12 16 20 24 Time (hr)
Gene mRNA expression
0 1 2
* *
圖14、以10μM Troglitazone進行24小時定時觀察VEGF表現量之變化
10μM Troglitazone濃度進行實驗，分別在0、6、12、16、20、24小時定
時分析VEGF表現量之變化。實驗數據計算的表示方法為平均值±平均標
準誤差(mean±SEM)，實驗數據結果以Student’s t-test分析統計(SigmaPlot
2000,USA)。P<0.05(P value)時視為有統計上的差異，
*
表P<0.05。CTL 6 12 16 20 24 Tim e (hr)
Gene mRNA expression
0 1 2
*
* *
圖15、以10μM Troglitazone進行24小時定時觀察PTEN Short form-Like表 現量之變化
10μM Troglitazone濃度進行實驗，分別在0、6、12、16、20、24小時定
時分析PTEN Short form-Like表現量之變化。實驗數據計算的表示方法為
平均值±平均標準誤差(mean±SEM)，實驗數據結果以Student’s t-test分析
統計(SigmaPlot 2000,USA)。P<0.05(P value)時視為有統計上的差異，
*
表P<0.05。
Gas gland weight (gram)
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
Body Weight (gram)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
r=0.96
圖16、自然發育成長之鰻魚成長體重與紅體組織總重相對圖。
紅體組織隨著自然發育成長之鰻魚成長體重增加而增重(r=0.96 , n=11)，
但其中有一條鰻魚未落於成長區線上。
Gas gland weight (gram)
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40
VEGF mRNA expression (arbitrary unit)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
r2 = 0.01
圖17、自然發育成長之鰻魚紅體組織VEGF表現量與其總重相對圖。
VEGF表 現 量 與 紅 體 組 織 成 長 相 對 關 係 上 並 無 明 顯 的 關 係 (r2=0.01 , n=11)。
G as galnd w eight (gram )
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
PTEN mRNA expression (artbitrary unit)
r2 = 0.45
圖18、自然發育成長之鰻魚紅體組織PTEN表現量與其總重相對圖。
PTEN表現量與紅體組織成長相對關係上呈負相關(r2=0.45 , n=11)。
G as gland w eight (gram )
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40
Rate of VEGF/PTEN (arbitrary unit)
0 1 2
r2=0.46
圖19、自然發育成長之鰻魚紅體組織VEGF/PTEN 比值與其總重相對圖。
VEGF/PTEN生長比值與紅體組織成長相對關係上呈正相關(r2=0.46 , n=11)。
L iv er W eig h t (g ram )
0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6
Body weight (gram)
0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0
r= 0 .9 8
圖20、自然發育成長之鰻魚成長體重與肝臟組織總重相對圖。
肝臟組織隨著自然發育成長之鰻魚成長體重增加而增重(r=0.98 , n=11)。
Liver W eight (gram)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
PTEN mRNA expression (arbitrary unit)
0.22 0.24 0.26 0.28 0.30 0.32 0.34 0.36 0.38 0.40 0.42
圖21、自然發育成長之鰻魚PTEN表現量與肝臟組織總重相對圖。
PTEN表現量與肝臟組織成長相對關係上呈無顯著相關性。
Liver W eight (gram)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
VEGF mRNA expression (arbitrary unit)
0.20 0.22 0.24 0.26 0.28 0.30 0.32 0.34 0.36 0.38
圖22、自然發育成長之鰻魚VEGF表現量與肝臟組織總重相對圖。
VEGF表現量與肝臟組織成長相對關係上呈無顯著相關性。
Liver w eight (gram )
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Rate of VEGF/PTEN expression
0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00
r2 = 0.31
圖23、自然發育成長之鰻魚VEGF/PTEN 比值與肝臟組織總重相對圖。
VEGF/PTEN生長比值與肝臟組織成長相對關係上呈低度正相關(r2=0.31 , n=11)。
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
GSI
CC PP HH PH
圖24、不同外源激素處理下GSI成長率
結果顯示控制組的GSI為1.07 + 0.15 %，經由CPE或HCG處理的三組
PP、HH、PH組GSI%分別為2.24 + 0.54 %、2.72 + 0.69 %和2.65 + 0.28%。
實驗數據計算的表示方法為平均值±平均標準誤差(mean±SEM)，實驗數
據結果以Student’s t-test分析統計(SigmaPlot 2000,USA)。當P<0.05(P value)
時視為有統計上的差異，
*
表P<0.05、**
表P<0.01。0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
VEGF mRNA expression
CC PP HH PH
圖25、不同外源激素處理下VEGF表現量
控制組VEGF表現量為0.47 + 0.26 arbitrary unit (mean + SD)，而相對於控
制組PP、HH、PH組分別為其1.27倍、1.29倍、1.021倍。
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 GSI
VEGF mRNA expression
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
圖26、不同外源激素處理下，GSI%成長率對VEGF表現量相關性
四組CC、PP、HH、PH相關係數分別為0.39、0.54、0.91以及0.08正相關。
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
VEGF mRNA expression
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
GSI
圖27、不同外源激素處理下，GSI%成長率對VEGF表現量相關性
四組CC、PP、HH、PH整體相關係數(r2 )值為0.13。
gsa glnad weight (gram)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
劑量
CC 3P 6P 9P
圖28、紅體組織在PIT處理下的總重增長率
紅體組織總重在催熟過程中3P、6P、9P組分別相對於控制組增長
1.08倍(p>0.05)、1.82倍(p<0.05)、2.56倍(p<0.05)。實驗數據計算的表示方
法為平均值±平均標準誤差(mean±SEM)，實驗數據結果以Student’s t-test
分析統計(SigmaPlot 2000,USA)。當P<0.05(P value)時視為有統計上的差
異。
RMI (%X10)
1.2
0.9
0.9
0.6
0.3
0.0
劑量
CC 3P 6P 9P
圖29、紅體組織在CPE處理下的RMI%增長率
紅體組織RM%增長率在催熟過程中3P、6P、9P組分別相對於控制組增長
1.06倍(p>0.05), 1.77倍(p<0.05)、2.51倍(p<0.05)。實驗數據計算的表示方
法為平均值±平均標準誤差(mean±SEM)，實驗數據結果以Student’s t-test
分析統計(SigmaPlot 2000,USA)。當P<0.05(P value)時視為有統計上的差
異。
CTL 3P 6P 9P 劑 量
RMI% x10 & Gene mRNA expression (arbitrary uni
0 1 2 3
RMI% x10 VEGF
* *
*
圖30、在CPE處理下，紅體組織增長率與VEGF表現量之示意圖。
VEGF表現量在施打至第6針前與RMI% 呈正相關，但於第9針時表現量降
回標準值，分別3P、6P、9P組相對於控制組成長1.51倍(p<0.05)、2.26倍
(p<0.05)、1.39倍(p<0.05)。實驗數據計算的表示方法為平均值±平均標準
誤差(mean±SEM)，實驗數據結果以Student’s t-test分析統計(SigmaPlot
2000,USA)。當P<0.05(P value)時視為有統計上的差異，
*
表P<0.05。CTL 3P 6P 9P 劑量
RMI% x10 & G en e mRNA expr ession (ar bitrary unit)
0 1 2 3
RMI% x10 Flk-1
* *
圖31、在PIT處理下，紅體組織增長率與FLK-1表現量之示意圖。
FLK-1 表現量和 RMI%的對應關係與 VEGF 對 RMI%趨勢相同且 3P、6P、
9P 組分別成長 6.14 倍(p<0.05)、8.85 倍(p<0.05)、0.57 倍(p>0.05)。實驗 數據計算的表示方法為平均值±平均標準誤差(mean±SEM)，實驗數據結
9P 組分別成長 6.14 倍(p<0.05)、8.85 倍(p<0.05)、0.57 倍(p>0.05)。實驗 數據計算的表示方法為平均值±平均標準誤差(mean±SEM)，實驗數據結