鰻魚PTEN基因選殖與其在卵巢、紅體組織於催熟發育過程中表現量之變化
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(2) 致謝 首先誠摯的感謝指導老師黃永森博士，不時的討論並指點實驗的 方向，使我獲益匪淺，並得以一窺生命科學的深奧。 本論文的完成另外亦得感謝國立高雄海洋科技大學的鄭絢如老 師的協助，及陳鳴泉老師的支持；農委會鹿港淡水魚繁養殖中心劉富 光主任、陳冠如老師在硬體及軟體上支援；口試委員施能朗老師、呂 佩融老師對論文的指教評點。因為有你們的體諒及協助，使得本論文 能夠更完整。 兩年裡的日子，實驗室裡共同的生活點滴，學術上的討論、言不 及義的閒扯、趕實驗的革命情感........，感謝眾位學長姐、同學、 學弟妹的共同砥礪(墮落?)，你/妳們的陪伴讓兩年的研究生活變得絢 麗多彩。 感謝文良、明昌學長們不厭其煩的指出我研究中的缺失，且總能 在我迷惘時為我解惑，也感謝柏青、意慧同學的幫忙，恭喜我們順利 走過這兩年。實驗室的偉帆、小戴、柏毅、小歐、崇名、家偉、仕成、 韋勝、士傑學弟、芷歆、雅玫、怡瑋、媛婷學妹們當然也不能忘記， 妳的幫忙及搞笑我銘感在心。 誠摯感恩我的雙親和女朋友瑄在背後的默默支持更是我前進的 動力，沒有你們的體諒、包容，相信這兩年的生活將是很不一樣的光 景。 最後，謹以此文獻給我摯愛的雙親。.
(3) 目錄 摘要…………………………………………………………………………………………1 Abstract……………………………………………………………………………………..3 ㄧ、前言……………………………………………………………………………………5 1.1 動物組織生長與血管新生的關係…………………………………………………….5 1.2 VEGF (vascular endothelial growth factor) ……………………………………………6 1.3 PTEN (Phosphatase and Tensin homolog on chromosome 10)蛋白的發現………….. 7 1.4 PTEN 的蛋白質結構與功能…………………………………………………………...8 1.5 PTEN 蛋白質活性功能調控 ………………………………………………………….9 1.6 PTEN 表現調控………………………………………………………………………10 1.7日本鰻卵巢及紅體組織……………………………………………………………….12 1.8 選殖PTEN的動機…………………………………………………………………….13 二、材料與方法…………………………………………………………………………..15 2.1 實驗動物與馴養環境………………………………………………………………...15 2.2 激素及藥品製備……………………………………………………………………...15 2.2.1 鯰魚腦下垂體萃取液(Catfish Pituitary Exacts,CPE) ……………………………...15 2.2.2 人類絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropins, HCG)…………………15 2.2.3 吳郭魚類胰島素生長因子-1(Tilapia Insulin-Like growth factor-1)……………….16 2.2.4 胰島素生長因子(Insulin)…………………………………………………………...16 2.2.5 胰島素增敏劑 (Troglitazone)……………………………………………………....16 2.3 組織與細胞樣品……………………………………………………………………...17 2.3.1 紅體、眼球及肝細胞的取得……………………………………………………….18. I.
(4) 2.4 活體外源激素處理…………………………………………………………………...19 2.5 離體外源激素處理…………………………………………………………………...19 2.6 GSI、RMI 及 HSI 的測量…………………………………………………………….19 2.7 組織全 RNA 的抽取………………………………………………………………….19 2.8 細胞全 RNA 抽取……………………………………………....................................20 2.9 cDNA 的製備………………………………………………………………………….20 2.10 基因選殖…………………………………………………………………………….21 2.11 PTEN. 5’/3’RACE…………………………………………………………………..23. 2.11.1 PTEN 5’RACE……………………………………………………………………..23 2.11.2 PTEN 3’RACE……………………………………………………………………..23 2.11.3 Primers……………………………………………..................................................23 2.12 RT-PCR (reverse transcriptase PCR) 分析表現量………………………………….24 2.13 卵巢石蠟組織切片染色……………………………………………………………25 2.13.1 石蠟包埋………………………………………………………………………….25 2.13.2 石蠟切片………………………………………………………………………….26 2.13.3 Giemsa 染劑染色………………………………………………………………….27 2.14 Image J 影像分析軟體測量卵截面積大小…………………………………………27 2.15 統計方法……………………………………………………………………………27 三、結果………………………………………………………………………………….28 3.1 PTEN 基因選殖結果的分析與比較…………………………………………………28 3.2 由基因表現調節確認鰻魚 PTEN 功能……………………………………………..28 3.2.1 細胞培養及實驗處理條件測試………………………………………………… ..28. II.
(5) 3.2.2 IGF-1 對鰻魚PTEN與VEGF表現的影響…………………………………………29 3.2.3 以 Troglitazone 處理鰻魚眼球細胞並分析其 PTEN 與 VEGF 的表現量……….29 3.3 自然發育且不同體型大小的日本鰻紅體及肝臟組織中PTEN與VEGF之表現…..29 3.4 比較不同的外源促性腺激素(HCG , CPE)相互進行催熟實驗對性腺組織的影響.30 3.5 分析日本鰻以CPE進行催熟過程中的紅體組織…………………………………...31 3.5.1 外源促性腺激素CPE對鰻魚體型及紅體組織發育和紅體增長比率(RMI)的 影響…………………………………………………………………………………32 3.5.2 VEGF 和 FLK-1 在 CPE 催熟後的紅體組織中表現量分析………………………32 3.5.3 IGF-1 在 CPE 催熟後的紅體組織中表現量分析………………………………….32 3.5.4 分析紅體組織中 PTEN Long form-Like 和 PTEN Short form-Like 在 CPE 催熟後 的表現量……………………………………………………………………………32 3.5.5 分析經由 CPE 催熟處理過程中，RMI 與紅體組織 VEGF、PTEN、IGF-1 及 FLK表現量的相對關係…………………………………………………………………33 3.6 分析日本鰻以CPE進行催熟過程中的卵巢組織…………………………………...33 3.6.1 外源促性腺激素CPE或HCG對日本鰻卵巢組織的增長和GSI%的影響………..33 3.6.2 VEGF在CPE和HCG催熟後的卵巢組織中表現量分析…………………………...34 3.6.3 分析卵巢組織中 PTEN Long form-Like 和 PTEN Short form-Like 在 CPE 催熟後 的表現量……………………………………………………………………………34 3.6.4 IGF-1在CPE催熟後的卵巢組織中表現量分析…………………………………...34 3.6.5 分析經由 CPE 催熟處理過程中，GSI%與卵巢組織 VEGF、PTEN 與 IGF-1 表現 量的相對關係………………………………………………………………………34 3.7 分析不同激素催熟之卵截面積大小分佈及卵異質度變化…………………...........35. III.
(6) 四、討論………………………………………………………………………………….36 4.1 日本鰻PTEN基因，有兩種異構物的存在…………………………………………36 4.2 PTEN表現之調控…………………………………………………………………….37 4.3 成長過程中PTEN與VEGF在不同組織表現量的變化……………………………..39 4.4 VEGF與PTEN之表現比值代表成長狀態？………………………………………40 4.5 人工催熟對PTEN與VEGF等基因的表現量之影響………………………………..41 4.6 VEGF與PTEN之表現比值與卵徑分佈之關聯……………………………………...43 五、結論………………………………………………………………………………….45 六、未來展望…………………………………………………………………………….46 七、圖表………………………………………………………………………………….47 八、參考文獻…………………………………………………………………………...102. IV.
(7) 圖目錄. 圖1、人類PTEN蛋白……………………………………………………………………..47. 圖2、藉由磷酸化調控PTEN活性的示意圖……………………………………………..48. 圖3、人類PTEN啟動子…………………………………………………………………..49 圖 4、處理 HCG 兩個月之鰻魚卵巢組織 VEGF 表現量………………………………50 圖5、處理HCG兩個月之鰻魚紅體組織VEGF表現量……………………………….....51. 圖6、PTEN物種親緣性樹狀圖…………………………………………………………..52. 圖7、PTEN相對不同物種胺基酸比對圖………………………………………………..53. 圖8、鰻魚眼球細胞以不同血清濃度測試結果………………………………………….54. 圖9、鰻魚眼球細胞以不同濃度IGF-1測試結果………………………………………..55 圖 10、鰻魚眼球細胞以不同濃度 Insulin 測試結果……………………………………56 圖11、鰻魚眼球細胞以不同Troglitazone濃度測試結果………………………………..57 圖12、以20ng/ml IGF-1進行24小時定時觀察VEGF表現量之變化…………………...58 圖13、以20ng/ml IGF-1進行24小時定時觀察PTEN Short form-Like表現量之變化….59 圖14、以10μM Troglitazone進行24小時定時觀察VEGF表現量之變化……………....60 圖15、以10μM Troglitazone進行24小時定時觀察PTEN Short form-Like表現量之變化61 圖16、自然發育成長之鰻魚成長體重與紅體組織總重相對圖………………………..62. V.
(8) 圖17、自然發育成長之鰻魚紅體組織VEGF表現量與其總重相對圖…………………63. 圖18、自然發育成長之鰻魚紅體組織PTEN表現量與其總重相對圖…………….……64. 圖19、自然發育成長之鰻魚紅體組織VEGF/PTEN 比值與其總重相對圖…………...65 圖20、自然發育成長之鰻魚成長體重與肝臟組織總重相對圖………………… …….66 圖21、自然發育成長之鰻魚PTEN表現量與肝臟組織總重相對圖……………………67. 圖22、自然發育成長之鰻魚VEGF表現量與肝臟組織總重相對圖……………………68. 圖23、自然發育成長之鰻魚VEGF/PTEN 比值與肝臟組織總重相對圖………………69 圖24、不同外源激素處理下GSI成長率……………………………………… ..……….70 圖25、不同外源激素處理下VEGF表現量………………………………………………71. 圖26、不同外源激素處理下，GSI成長率對VEGF表現量相關性……………….……72. 圖27、不同外源激素處理下，GSI成長率對VEGF表現量相關性……………….……73. 圖28、紅體組織在PIT處理下的總重增長率……………………………………………..74. 圖29、紅體組織在CPE處理下的RMI增長率……………………………………..……..75. 圖30、在CPE處理下，紅體組織增長率與VEGF表現量之示意圖…………………….76. 圖31、在CPE處理下，紅體組織增長率與FLK-1表現量之示意圖……………………77. 圖32、在CPE處理下，紅體組織增長率與IGF-1表現量之示意圖…………………….78. VI.
(9) 圖33、在CPE處理下，紅體組織增長率與PTEN Long form-like表現量之示意圖……79 圖34、在CPE處理下，紅體組織增長率與PTEN Short form-like表現量之示意圖……80 圖35、在CPE處理下，PTEN Long form-like與PTEN Short form-like表現量之趨勢圖.81 圖36、在CPE處理下，VEGF/PTEN Long form-like及VEGF/PTEN Shortform-like比值與 RMI之趨勢圖……………………………………………………………………..82 圖37、在CPE處理下，FLK-1/PTEN Long form-like及FLK-1/PTEN Short form-like比值 與RMI之趨勢圖…………………………………………………………………..83 圖38、在CPE處理下，IGF-1/PTEN Long form-like及IGF-1/PTEN Short form-like比值 與RMI%之趨勢圖………………………………………………………………...84. 圖39、在CPE處理下，卵巢組織增長率與VEGF表現量之示意圖……………………85. 圖40、在CPE處理下，卵巢組織增長率與PTEN Long form-like表現量之示意圖…....86 圖41、在CPE處理下，卵巢組織增長率與PTEN Short form-like表現量之示意圖…….87 圖42、在CPE處理下，卵巢組織IGF-1表現量…………………………………………..88. 圖43、在CPE處理下，卵巢組織增長率與VEGF/PTEN Long form-like比值之示意圖..89 圖44、在CPE處理下，卵巢組織增長率與VEGF/PTEN Short form-like比值之示意圖..90 圖45、在CPE處理下，卵巢組織中IGF-1/PTEN Long form-like比值之示意圖………..91. VII.
(10) 圖46、在CPE處理下，卵巢組織中IGF-1/PTEN Short form-like比值之示意圖……….92 圖47、不同處理下，卵截面積大小的相對異質度………………………………………93. 圖48、控制組之卵截面積大小分佈比例圖……………………………………………..94. 圖49、處理CPE之卵截面積大小分佈比例圖……………………………………………95. 圖50、處理HCG之卵截面積大小分佈比例圖…………………………………………..96. 圖51、先後處理4週PIT及4週HCG之卵截面積大小分佈比例圖……………………....97. 圖52、卵相對異質度與不同處理下個別的GSI之相對關係圖…………………………98 圖 53、卵相對異質度與不同處理下個別的 VEGF 表現量之相對關係圖…………….99 圖54、處理9針PIT後，卵截面積大小分佈區域圖……………………………………….99. 圖55、PPARγ在過敏性氣喘中扮演的訊息傳遞示意圖………………………………..101. VIII.
(11) 鰻魚 PTEN 基因選殖與其在卵巢、紅體組織於催熟發育過 程中表現量之變化 指導教授:黃永森 博士 國立高雄大學生命科學系 學生:陳逸帆 國立高雄大學生物科技所 摘要 PTEN 不僅為一種腫瘤抑制因子，亦能影響細胞生長的大小與其週期。組織生長 需要細胞體積與數目的增加及血管系統支援，VEGF 對於血管新生是一個相當重要的 因子。但是，PTEN 調控組織或細胞大小與數量的能力是否是因其抑制 VEGF 誘發的 血管新生，以及兩者的關係在原始脊椎動物出生後組織發育的研究尚未清楚。因此， 我們選用鰻魚為研究的材料，選殖其 PTEN 基因。我們選殖出兩種日本鰻 PTEN 的異 構物 (PTEN Long- or Short-form Like)。在離體實驗中，以生長因子 IGF-1 與胰島素 增敏劑 Troglitazone 處理鰻魚細胞，以 RT-PCR 分析其 PTEN 表現量，以確定其生理 功能。結果顯示 IGF-1 會抑制細胞 PTEN 表現，而 Troglitazone 刺激 PTEN 表現量上 升。進而，在活體實驗中，觀察鰻魚正常成長發育過程以及使用外源促性腺激素刺激 的過程中，以 RT-PCR 分析其紅體組織、卵巢以及肝臟組織中 VEGF、PTEN、IGF-1、 以及 FLK-1 表現量。在卵巢組織中，PTEN 表現量與組織增長呈正相關，與 VEGF 表 現量呈負相關，且卵巢生長質量相對於 VEGF/PTEN 比值呈高度正相關。在紅體組織 中，PTEN 表現量與組織增長呈正相關，但 VEGF 在後期被抑制表現，然而，紅體組 織生長質量相對於 VEGF/PTEN 比值兩者間仍呈高度正相關。故我們推測 PTEN 似乎 對組織發育增長有較顯著的影響。由以上結果，我們提出一個假說：在日本鰻中，. 1.
(12) VEGF 及 PTEN 平衡關係似乎能代表紅體與卵巢組織的發育狀態。總和以上，我們推 測原始脊椎動物 VEGF 和 PTEN 的相互關係影響其出生後的組織發育，其 VEGF/PTEN 比值可用於表示特定組織的生長狀態。. 關鍵字：PTEN、血管內皮細胞生長因子、血管新生、血管內皮細胞生長因子受體、 類胰島素生長因子、胰島素增敏劑。. 2.
(13) Cloning of PTEN gene from the Japanese eel (Anguilla japonica), and its fluctuations of expression in the ovary or rete mirabile during artificial maturation Advisor : Dr. Yung-Sen Huang Department of Life Science National University of Kaohsiung Student : Yi-Fan Chen Institute of Biotechnology National University of Kaohsiung Abstract PTEN is a tumor suppressor, it also regulates cell size and cell cycle. Organogenesis requires the increases of cell size and cell number as well as the support of vascular system. VEGF, a selective mitogen for vascular endothelial cells, is important for the development of vascular system. But it is not clear if PTEN controls tissue mass by suppressing angiogenesis provoked by VEGF and their correlations on the postnatal tissue development in fish. We used a primitive vertebrate, eel, to study this question. Two forms of PTEN (PTEN Long- or Short- form Like) cDNA have been cloned in Japanese eel. The eel’s cells were treated with IGF-1 and Troglitazone to investigate the expression control of PTEN in vitro. The results showed that IGF-1 suppressed while Troglitazone stimulated PTEN expression. Rete mirabile,ovary, and Liver from normal eels or eels injected with hypophysial factors were used to investigate the expression of VEGF A, PTEN, IGF-1, and Flk-1 by RT-PCR in vivo. There was a negative correlation between PTEN expression and ovarian tissue mass and a positive correlation expression with VEGF. 3.
(14) and a higher correlation between the tissue mass and the ratio of VEGF to PTEN. There was a negative correlation between PTEN expression and RMI and a positive correlation expression with VEGF. VEGF expression was suppressed in a later period on the Rete mirabile, but it was still a higher correlation between the tissue mass and the ratio of VEGF to PTEN, so the development of tissue to seem to display the main factor with PTEN expression. We showed that the involvement of VEGF and PTEN in the postnatal tissue development, the ratio of VEGF to PTEN may represent the growth status of the specific tissue.. keywords：PTEN、VEGF、angiogenesis、IGF-1、Flk-1、Troglitazone。. 4.
(15) 一、前言 先前我們實驗室已獲得了有關VEGF表現量在日本鰻催熟過程中的 變化，探討血管系統的建立程度是否會影響催熟過程中卵子的發育，進 而造成卵徑分佈不均的現象。然而，經由前實驗結果再做一次重複試驗 與其對照亦得到相同的趨勢。我們以每星期注射兩針HCG催熟日本鰻， 並分別在處理第1個月及第2個月注射後24小時內解剖採樣及分析樣品。 結果顯示在紅體中VEGF表現量會在處理1個月後有被抑制的現象 (對照 組0.73倍)，而處理2個月後表現量會有回復現象(對照組0.92倍) (圖4)。在 卵巢中，VEGF表現量會在處理1個月後有被刺激的現象(對照組2.3倍)， 而處理2個月後表現量亦有回復現象(對照組1.2倍) (圖5)。然而，這個趨 勢與我們預測VEGF表現量應與催熟過程同步上升不同。因此我們相信這 樣多次重覆相同的結果中必有其他的因子調控此現象。於是，經由參考 文獻及討論之下，我們猜測此因子之一可能為PTEN基因，並著手將其選 殖出，進而進行離體及活體的各項實驗。. 1.1 動物組織生長與血管新生的關係 動物生長(組織發育)是如何被控制是動物學上一個重要的問題。生長 是經由各種不同的訊息相互調控及影響的，故難以單一方向探討。生物 的基本單位是細胞，故生長是細胞生化合成進而增加生物量。生長可以 發生於細胞代謝而進行細胞分裂，但發育期間主要的生長模式為細胞分 裂，遷移以及細胞週期過程的偶合進而增加生物量 (Oldham et al., 2000)，所以，決定一個組織大小應考慮影響細胞數目以及細胞大小。. 5.
(16) 組織發育和細胞的大小及數目增殖有關，而此過程需要建立循環系 統(血管)傳遞所需的營養、激素以及廢物、運輸代謝物。因此，新血管生 成(vasculogenesis) 及血管新生 (angiogenesis) 是胚胎、組織發育以及細 胞成長所必需的生理過程 (Choi, 1998)。是故，對於正常組織發育或細胞 質量增殖可能受到血管內皮細胞的影響或限制 ( Folkman, 1998)。其中， 血管新生是指組織在生長時，需要建立新的微血管系統，而在此過程中， 舊有的微血管會受到鄰近新生組織所分泌之血管新生因子(angiogenic factors) 的刺激與調控而萌發新的微血管，進而長入新生組織，微血管網 進行重組並形成動脈和靜脈，並且在新長成的組織中建立新的養分與代 謝物的輸送網。如此一來，新生組織才可進一步發育。然而，新血管生 成是指個體在胚胎發育階段時，具有很旺盛的循環系統建立，對於最初 生成的新血管而言，此過程稱之為新血管生成。若生長發育為成熟個體 時，血管新生的作用在個體中就只會發生在特定組織中，如卵巢排卵前 後的濾泡與黃體、子宮內膜、傷口癒合時之新生組織、與腫瘤組織。目 前已知，VEGF(vascular endothelial growth factor)為刺激血管新生的重要 因子(Ferrara, 2001, 2004; Shimizu et al., 2003)。. 1.2 VEGF (vascular endothelial growth factor) VEGF (vascular endothelial growth factor) 對於血管內皮細胞是一種 特異性的成長因子，無論對新血管生成或血管新生而言都是一個相當重 要的。VEGF持續高度表現在鵪鶉、小鼠以及青蛙發育中的血管內皮細胞 (Liang et al., 2001)。雖然已有許多血管生成因子被確立，但僅有VEGF能. 6.
(17) 促使血管通透性增加 (Ferrara, 2001; 2004)。VEGF mRNA已被確立表現在 於腫瘤及某些正常組織或細胞，諸如，人類巨噬細胞、肺上皮細胞、腎 臟上皮細胞、腦下垂體濾泡細胞、黃體細胞以及大動脈平滑肌細胞 (Ferrara et al., 1992) 。 VEGF 所 誘 發 的 血 管 新 生 作 用 中 ， PI3K (Phosphatidylinositol- 3-kinase) 具有關鍵性的作用，報告指出由VEGF結 合VEGF受體所引發的血管內皮細胞增生和遷移的反應中皆可發現PI3K 的參與。 PI3K可將PIP2 (phosphatidylinositol-4,5- bisphosphate) 催化為 PIP3 (phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate)，經由PIP3 使下游分子AKT 活化(Huang and Kontos, 2002)，而 AKT 與細胞的遷移、增生及存活有 關。VEGF受體有兩型已被確立，分別為Flt-1(VEGF-R1)和Flk-1(VEGF-R2 or KDR)，兩者皆專一性的表現於血管內皮細胞。然而，僅有Flk-1 與內 皮細胞的特性有關，諸如細胞型態分類、細胞骨架的辨識和VEGF刺激的 細胞分裂發生，Flt-1 則無此特性 (Klagsbrun and D'Amore, 1996 ; Banerjee et al., 1997 ; Zachary and Gliki, 2001)。. 1.3 PTEN (Phosphatase and Tensin homolog on chromosome 10) 蛋白的發現 PTEN (Phosphatase and Tensin homolog on chromosome 10, 亦 稱 MMAC1 or TEP1) 已知無論在控制正常組織發育或是抑制腫瘤都扮演重 要的角色 (Yamada and Araki, 2001; Kishimoto et al., 2003)。 起初，10q23 染色體的雜合性丟失（LOH）在人類多種腫瘤晚期的高發頻率，暗示著 此段 10q23 可能存在腫瘤抑制基因。於是在 1997 年，Li 等人用代表性差. 7.
(18) 別分析法（representational difference analysis, RDA) 在浸潤性乳腺癌的兩 個移植瘤中發現了 10q23 染色體特定區域的雜合性缺失，並透過外顯子 俘獲分析法 （exon trap analysis） 分離出一種新的基因，對其開放閱讀 框架（ORF） 序列分析顯示了它可能編碼蛋白質酪氨酸磷酸脢 （PTP）， 且 與 張 力 蛋 白 (tensin) 有 大 片 同 源 區 ， 因 此 將 其 命 名 為 PTEN （phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10）(Li et al., 1997)。. 1.4 PTEN 的蛋白質結構與功能 PTEN蛋白包含兩個主要的功能區域︰N端去磷酸酶結構及C端C2 結 構(圖 1) (Nick and Peter,2004)。其中，去磷酸酶功能區域前端包含一個 PIP2 的結合區位以及磷酸酶活性區域 (phosphatase)，可使蛋白質中的酪 氨酸殘基去磷酸，此作用恰好與許多癌基因產物---酪氨酸蛋白激脢 (tyrosine protein kinase, TPK) 的作用相反，而酪氨酸在TPK的作用下被磷 酸化，在調控細胞生長、分化和癌變時起重要作用 (Arne et al., 2006)。 然而在C2 結構區方面，經由PTEN蛋白晶體結構的研究指出：PTEN可藉 由其與膜磷脂結合，但與某些信號分子的C2 結構域不同的是，其不需要 2+. 螯合Ca 即可結合於細胞膜上，並且C2 結構域可同時與PTEN的磷酸酶 結構域緊密相連 (Nick and Peter,2004)。在C2 結構域的個別功能性上亦有 報告指出，僅單獨表現PTEN C2 功能區蛋白可能會抑制細胞的遷移能力 (Raftopoulou et al., 2004)。 PTEN蛋白除與上述的功能區外，其N端還與 兩種細胞質蛋白同源， 即肌力蛋白 (Auxilin) 和張力蛋白(tensin)。前者. 8.
(19) 與突觸小泡的運輸有關，後者為一種細胞骨架蛋白，在細胞聚集黏著時， 與肌力蛋白 (Auxilin)一起形成複合物，包含聚集粘連激脢 (focal adhesion kinase, FAK)、生長因子受體和整合素 (integrin)等，其中整合素 (integrin)不但與細胞生長調節有關，也與腫瘤的侵襲轉移及血管發生有關 (Tamura et al., 1998)。在PTEN蛋白C端序列上，含有一個三氨基酸的C末 端區域（TKV-COOH）(圖 1)，可與含有PDZ結構域的蛋白質結合，PDZ 結構域通常與多蛋白複合體的組裝相關。所以，儘管這幾個氨基酸的突 變並不會引起PTEN抑癌活性的改變，其可能對PTEN在細胞內的定位及 與其它蛋白的相互作用有關 (Nick and Peter, 2004)。人類許多組織型態中 已證實在發育期間PTEN具有高度的表現(Gimm et al., 2000)，且人類多種 腫瘤中已被普遍發現PTEN的C124S和G129E兩個活性位發生突變，進而 證實了PTEN為一腫瘤抑制子(Li et al., 1997; Steck et al.,1997; Lee et al., 1999)。在齧齒類動物及果蠅中，PTEN在調控細胞大小及生長上扮演重 要的角色(Kishimoto et al., 2003; Goberdhan et al., 1999)，藉由剔除小鼠 PTEN基因使胰臟蘭氏小島質量與大小增加並使β-Cell細胞數增多且未導 致正常細胞癌化 (Kinh-Tung T. Nguyen et al., 2006)，而在果蠅眼球的發育 期間，PTEN的去活性或過度表現皆會影響細胞大小，增生以及凋亡的正 常表現 (Huang et al., 1999)。對小鼠而言，PTEN亦存在於胚胎組織，且 PTEN基因異型合子的突變會造成多種組織形成腫瘤及以在出生前剔除 PTEN基因將會造成胚胎死亡 (Podsypanina et al., 1999)。在斑馬魚中，有 兩種PTEN異構物 (PTEN A和PTEN B)且各有兩種不同基因剪除形式 (Long和Short形式)已被發表於NCBI資料庫，推測其分別在斑馬魚胚胎發. 9.
(20) 育形成的各類組織上有不同的調節功能(Croushore et al., 2005)。. 1.5 PTEN 蛋白質活性功能調控 以上為PTEN蛋白結構性上的功能分析，然而就整體蛋白活性而言， 目前已確定PTEN的功能與PI3K作用相反 (Li et al., 1998)。PTEN是一個 雙重性的磷酸脢，其脂質去磷酸脢活性可抑制腫瘤生長 (Myers et al., 1998)。PTEN主要作用受質是PIP3，將PIP3去磷酸化後形成PIP2，可抑制 由PI3K所啟動的訊息傳遞路徑 (Maehama and Dixon, 1998)。各種生長因 子，諸如表皮細胞生長因子、肝細胞生長因子、纖維母細胞生長因子、 類胰島素生長因子、胰島素 (Kishomoto et al., 2003; Hamada et al., 2005) 以及內皮細胞生長因子 (Olsson et al., 2006) 的作用皆有PI3K的參與。然 而，PTEN上亦編碼有一段存在於所有酪胺酸磷酸脢的特定活性位區域 HCXXGXXRS/T (Li et al., 1997 ; Huang et al., 1999 ; Lee et al., 1999)， PTEN蛋白已證實其酪胺酸磷酸脢活性能作用於Shc及FAK (Gu et al., 1999; Yamada and Araki, 2001)，且Shc及FAK已知所具有調控細胞貼附和 遷移的能力亦能經由PTEN去磷酸脢活性進行負調控 (Yamada and Araki, 2001)。在PTEN蛋白質活性的調控方面，主要為磷酸化與氧化調節。在 人類PTEN蛋白序列中，C端末Ser-370 , Ser-380 , Thr-382 , Thr-383 以及 Ser-385 是一段可高度磷酸化的片段。此片段若經去磷酸反應或藉由突變 方式改變其氨基酸可磷酸化的特性，將會降低PTEN蛋白的生化活性 (Vazquez et al., 2000)。文獻指出，PTEN蛋白經磷酸化後將會極化自身電 位，產生遮蔽效應，使其與酸性帶負電的磷脂質膜親合性劇降，造成留. 10.
(21) 置細胞質中而無法貼附胞膜上進行作用 (圖 2)，並且使末端PDZ功能區 失去與其他蛋白相互作用的能力 (Das et al., 2003)。另一方面，PTEN蛋 白結構上有氧化或還原態兩種形式，文獻指出人類PTEN蛋白去磷酸化活 性可藉由其Cys-71 與Cys-124 胺基酸是否形成雙硫鍵結來調控 (Cho et ._. al.,2004)。且有報告指出，人體代謝物中的過氧化物 (H2O2、O2 ) 能誘 發PTEN氧化反應進而使其去磷酸脢活性失活(Leslie et al., 2003; Lim and Clement, 2007）。. 1.6 PTEN 表現調控 PTEN影響PI3K/AKT訊息路徑所調控的下游反應包括細胞生長，遷 移及存活 (Thompson and Thompson, 2004)，而PTEN負調控此訊息路徑進 而抑制正常組織和細胞過度生長及腫瘤成長 (Stahl et al., 2003)。早先觀 察到某些腫瘤與血管新生及PTEN的突變有相關性，這兩個獨立現象進而 被有所連結 (Wen et al., 2001)。事實上，已有文獻證實在活體外PTEN強 而有效的負調控VEGF所誘導的血管新生 (Huang and Kontos, 2002)，而藉 由轉殖基因技術過度表現正常PTEN以及功能性突變PTEN在鼠類微血管 內皮細胞株，當導致 PTEN 功能性喪失的腺病毒載體過度表現時，不但 使 VEGF 誘發 AKT 的磷酸化表現增強，且降低了細胞凋亡的程度及增 強了內皮細胞增生與遷移 (Huang and Kontos, 2002)。 除此之外，鼠類大 動脈環 (arotery ring) 微血管生長體外測試也顯示，當 PTEN 表現被抑 制時有較長的微血管絲生成，相反的，過度表現正常 PTEN 則會抑制內 皮細胞增生、遷移以及微血管絲生成 (Huang et al., 2002)。更在人類神經. 11.
(22) 膠質瘤細胞的研究中顯示， 抑制 PTEN 功能後，可藉由 PI3K/AKT 路 徑正向調控 VEGF promoter 使 VEGF mRNA表現量上升 (Nabendu Pore et al., 2003)。另一方面亦有文獻指出，PTEN表現量可以藉由噻唑烷二酮 (thiazolidinediones，如Lovastatin、Rosiglitazone及Troglitazone) 刺激過氧 化 物 酶 體 增 生 物 激 活 受 體 (PPARγ, peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 活化而誘發其增加 (Lee et al., 2005)，噻唑烷二酮為胰島 素增敏劑。在 PTEN 的啟動子 (promoter) 調控上，目前已確立某些正調 控的家族基因如：Early growth response-1(Egr-1)、p53以及Sp1；相反的， NF- b 也已被證明為PTEN的負調控因子 (Teresi et al., 2006)。在此，報 告也指出 PTEN 啟動子上游約10 kb處有兩個 PPARγ 的結合序列(圖3) (Patel et al., 2001)，並提出 PPARγ 可藉由正向調控 PTEN 啟動子進而促 進細胞正常凋亡且抑制細胞過度生長 (Patel et al.,2001)。相同的，在斑馬 魚胚胎發育期間，PTEN 基因的剔除亦會導致 AKT 磷酸化表現量增加 和促進正常的血管新生作用 (Croushore et al., 2005)。雖然 PI3K/AKT 訊 息 路 徑 的 活 化 已 經 確 立 可 以 促 進 血 管 新 生 以 及 刺 激 VEGF 的 表 現 (Jiang et al., 2000)，但此類研究文獻對於低等硬骨魚類僅侷限於胚胎發育 層次，在出生後的組織發育過程中 VEGF 和 PTEN 相互關係的研究則 付之闕如。故我們以日本鰻為研究對象，選殖其 PTEN 基因，在離體實 驗中，初步確立日本鰻 PTEN 基因的功能；並在活體實驗中，觀察PTEN 與VEGF在卵巢及紅體組織生長發育過程中的變化。. 1.7日本鰻卵巢及紅體組織. 12.
(23) 由於鰻魚奇特的生活史，一直以來對鰻魚的生態都是個謎，其在演 化上屬於低等原始脊椎動物。鰻魚與鮭魚的習性相反，其會在河川中長 大且成熟後洄游到海洋中產卵。從卵中孵化出的幼苗，最先形成柳葉鰻 (letocephalus)、而後變態為玻璃鰻 (glass eel)、往後為鰻線 (elvers)、黃鰻 (yellow eel)，最後再次變態為銀鰻 (silver eel)，待成熟後洄游降海產卵 (Tzeng et al., 2000)。這樣循環的生活史中，伴隨著許多生理機能及外觀 上變態的改變。其中，解剖型態上最為明顯的變化為雌鰻卵巢的發育， 而由於血管新生作用被誘發，進而使微血管絲佈滿卵巢葉面且明顯可見 (Muller et al., 2004)。然而，另一個血管新生作用旺盛的組織為一氣囊腺 (亦稱紅體, rete mirabile)，為控制氣體分泌及調節深海壓力環境的器官。 其主要由許多動脈及靜脈微血管網組成，然而，降海繁殖時需調節氣囊 增大以應對深海環境，此時紅體組織亦會隨之增長 (Yamada et al., 2001)，日本鰻發育中氣囊腺體紅體組織的質量會與年齡增長呈正相關， 尤其與日本鰻成長階段 (銀鰻，黃鰻) 相關性大，黃鰻紅體組織質量大小 皆比銀鰻小 (Kleckner, 1980; Yamada et al., 2004)，在人工催熟的日本鰻中 亦有相同的現象 (Yamada et al., 2001)。第二，紅體組織的組成中含大量 顯著的內皮細胞 (Krogh, 1959, cited by Wanger et al., 1987, therein)，已有 文獻指出紅體的內皮細胞總量及密度會隨著年齡或是生殖階段而增加， 且其他種類的細胞數會相對被降低 (Kleckner, 1980 ; Bendayan and Rasio, 1997 ; Yamada et al., 2001 ; Huang et al., 2006)。第三，鰻魚爲亞洲重要經 濟養殖魚種之一，然而在一般飼養狀態下，其性腺無法發育。故現階段 鰻魚人工繁殖是將雌鰻以人工催熟的方式使其卵巢 GSI從1.5% 發育至. 13.
(24) 30-40%，卵巢長滿腹腔兩側使腹腔明顯腫大。然而，在日本鰻人工繁殖 所面臨的問題中，其中有一部分的原因是由於卵細胞發育不同步，所以 我們推測可能為營養或激素獲得不均造成。且卵巢的血管新生對於卵巢 中濾泡成熟以及黃體生成是相當重要的 (Shimizu et al., 2003 ; Kaczmarek et al., 2005)。第四，鰻魚在動物史中被認為是相當接近脊椎動物的起源， 故此研究可以提供一些有關於原始硬骨魚類在調控發育的相關訊息。基 於以上幾點特質，藉由利用外源激素促性腺成熟與紅體發育的實驗，研 究原始硬骨魚類中組織發育與血管新生相互作用的關係。. 14.
(25) 二、材料與方法 2.1 實驗動物與馴養環境 本實驗所使用的鰻魚購自鰻魚養殖場。為生長二至三年的日本鰻 (Anguilla japonica)。實驗前先馴養在鹽度為 21-23 PPT 的海水中二星期， 不餵食。將鰻魚植入晶片後隨機分組，分別以不同激素處理進行各項實 驗。. 2.2 激素及藥品製備 2.2.1鯰魚腦下垂體萃取液(Catfish Pituitary Exacts,CPE) 購自當地養殖場的泰國鯰魚腦下垂體(每顆約 4.2 mg，保存於丙酮 中)，將其磨碎後，與食鹽水溶液混合均勻後，以低速離心去除沉澱。鰻 魚接受的劑量約 2 顆腦下垂體/每公斤魚重。 製作流程為： *依處理樣本量加入食鹽水磨碎所需個數鯰魚腦下垂體後，置入 15ml 離 心管。24℃下，離心 4500rpm ; 5 min，取上清液用於注射。. 2.2.2人類絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropins, HCG) 人 類 絨 毛 膜 促 性 腺 激 素 購 自 Intervet Co. (Chorulon,. Intervet International BV Box meer Holland)，以食鹽水 (PBS) 溶解 HCG，注射劑 量 200 IU/每公斤魚重。. 2.2.3吳郭魚類胰島素生長因子-1(Tilapia Insulin-Like growth factor-1). 15.
(26) * 來源：吳郭魚 IGF-1 (純度 90%，由中央研究院吳金冽老師慷慨提供) Stock 配製：取 1mg 溶於 0.9ml PBS，濃度為 1μg/μl 實驗濃度：取 4μl Stock 溶於 996μl PBS，濃度為 4ng/μl 反應最終濃度：6-well 培養盤中，每個 well 含 2ml 培養液，故每 well 添加 10μl 使最後反應濃度為 20ng/ml. 2.2.4胰島素生長因子(Insulin) * 來源：購自 Sigma Co. (小牛胰臟純化) Stock 配置：取 1mg 溶於 1ml PBS，濃度為 1μg/μl 實驗濃度：取 4μl Stock 溶於 996μl PBS，濃度為 4ng/μl 反應最終濃度：6-well 培養盤中，每個 well 含 2ml 培養液，故每 well 添加 50μl 使最後反應濃度為 100ng/ml. 2.2.5胰島素增敏劑 (Troglitazone) * 來源：購自 CALBIOCHEM Stock 配置：取 5mg 溶於 5ml DMSO，濃度為 2mM 實驗濃度：取 5μl Stock 溶於 2ml 培養液 反應最終濃度：6-well 培養盤中，每個 well 含 2ml 培養液，故每 well 濃度為 5μM。. 2.3 組織與細胞樣品 將實驗鰻以 0.05%二苯氧基乙醇 (2-phenoxyethanol) 麻醉，固定於解. 16.
(27) 剖盤上進行解剖。依實驗需求取得目標組織，如卵巢、紅體、肝臟、腎 臟、眼睛。 2.3.1紅體、眼球及肝細胞的取得 在三角錐瓶中混合胰凝乳蛋白脢 (chymotrypsin，0.25mg/ml)、膠原蛋白 脢 (collagenase，0.25mg/ml)於 1x 分解脢 (dispase)中(總體積 20ml)，再 經由 0.2μm的無菌過濾膜至 50ml離心管後，置於冰上備用。在PBS中使 用滅菌解剖剪將組織剪成細碎狀後，放入配置好的酵素混合液中，反應 條件為 4℃過夜 (overnight) 作用。倒除酵素並以少量PBS清洗碎片組織 之後，吸除PBS並加入 5ml M199 培養液，以 1ml針筒(拔除針頭部分)沖 刷細胞，再以過濾網(0.5mm)過濾，反覆三次置入 15ml離心管，以 4℃下 離心 4000rpm，10min。倒除上清液並以含 10%胎牛血清培養液(M199) 打散細胞且補至 15ml，最後將細胞液倒入 75cm2細胞培養瓶，完成細胞 初代培養。繼代至第 3 代後開始進行各項實驗。. 2.4 活體外源激素處理 注 射 前 ， 將 養 殖 池 中 的 鰻 魚 撈 出 ， 置 於 水 槽 內 ， 以 0.05% 2-phenoxyethanol 麻醉，以晶片偵測器分出處理組與對照組。處理組的鰻 魚以腹腔注射的方式，依據其組別，每週一次施打各類的激素。. 2.5 離體外源激素處理 實驗需將培養於 75cm2培養瓶中的貼附細胞切割下來。首先，倒除培 養瓶中的培養液並以PBS清洗 2 次後，加入 37℃Trypsin 5~6 ml於培養瓶. 17.
(28) 中，輕搖使覆蓋培養瓶底部後開始拍打三分鐘，過程中以倒立顯微鏡觀 察細胞切除的狀態調整酵素作用的時間，經酵切可見細胞漂浮於液面 後，立即加入 10% 胎牛血清培養液 5~6ml中止酵素活性 (於冰上作業)， 均勻混合後倒入 15ml離心管並以PBS將總體積補至 15ml。而後，使其在 4℃下離心 4000rpm、8 分鐘，離心後吸除上清液並加入 3~4ml 10%胎牛 血清打散細胞(此處添加量以細胞量及實驗設計而定)。取出 100μl的細胞 懸浮液與 100μl的trypan blue均勻混合，取出混合後的細胞 10μl放入細胞 計數器(hemacytometer)中，以顯微鏡觀察細胞數量，並計算細胞計數器 九宮格裡四直角大格的活細胞數目。若是死細胞會被trypan blue染成藍色 (因trypan blue是染細胞核，細胞破裂後才會裸露出細胞核)，活細胞則不 呈色。細胞總數=(細胞計數器上四直角大格的活細胞數/4)×104。經細胞 計數之後的細胞總數，計算細胞數的濃度約每毫升 105~106的細胞數，將 其平均種入培養盤中，並以含 10% 胎牛血清的培養液培養三天。而後， 若細胞生長狀況良好則吸除培養液且添加 2ml含實驗所需相對量血清濃 度的培養液，即可加入欲處理的外源激素。. 2.6 GSI、RMI 及 HSI 的測量 將鰻魚麻醉後，以秤測量鰻魚體重後，利用解剖器具將雌鰻總卵巢、 紅體組織及肝臟取出後，以天秤秤重，利用下列公式計算出 生殖腺重指數(Gonado-Somatic Index ; GSI) *GSI (%) = 100×(生殖腺重/體重) 紅體重指數(Rete Mirabile Index ; RMI). 18.
(29) *RMI (%) = 100×(紅體總重/體重) 肝臟重指數(Hepatosomatic index ; HIS) *HIS (%) = 100×(肝臟總重/體重). 2.7 組織全 RNA 的抽取 將約 60mg的組織放入 1.5ml eppendorf中，加入 1ml TRI® Reagent， 於冰上以研磨棒將組織完全磨碎後，以 12000rpm，4℃的條件離心 10 分 鐘。使用微量滴管取上清液，移入新 1.5ml eppendorf中，加入 200μl氯仿， 輕輕搖晃混合均勻且靜置於室溫 10 分鐘後，以 12000rpm，4℃離心 15 分鐘。此時上層為水相(內含RNA)，下層為有機相，兩相之間有白色的蛋 白質層且包含DNA，小心地吸取上清液，移入新 1.5ml eppendorf中，加 入 500μl異丙醇混合均勻後，以同樣條件離心 10 分鐘。移去上清液，以 1ml 75%酒精清洗白色沉澱，吸除酒精後，放置無菌操作臺中自然乾燥白 色沉澱物，待其變透明後，以 65℃~70℃的miniQ經高溫高壓滅菌水溶解， 保存於-70℃。. 2.8 細胞全 RNA 抽取 利用Viogene公司的total RNA Mini kit抽取全RNA。首先，吸除培養 液並以PBS沖洗兩次。6-well的培養盤中，每個well加入 700μl的RX buffer(每一毫升的RX buffer含有 10μl的β-mercaptoethanol)，輕輕敲打後靜 置 5 分鐘。將作用後的RX混合液吸取至 1.5ml微量離心管後，加入同體 積(700μl)75%酒精(需以高純度酒精配置)並均勻混合，將混合液置入Total. 19.
(30) RNA Mini column中，而後反應於室溫下離心 13000rpm、1 分鐘(此步驟 需重覆兩次，因一次吸入column量最多只能 700μl)。離心後倒除下清液， 加入 0.5ml WF buffer反應於室溫下離心 13000rpm、1 分鐘(WF的作用為 使RNA鍵結於column)。離心後倒除下清液，加入 0.7ml WS buffer反應於 室溫下離心 13000rpm、1 分鐘(WF的作用為沖刷非鍵結於column的物 質)。離心後倒除下清液，空管反應於室溫下 13000rpm、3 分鐘後(此步驟 目的在於更完全去除酒精成分)，將column放入新的 1.5ml 微量離心管中 並加入 10μl的RNase-free ddH2O(盡量加至column中央)，靜置 1 分鐘後反 應於室溫下離心 9000rpm、2 分鐘。離心後的下清液即為細胞全RNA，需 置於-70℃下保存。. 2.9 cDNA 的製備 取出 2μl RNA溶液並以二次水稀釋二百倍，以分光光度計量測 260nm 與 280nm UV 波 長 吸 光 值 ， 計 算 出 RNA 的 濃 度 (RNA 量 μg/ml= O.D.260×40×稀釋倍數)。個別算出含有 5μg RNA所需的RNA溶液體積， 以 規 格 化 (Normalize) 所 有 的 樣 本 ， 利 用 SuperScript™II Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen Corporation, USA)透過反轉錄合成所有mRNA 的First-strand cDNAs：首先在RNase-free之 250μl PCR eppendorf 中依序 加入 5μg total RNA後，用滅菌水將總體積補至 11μl，最後加入 1μl Vial8(Roche)引子及 1μl dNTP mix，將此反應溶液混合均勻後，置於PCR 反應器中以 65℃加熱 5 分鐘後，快速置於冰上冷卻 1 分鐘後，加入 4μl 5X First-strand buffer、2.5μl 0.1M DTT及 0.5μl SuperScript™II RTase(總反應體. 20.
(31) 積 20μl)，混合均勻並短暫離心後於PCR 反應器中，反應條件為 42℃反 應 52 分鐘，70℃反應 15 分鐘。最後產物即為First-strand cDNAs，可用 於基因選殖及聚合脢連鎖反應的模板。. 2.10 基因選殖 將欲選殖基因利用 NCBI 以物種同源性做比對，挑選斑馬魚 (Danio rerio) 基因作為設計變性引子的參考。之後，以日本鰻 cDNA 作為模板 及由斑馬魚而來設計之變性引子進行聚合脢連鎖反應(PCR)，步驟為： 以梯度實驗測試適合的引子黏合 (annealing) 溫度 (若反應無條帶出現則返回重新設計引子) ↓ 若有條帶出現則進行切膠純化(Viogene Gel-M Kit) ↓ 以 yT&A 載體進行 T-A 選殖 (Invitrogen TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen Co., USA). ↓ 以 Primers(M13F 及 M13R)進行 PCR 篩選菌落 ↓ 選殖出之菌落經培養後抽取質體，並以質體為模板分別作三管 PCR 反 應，三管分別的引子為 (目標基因 Forward+Reverse ; 僅有目標基因 Forward ; 僅有目標基因 Reverse)，此目的可檢驗三種可能結果： 1.確定選殖基因為該設計引子所選殖出。. 21.
(32) 2.排除可能在相同位子大小的條帶是由單一引子 Forward 所選殖出。 3. 排除可能在相同位子大小的條帶是由單一引子 Reverse 所選殖出。 挑選檢驗無誤的質體送定序公司分析查核結果 (若結果經分析不符則重 新設計引子)。定序結果若成功選殖出所需基因，則進行 5’RACE 及 3’RACE 實驗(Roche Applied Science, Germany)。 其中日本鰻 PTEN 基因選殖的引子是由斑馬魚的序列(GeneBank accession number : CAD60625)中設計出，引子序列為： Forward: 5'-GATGACGTCGTTCGGTTTCTGG-3' Reverse: 5'-GGTAATGATCCGGCTCGTTGTC-3' 反 應 條 件 為 ： 94℃,2 分 鐘 (denaturing),1 cycle ; 94℃,30 秒 (denaturing),55℃,30 秒 (annealing),72℃,1 分 鐘 (elongation),30 cycle ; 72℃,15 分鐘,1 cycle。. 2.11 PTEN. 5’/3’RACE. 2.11.1 PTEN 5’RACE 首先，設計三段特異性 Reverse 引子(sp1、sp2、sp3)，以 sp1 為反轉 錄作用引子製作特異性基因 PTEN cDNA，以 Viogene Gel-M Kit 純化 cDNA(20μl)後，放置於 94℃,3 分鐘反應再置入冰中反應 1 分鐘。接著以 尾端轉移脢(Invitrogene TdT recombinant)進行加 A 反應，反應條件為 37℃,30 分鐘、70℃,10 分鐘後置入冰中。最後，以引子 sp2 及 OligodT15. 22.
(33) 進行第一次 PCR 反應，以 sp3 及 OligodT15 進行第二次 PCR 反應。往後 步驟如同 2.10 選殖基因方法。. 2.11.2 PTEN 3’RACE 首先，設計特異性 Forward 引子，以全組織 RNA 所轉錄的 cDNA 為 模板，接著以 Vial 9 和特異性 Forward 引子進行 PCR 反應。往後步驟如 同 2.10 選殖基因方法。. 2.11.3 Primers PTEN Long form-Like 5’RACE primer Sp1: 5'- CTGAACCCGTGTGGAATCTGC -3' Sp2: 5'- CACGCTCCGAGCTCTCGATTC -3'. PTEN Short form-Like 5’RACE primer Sp1: 5'-CCCGTAGAAGTCGAGCGCCGTCCTG-3' Sp2: 5'-AGTGGAATGGCGGCCACGTGATTGG-3' Sp3: 5'-GTTGTGGTCTTCAAACGGGTACTGTGCA-3'. PTEN Long form-Like 3’RACE primer long PTEN F：5’-GCAGATTCCACACGGGTTCAG-3’. PTEN Short form-Like 3’RACE primer. 23.
(34) Short PTENf：5’-GGCTGCTTCCTCCCCTCGAGC-3’. 2.12 RT-PCR (reverse transcriptase PCR) 分析表現量 將不同處理的實驗鰻或實驗細胞抽取全 RNA 逆轉錄為 cDNA 後，以 cDNA 為模板及欲分析基因的專一性引子經由 PCR 反應提升樣品濃度以 進行分析。PCR 反應產物經 DNA 電泳分析後，利用 Ezlab 膠片影像分析 軟體比較實驗組與對照組之間表現量差異。其中，以 cytochrome b 作標 準基準基因(Internal standard)。最後，以 Sigma Plot 軟體進行數據分析。 分析基因各設計引子為： VEGF(F12 , R340) F12：5’-ATGAACTTTGCTGCCAGCTTG-3’ R340：5’-AATTGTGTTGCGTCACATGC-3’ PTEN Long form-Like(pf , long PTEN R) pf：5’-GATGACGTCGTTCGGTTTCTGG-3’ long PTEN R：5’-CTGAACCCGTGTGGAATCTGC-3’ PTEN Short form-Like(pf , pr) pf：5’-GATGACGTCGTTCGGTTTCTGG-3’ pr：5’-GGTAATGATCCGGCTCGTTGTC-3’ FLK-1(Eflk-1 F3016 , Eflk-1 R3307) Eflk-1 F3016：5’-TTATCGTGGAATTCTGCAAGTATGG-3’ Eflk-1 R3307：5’-AGAACTCCATGCCTTTAGCCACTT-3’ Cytochrome b(eelcytb rv , eelcytb fw). 24.
(35) eelcytb rv：5’-GTAAAGGTATGAGCCGTAGTAAAG-3’ eelcytb fw：5’-CACAAATCCTTACAGGACTATTCC-3’ IGF-1(Ea1F , Ea1R) Ea1F：5’-GAGACCCTGTGTGGGGCA-3’ Ea1R：5’-TTCTGATGCACCTCCTTCTGGGTT-3’. 2.13 卵巢石蠟組織切片染色 2.13.1 石蠟包埋 2.13.1.1. 將部份組織浸泡於固定液中(Bouin’s fluid)過夜 (overnight)，存放於 4℃。隔天，使用 50%酒精洗滌數次 之後浸泡於 50%酒精 4 小時且放置平衡儀搖晃(此步驟目 的為移除苦味酸(Picric acid)以防傷害組織)，完成後儲存於 70%酒精中。. 2.13.1.2. 進行修片(Trimming)步驟，修整組織厚度為 3mm 後置於脫 水器內充分水洗。. 2.13.1.3. 脫水(Dehydration)步驟，以 70%酒精浸泡 1 小時、80%酒 精浸泡 1 小時、95%酒精浸泡 1 小時、100%酒精浸泡 50min(因酒精會使組織皺縮或變形，因此不能浸泡於高濃 度久經過久，尤其是 100%酒精)，以上皆需放置平衡儀搖 晃。. 2.13.1.4. 清洗(Cleaning)步驟，使用二甲苯(Xylene)浸泡組織於室溫 1 小時以脫除酒精部份，且二甲苯可溶於石蠟中。. 25.
(36) 2.13.1.5. 浸潤(Infiltration)步驟，將浸泡二甲苯於室溫 1 小時的組織 換至 65℃二甲苯中浸泡 1 小時，之後，換至二甲苯：石蠟 (1：1)的比例混和液中於 65℃浸泡 1 小時，最後，換至全 蠟中於 65℃浸泡 1 小時(次步驟為使用硬石蠟(溶點 52~62℃)，若石蠟過熱，組織與石蠟將產生裂痕)。. 2.13.1.6. 包埋(Embedding)步驟，首先，將溫熱石蠟倒入包埋模內， 約一半量(避免產生氣體)，接著置放包埋模於冷盤中，待 包埋模底部開始冷凝.時置入組織(切面朝下)，隨後立即加 入溫石蠟補足包埋模約八分滿使其冷卻靜置，冷卻成形後 將石蠟塊取出整修成梯型狀。. 2.13.2 石蠟切片 首先，使用石蠟切片機，調整間距為 5μm 進行切割。第二，置於冷 水槽中伸展，以塗抹蛋白之乾淨玻片撈取。第三，置於水槽周邊加熱板 上乾燥(不可過熱過久，將導致石蠟溶解)。 2.13.3 Giemsa染劑染色 首先，進行脫蠟步驟，1.以二甲苯浸泡 2 分鐘，2.換另一槽二甲苯浸 泡 2 分鐘，3.換至 100%酒精浸泡 2 分鐘、95%酒精浸泡 2 分鐘、80%酒 精浸泡 2 分鐘、70%酒精浸泡 2 分鐘。第二，待乾燥後，浸泡於 Gimsa : 水(1:20)混合液中 10~15 分鐘。第三，清洗玻片後室溫下乾燥，而後，進 行加蓋，完成石蠟組織切片染色。. 26.
(37) 2.14 Image J 影像分析軟體測量卵截面積大小 首先，使用倒立顯微鏡觀察卵徑並拍照。之後，利用 Image J 影像分 析軟體分析並記錄卵細胞截面積大小，以 Excel 進行統計並做出卵細胞截 面積大小分佈圖。. 2.15 統計方法 實驗數據計算的表示方法為平均值±平均標準誤差(mean±SEM)，實 驗數據結果以 Student’s t-test 分析統計 (SigmaPlot 2000,USA)。當 P<0.05(P value)時，視為有統計上的差異。. 27.
(38) 三、結果 3.1 PTEN 基因選殖結果的分析與比較 目前已選殖出PTEN Long form-Like (954bp , 318a.a.)及PTEN Short form-Like (843bp , 281a.a.)兩個序列，兩者之間核甘酸的差異為Short form 有一段 69bp 的缺失片段。然而，不同處大多位在搖擺區 (wobbling site)，故兩者間胺基酸差異性遠小於核酸變異性。在多物種樹狀親緣分析 (圖6)及多物種胺基酸序列比對下(圖7)，結果顯示318個胺基酸的長鏈 PTEN較接近斑馬魚PTEN b form long splice(89%)，而281個胺基酸短鏈 PTEN較接近斑馬魚zebrafish PTEN b short splice(83%)。故長短鏈各別命 名 為 PTEN Long form-Like 及 PTEN Short form-Like ， 且 分 別 發 表 於 NCBI(accession number: EF207373 ; accession number:EF207374)。. 3.2 由基因表現調節確認鰻魚PTEN功能 3.2.1 細胞培養及實驗處理條件測試 初代細胞由鰻魚眼球而來，首先，我們以0%、0.1%、0.5%、1%、 5%、10%不同的胎牛血清添加濃度進行實驗。結果顯示 0.5% 血清濃度 為較適實驗濃度(圖8)，其中，0% 血清濃度在細胞培養第二天會出現潰 散現象，10% 血清濃度使細胞受血清含量過高而影響待測基因表現(圖 8)。在 IGF-1 及 Insulin 的處理濃度測試實驗中，我們分別以 IGF-1 (20ng/ml、100ng/ml) 及 Insulin (200ng/ml、1000ng/ml) 進行實驗。結果 顯示 20ng/ml IGF-1及 200ng/ml Insulin為較佳的實驗濃度(圖9，圖10)， 其中，分別在高劑量100ng/ml IGF-1及1000ng/ml Insulin作用下細胞無毒. 28.
(39) 殺反應現象，且 IGF-1對於 PTEN表現量的抑制效果(控制組0.33倍) (圖 9)似乎較 Insulin(控制組0.63倍) (圖10) 為佳。在Troglitazone 的處理濃度 測試實驗中，我們分別以0、5、10、20、30、50μΜ 進行實驗。結果顯 示10μM為刺激PTEN表現量的最佳處理濃度(控制組4.1倍)(圖11)。此處 PTEN為PTEN Short form-Like，我們亦有分析PTEN Long form-Like，但 在眼睛細胞中沒有PTEN Long form-Like表現。. 3.2.2 IGF-1 對鰻魚PTEN與VEGF表現的影響 以IGF-1 (20ng/ml) 分別在6、12、16、20、24小時處理後分析其PTEN 與VEGF的表現量。結果顯示VEGF表現量隨著處理時間遞增，在處理20 小時後達到最高表現(控制組9倍)(圖12)；PTEN表現量隨著處理時間遞 減，在處理16小時後為最低量表現(控制組0.33倍)(圖13)。 3.2.3 以Troglitazone處理鰻魚眼球細胞並分析其PTEN與VEGF的表現量 以Troglitazone(10μM)分別在0、6、12、16、20、24小時處理後分析 其PTEN與VEGF的表現量。結果顯示VEGF表現量隨著處理時間遞減，在 處理24小時後有最低表現量(對照組0.64倍)(圖14)且似乎有持續降低的趨 勢；PTEN表現量隨著處理時間遞增，在處理24小時後有最高表現量(對照 組2.07倍)(圖15)且似乎有持續增高的趨勢。. 3.3 自然發育且不同體型大小的日本鰻紅體及肝臟組織中PTEN 與VEGF之表現. 29.
(40) 首先，我們觀察11條體型大小不同(體重44~1141克)的日本鰻中，其 體型的不同與體內紅體組織相對應的關係，結果顯示紅體組織重與體重 生長曲線成正相關(r=0.96)，其中僅有1條鰻魚特異性未於生長曲線上(圖 16)。在此結果顯示紅體組織似乎會隨著體型增長而成長，但有一臨界極 限值。以RT-PCR分析其VEGF和PTEN表現量與生長總重的相關性，結果 顯示VEGF與紅體大小無顯著相關性(r2=0.01)(圖17)，但與PTEN呈負相關 (r2=0.45)(圖18)。在此，VEGF為內皮細胞生長因子，PTEN為其作用訊息 的抑制因子，而顯示VEGF/PTEN比值的確與紅體生長大小呈正相關 (r2=0.46) (圖19)。隨之，我們好奇是否此現象在各組織皆有相同趨勢，故 取體型大小不同的7條日本鰻之肝臟組織進行相同分析。結果顯示肝臟組 織總重與體重生長區線成正相關(r=0.98)(圖20)，但其VEGF與PTEN表現 量 與 肝 重 皆 無 顯 著 相 關 性 (r2 =0.04 ; r2 =0.001) ( 圖 21; 圖 22) ， 且 VEGF/PTEN比值亦與肝臟重無顯著相關性(r2 =0.31)(圖23)。由以上結果 我 們 初 步 推 測 ， PTEN 影 響 組 織 大 小 的 作 用 在 紅 體 中 較 為 明 顯 ， 且 VEGF/PTEN的比值調控的確與其組織大小呈正相關。PTEN和VEGF對於 組織大小及增長質量上的影響可能存在組織特異性，在細胞種類較為複 雜的肝臟組織中，PTEN及VEGF的表現量無法反映其組織成長狀況。. 3.4 比較不同的外源促性腺激素(HCG , CPE)相互進行催熟實 驗對性腺組織的影響 以不同的外源促性腺激素相互作用實驗共分為四組，每組各7條魚 (每週施打一針，共處理8週，第8針後一天統一採樣)：控制組(CC)、8針. 30.
(41) 皆施打CPE(PP)、8針皆施打HCG(HH)、前4針CPE後4針HCG(PH)。 結果 顯示控制組的GSI為1.07 + 0.15 % (mean + SD)，經由CPE或HCG處理的三 組PP、PH、HH組GSI相對於控制組分別為其2.09倍、2.12倍和2.47倍 (圖 24)。由此結果乍看HH組似乎有較好的催熟效果，但個體偏差值範圍過大 (2.72 + 0.69 %)，反觀PH組整體差異性較為一致(2.65 + 0.28%)(圖24)。以 RT-PCR分析個別VEGF表現量結果顯示，控制組VEGF表現量為0.47 + 0.26 arbitrary unit (mean + SD)，而相對於控制組PP、HH、PH組分別為其 1.27倍、1.29倍、1.02倍(圖25)。由此結果顯示VEGF表現量似乎受到促性 腺激素雙極現象的影響(圖25)，導致有雙向性的變化(同時呈現刺激及抑 制的兩向變化)。然而，VEGF表現量相對於GSI相關性(r2 )值，四組CC、 PP、HH、PH分別為0.39、0.54、0.91 以及0.08正相關(圖26)，整體相關 性(r2 )值為0.13正相關(圖27)。倘若單獨比較PP、HH兩組VEGF表現量對 GSI相關性，則r2 值為0.65正相關。. 3.5 分析日本鰻以CPE進行催熟過程中的紅體組織 3.5.1 外源促性腺激素CPE對鰻魚體型及紅體組織發育和紅體增長比率 (RMI)的影響 以外源促性腺激素CPE進行催熟實驗(分為四組，每週施打一針，共 施打9針)。其中，控制組施打9針生理食鹽水。其餘三組分別為施打第3,6,9 針時取樣，固四組組名分別為：控制組(C)、3P、6P、9P。以RT-PCR分 析紅體組織及性腺個別的VEGF、PTEN Long form-Like、PTEN Short form-Like、IGF-1及FLK-1基因表現量。. 31.
(42) 紅體組織總重在催熟過程中 3P、6P、9P 組分別相對於控制組增長 1.08 倍(p>0.05)、1.82 倍(p<0.05)、2.56 倍(p<0.05)(圖 28)，其 RMI 分別增 長 1.06 倍(p>0.05), 1.77 倍(p<0.05)、2.51 倍(p<0.05)(圖 29)。 3.5.2 VEGF和FLK-1 在CPE催熟後的紅體組織中表現量分析 VEGF 表現量在施打至第 6 針前與 RMI 呈正相關，但於第 9 針時表 現量降回標準值，分別 3P、6P、9P 組相對於控制組成長 1.51 倍(p<0.05)、 2.26 倍( p<0.05)、1.39 倍(p<0.05)(圖 30)。FLK-1 表現量和 RMI 的對應關 係與 VEGF 對 RMI%趨勢相同且 3P、6P、9P 組分別成長 6.14 倍(p<0.05)、 8.85 倍(p<0.05)、0.57 倍(p>0.05)(圖 31)。 3.5.3 IGF-1 在CPE催熟後的紅體組織中表現量分析 我們也分析 IGF-1 表現量，已知其亦為一種促血管新生因子 (Lopez-Lopez et al., 2004; Froment et al., 2005)。然而結果顯示以 CPE 催熟 的紅體組織中 IGF-1 表現量並無被刺激提升的現象，其在處理第 6 針時 反倒有被抑制的現象 0.66 倍(p<0.05)，隨即在處理第 9 針時些微提升了表 現 0.76 倍(p>0.05)(圖 32)。 3.5.4 分析紅體組織中PTEN Long form-Like和PTEN Short form-Like在 CPE催熟後的表現量 在 3P、6P、9P 組中紅體組織的 PTEN Long form-Like 經 CPE 處理後 表現量相對於控制組分別被抑制 0.72 倍(p<0.05)、0.12 倍(p<0.05)、0.01 倍(p<0.05) (圖 33);而 PTEN Short form-Like 的表現量分別被抑制 0.24 倍 (p<0.05)、0.13 倍(p<0.05)、0.06 倍(p<0.05)(圖 34)。其中，兩者抑制的趨 勢圖平行相符(圖 35)。. 32.
(43) 3.5.5 分析經由CPE催熟處理過程中，RMI與紅體組織VEGF、PTEN、IGF-1 及FLK-1 表現量的相對關係 首先，各實驗組(VEGF/PTEN Long form-Like)比值相對於控制組分別 成長了 3P(2.08 倍, p<0.05)、6P(19.67 倍, p<0.05)、9P(108.03 倍, p<0.05)， 而(VEGF/PTEN Short form-Like)分別成長 3P(2.07 倍, p<0.05)、6P(18.21 倍, p<0.05)、9P(23.28 倍, p<0.05)(圖 36)。此結果顯示比值(VEGF/PTEN Short or Long form-Like)比值似乎與 RMI 成長曲線趨勢(由初始控制組至 施打 9 針 CPE)平行相符(圖 36)。分析 3P、6P、9P 三組成長比率 (FLK-1/PTEN Long form-Like)相對於控制組分別為 7.75 倍(p<0.05)、77.75 倍(p<0.05)、38.00 倍(p<0.05)(圖 37)，而(FLK-1/PTEN Short form-Like)分 別為 10.00 倍(p<0.05)、87.00 倍(p<0.05)、11.00 倍(p<0.05)(圖 37)。然而 (IGF-1/ PTEN Long form-Like)比值相對於控制組亦有逐漸增加的趨勢 1.32 倍(p<0.05)、6.00 倍(p<0.05)、57.80 倍(p<0.05)，而(IGF-1/ PTEN Short form-Like)比值相對於控制組分別為 1.33 倍(p<0.05)、5.83 倍(p<0.05)、 13.14 倍(p<0.05) (圖 38)。. 3.6 分析日本鰻以CPE進行催熟過程中的卵巢組織 3.6.1 外源促性腺激素CPE或HCG對日本鰻卵巢組織的增長和GSI的影 響 以外源促性腺激素CPE和HCG進行催熟實驗(分為五組，每週施打一 針，共施打9針)。其中，控制組施打9針生理食鹽水，對照組施打9針HCG。 其餘三組分別為施打第3,6,9針時取樣，固四組組名分別為：控制組(C)、. 33.
(44) 3P、6P、9P、9H。以RT-PCR分析卵巢及性腺組織個別的VEGF、PTEN Long form-Like、PTEN Short form-Like、IGF-1基因表現量。 卵巢組織 GSI 在催熟過程中 3P、6P、9P 組分別相對於控制組增長 1.66 倍(p>0.05), 2.66 倍(p<0.05)、3.58 倍(p<0.05)(圖 39)。 3.6.2 VEGF在CPE催熟後的卵巢組織中表現量分析 以CPE進行催熟的過程中，GSI會隨著催熟時間而增長。其中，以CPE 催熟過程的VEGF表現量在處理至第9針期間有持續增長現象(圖39)，表現 量的趨勢不同於紅體組織。 3.6.3 分析卵巢組織中 PTEN Long form-Like 和 PTEN Short form-Like 在 CPE 催熟後的表現量 在 3P、6P、9P 組中卵巢組織的 PTEN Long form-Like 經 CPE 處理後 表現量相對於控制組分別被抑制 0.64 倍(p<0.05)、0.47 倍(p<0.05)、0.17 倍(p<0.05) (圖 40);而 PTEN Short form-Like 的表現量分別被抑制 0.51 倍 (p<0.05)、0.31 倍(p<0.05)、0.40 倍(p<0.05)(圖 41)。 3.6.4 IGF-1在CPE催熟後的卵巢組織中表現量分析 結果顯示以 CPE 催熟的卵巢組織中 IGF-1 表現量在 3P 組被刺激提 升(1.25 倍, p<0.05)，而在 6P 組反倒有被抑制的現象(0.25 倍，p<0.05)， 隨後，在 9P 組些微提升了表現(0.3 倍，p>0.05)(圖 42)。 3.6.5 分析經由 CPE 催熟處理過程中，GSI%與卵巢組織 VEGF、PTEN 與 IGF-1 表現量的相對關係 首先，各實驗組(VEGF/PTEN Long form-Like)比值相對於控制組分別 成長了 3P(4.12 倍, p<0.05)、6P(16.31 倍, p<0.05)、9P(116.03 倍, p<0.05)(圖. 34.
(45) 43)，而(VEGF/PTEN Short form-Like)比值分別成長 3P(2.07 倍, p<0.05)、 6P(6.32 倍, p<0.05)、9P(12.54 倍, p<0.05)(圖 44)。結果顯示在卵巢中(V/P) 值和 GSI 的關係與紅體中趨勢相同。然而(IGF-1/ PTEN Long or form-Like) 比值相對於控制組僅有在 9P 組被刺激增加表現量 7.3X (p<0.05)(圖 45)。 而(IGF-1/ PTEN Short form-Like)比值相對於控制組分別為 1.59 倍 (p<0.05)、2.27 倍(p<0.05)、1.77 倍(p<0.05) (圖 46)，其中，3P 與 6P 組有 逐漸上升的趨勢，但 9P 組已被抑制表現。. 3.7 分析不同激素催熟之卵截面積大小分佈及卵異質度變化 將3.3催熟試驗中卵巢部份組織製作成石蠟切片，以觀察及分析卵 截面積大小分佈(圖48、49、50、51)。因CC組的卵截面積大小分佈相當 集中於同一區域(圖37)，故可作為石蠟切片截面積方向性誤差範圍一基準 值，使之適用於計算不同促性腺激素處理下的卵均質度及發育同步性。 然而，不同激素處理下導致卵均質度的差異程度以卵異質度 (Heterogeneity, Heterogeneity=1/Homogeneity)表示。由結果顯示，我們推 測PP組卵巢發育的程度比HH及PH組較不同步，且HH組卵巢發育同步性 較PH組為佳(圖47)。另一方面，GSI相對於卵的異質度似乎呈正相關，與 PP及PH組相關性(r2)分別為0.77、0.48(圖52)，但與HH組無顯著相關性(r2 =0.01)(圖52)。此差異情形我們推測可能是在卵巢發育過程中，HCG和CPE 利用不同的反應機制進行促性腺成熟作用所造成。然而，此結果在VEGF 表現量對應卵異質度上似乎也有同樣的趨勢(HH組,r2 =0.008 ; PP組,r2 =0.64 ; PH組, r2 =0.25(圖53)。. 35.
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