第三章、 材料與方法
第二節、 晶片的製作及實驗設備
1. ITO 玻璃晶片之設計與製作 1.1. 晶片本身
本研究使用350.0×300.0×0.5 mm(L×W×H)的 ITO 玻璃 (GemTech Optoelectronics Co., Taoyuan, Taiwan)為基材，此玻璃母基板上，已濺 鍍完成一層厚約2600 Å 的 ITO 薄膜，表面電阻值約為 5 (Ω/sq)，經表 面拋光後可見光穿透率≧80％。
ITO 玻璃晶片的大小設計為(76×28 mm)與一般玻片規格相同，電 極的形式將被設計成許多不同的規格及樣式。等面積平板間隙電極 (Gap electrodes)，其間隙又分為 0.05mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、
0.5mm、0.6mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、5mm、6mm、8mm、
10mm 等，如<圖 2>；成對趾狀電極(Interdigital electrode structures, IDES)，其線寬及間距又分為 0.05mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm，如<
圖3>;趾狀十倍間隔電極，其線寬又分為 0.05mm、0.1mm、0.2mm、
0.4mm，如<圖 4>；趾狀十倍大小差距電極，其小電極之線寬及間距 又分為0.05mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm，如<圖 5>。另外也在晶片 側邊設計線路接觸片(Fingers)可與邊接頭(Edge Connector)拔插做連 結<圖 6>，電極圖案藉由 CAD 軟體繪製並製做成光罩(Photo mask)<
圖7>
在財團法人國家實驗研究院-儀器科技研究中心(ITRC)，我們利用 光微影技術(photo-lithography)將 ITO 玻璃晶片製作出來。首先將 ITO 玻璃裁切為90×80 mm 長方，清洗並置於加熱板(hot plate)上 100℃乾 燥10 分鐘<圖 8A>。ITO 玻璃經離心塗佈機(spin coater)將光阻(photo resist)(AZ 6112, AZ Electronic Materials Taiwan Co., Ltd.)塗佈在 ITO 層 的表面<圖 8B>，經加熱板 90℃軟烤 5 分鐘，去除光阻大部分溶劑，
增加和晶片的附著力<圖 8C>。將預先製作完成的光罩利用光罩對準 曝光系統(Mask Aligner System)(MA6, Karl Suss, Germany)將設計好 的線路圖形投影在晶片上<圖 8D>。我們使用的是正光阻，在顯影 (development)過程中，顯影液(KTD-1, Kemitek Industril Co., Hsinchu, Taiwan)將經過光照分解的光阻層除去，保留未曝光部分的光阻層可 以保護底下的ITO<圖 8E>。經 120℃將光阻中樹脂成分烤硬<圖 8C>，
以利於後續蝕刻處理。蝕刻以 ITO 蝕刻液(EG-462 ITO Etch, eSolv Technology Co., Taipei, Taiwan)蝕刻無光阻保護的 ITO 部分<圖 8F>，
最後以丙酮移除剩餘的正光阻部分， 如此已完成ITO 的電極在玻璃 母基板上的製作<圖 9>。之後再以烏鋼刀裁切玻璃晶片成確切的大 小，經細部磨邊導角之後成為我們實驗使用的晶片<圖 10>，詳細的 流程見<表 1>。
1.2. 晶片上細胞培養格之建立
本研究選用可重複使用 8-well 的矽膠格(flexiPERM® 90032039, Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany)<圖 11A>貼附在 ITO 電極晶 片<圖 11B>上以製造八個細胞培養格<圖 11C>。此矽膠格包含八格分 隔，適合貼附在玻片等平滑表面，具有化學穩定性且可重複清洗、重 複高溫高壓滅菌及可重複組合使用的優點。
1.3. 清洗及滅菌
進行細胞培養實驗前晶片以超音波清洗機進行晶片清洗，以清潔 劑、丙酮、去離子水各 15 分鐘，每道清洗後皆以去離子水沖洗。晶 片以氮氣(N2stream)吹乾後放進烘箱中乾燥。
8-well flexiPERM®以清潔劑、70%酒精、去離子水，超音波清洗 各15 分鐘，每道清洗後皆以去離子水沖洗。吹乾後將 flexiPERM®與 晶片組合，以(飽和水蒸氣,120℃,1.2 kg/cm2)高溫高壓滅菌(Autoclave) 20 分鐘後乾燥備用。
2. 實驗測量設備 2.1. 測量原理
參考傳統細胞阻抗分析的測量方法(Xiao and Luong,2005)，我們以 鎖相放大器(SIGNAL RECOVERY Model 7225 DSP Lock-in Amplifier, AMETEK Inc., TN, USA)作為測量的主要工具。利用鎖相放大器測量 的相內(in-phase)電壓值即 X 輸出(VX)及相外(out-of-phase)電壓值即 Y 輸出(VY)，計算出電阻及電容抗。
在 交 流 R-C 電 路 中 ， 總 阻 抗 Z(impedance) 包 括 了 電 阻 抗 R(resistance)的部分及電容抗 XC(capacitive reactance)的部分。其中通 過電容器的電壓將落後電流 90°。若以複數平面來表示，阻抗包括了 實部(real)電阻抗的部分以及虛部(image)電容抗的部分，如(式 1)。
Z ＝ R － j XC (式 1)
2.2. 設備架構
與晶片直接連結的是信號切換盒(Switch Box)，它用於切換欲偵測 的細胞格(well)，由電腦軟體控制切換器去指定哪一塊晶片上的哪一 格要被偵測，來達到多個樣本的自動量測。信號切換盒的內部電路以 數位訊號控制類比多工器(Analog multiplexer)選擇且驅動磁簧開關 (Relay)，藉此打開欲量測的細胞格，其電路設計如<圖 12>；信號切 換器的外部則密封處理，使其可置於細胞培養箱中與待測晶片連結<
圖13>。
實驗設備的架設如<圖 14>所示。阻抗量測以鎖相放大器作為工 具。由鎖相放大器提供1V 不同頻率(100~100K Hz)的參考交流訊號，
經過 1MΩ金屬皮膜電阻串聯至待測樣本後到地，再由鎖相放大器測 量待測樣本兩端的相內(in phase)電壓及相外(out-of-phase)電壓，依前 述公式(式 2)分壓定理可以推算串聯電路中樣本的電阻抗(resistance) 值與電容抗(capacitive reactance)值。
儀 器 控 制 的 部 分 ， 藉 由 LabVIEW™(National Instrument Co., TX,USA)我們自行撰寫開發控制程式，透過電腦 RS-232 介面連結鎖 相放大器，做參數控制、程式化測量、數據擷取以及資料的記錄，
並透過這台鎖相放大器的數位輸出埠(Digital output port)來間接控制 我們的訊號切換盒(Switch Box)。
2.3. 自動控制、數據的擷取、儲存與分析
儀器控制、數據的擷取與儲存由電腦程式所負責。我們使用 LabVIEW™撰寫程式，程式透過電腦 RS-232 介面與鎖相放大器連結 溝通，自動控制鎖相放大器的各種參數及功能，如：參考信號的振幅 及頻率、參考信號的相位、測量時的靈敏度及時間常數等等…。同時 也由鎖相放大器的數位輸出埠(Digital output port)來間接控制我們的 訊號切換盒(Switch Box)，選擇量測的細胞格(well)。並且依指定的時 間間隔做不同時間點的量測，達到連續量測的目的，最後再將這些不 同時間點、不同細胞格的測量結果儲存成檔案，以此檔案再由另一程 式做進一步的資料換算及作圖。簡易的程式流程如<圖 15>。程式之 人機介面圖示於<圖 16>。