第三章、 材料與方法
第六節、 細胞膜蛋白之偵測
本研究針對細胞膜蛋白 Integrin β1，使用免疫染色的相關概念，
在培養液中加入抗體來抓住細胞膜上的Integrin β1蛋白。在這些實驗 中使用的抗體分為兩類：主要用來辨識膜蛋白的第一級抗體，以及用 於標示一級抗體的第二級抗體。
在第一級抗體中，一為mouse anti- human Integrin β1 IgG (sc-9970, Santa Cruz Biotechnology Inc., California, USA)可連結細胞表面的 Integrin 蛋 白 ； 另 一 個 作 為 對 照 的 rabbit anti-Rat Ig (P0450, DakoCytomation, Denmark)，將不與任何細胞膜蛋白結合。
在第二級抗體中，一為帶有直徑 10nm 金粒子的 goat anti-Mouse IgG-Au (25129, Electron Microscopy Sciences, PA, USA)，原為電子顯 微鏡所使用的免疫標示抗體；另一為帶有綠色螢光的goat anti-Mouse IgG-FITC (sc-2010, Santa Cruz Biotechnology Inc., California, USA)，可 用於螢光顯微鏡或共軛焦顯微鏡的觀察。
1. 不同濃度的 anti-Integrin 一級抗體之阻抗量測
第一級抗體使用mouse anti-human Integrin β1 IgG；無使用第二級 抗體。
將 5×104 cells/mL 的細胞培養在晶片上，實驗組(共 4 格)加入 300μL的細胞懸浮液；對側之控制組(共 4 格)則加入 300μL的新鮮培 養基，最後將晶片置於37℃，5％的 CO2細胞培養箱中。於接種後24 小時，即細胞貼附完成，在晶片上分別加入不同稀釋倍數的一級抗 體，100 倍稀釋(1:100)、300 倍稀釋(1:300)、500 倍稀釋(1:500)、以及 不加抗體。並設定以4000Hz 每 5 分鐘自動量測一次，且記錄鎖相放 大器的 X 輸出及 Y 輸出，以進一步換算電阻抗值及電容抗值，且將 實驗組減去對側控制組的測量值作為 ΔR。在實驗過程中，皆不做任 何細胞培養液的更換。
2. 金粒子抗體連結細胞膜蛋白 I nt e gr i n β1之阻抗量測
第一級抗體使用mouse anti-human Integrin β1 IgG；第二級抗體則 為帶有奈米級金粒子的goat anti-Mouse IgG-Au。
將 1×105 cells/mL 的細胞培養在晶片上，實驗組的 4 格各加入 300μL的細胞懸浮液；對側之控制組的 4 格則各加入 300μL的新鮮培 養基，以前述之相同方式培養在A、B 兩片晶片中。最後將晶片置於 37℃，5％的 CO2細胞培養箱中。於接種後24 小時，即細胞貼附完成，
在 A 晶片上分別加入一級抗體、二級抗體、一級加二級抗體、不加 抗體，其抗體加入細胞培養液後濃度為原始的1/50 倍(1:50)；在 B 晶 片上其抗體加入細胞培養液後濃度為原始的1/100 倍(1:100)。並設定 以4000Hz 每 5 分鐘自動量測一次，且記錄鎖相放大器的 X 輸出及 Y 輸出，以進一步換算電阻抗值及電容抗值，且將實驗組減去對側控制 組的測量值作為ΔR。在實驗過程中，皆不做任何細胞培養液的更換。
3. 不同一級抗體之阻抗量測
第一級抗體使用 mouse anti-human Integrin β1 IgG，以及 rabbit anti-Rat Ig；第二級抗體則為帶金粒子的 goat anti-Mouse IgG-Au。
將 5×104 cells/mL 的細胞培養在晶片上，實驗組的 4 格各加入 300μL的細胞懸浮液；對側之控制組的 4 格則各加入 300μL的新鮮培 養基，最後將晶片置於37℃，5％的 CO2細胞培養箱中。於接種後24 小時，即細胞貼附完成，在晶片上分別加入 anti-Integrin 一級抗體加 二級抗體、anti-Rat 一級抗體加二級抗體、只加二級抗體、不加抗體，
其抗體加入細胞培養液後濃度為原始的 1/100 倍(1:100)。並設定以 4000Hz 每 5 分鐘自動量測一次，且記錄鎖相放大器的 X 輸出及 Y 輸 出，以進一步換算電阻抗值及電容抗值，且將實驗組減去對側控制組 的測量值作為ΔR。在實驗過程中，皆不做任何細胞培養液的更換。
4. 細胞免疫螢光染色
第一級抗體使用mouse anti-Integrin β1 IgG；第二級抗體則改使用 帶螢光的goat anti-Mouse IgG-FITC。
將 1×104 cells/mL 的細胞培養在晶片上，實驗組的 4 格各加入 300μL的細胞懸浮液；對側之控制組的 4 格則各加入 300μL的新鮮培 養基，最後將晶片置於37℃，5％的 CO2細胞培養箱中。於接種後24 小時，即等待細胞貼附完成後，以 PBS 對細胞作清洗兩次，並以 4
％ paraformaldehyde 室溫固定 15 分鐘，再以 PBS 清洗兩次。隨後細 胞以EtOH 95％ / CH3COOH 5％在-20℃穿孔 15 分鐘，並以 PBS 清 洗三次每次 5 分鐘。加入一級抗體，於 4℃過夜培育，之後以 PBST 清洗兩次；加入二級抗體，於室溫培育1 小時，之後以 PBST 清洗兩 次。免疫螢光染色完成後，加上蓋玻片封片，最後螢光顯微鏡以激發 光488nm 及發射光 530nm 觀察。
5. Integrin 膜蛋白之定量試驗
將細胞以四種不同的濃度 ，5×105cells/mL、2.5×105cells/mL、
1.2×105cells/mL、5×104cells/mL，培養於晶片及 96 孔盤中。
待接種細胞 24 小時後加入抗體。於晶片實驗組中加入 mouse anti-Integrin β1 IgG及帶金粒子的 goat anti-Mouse IgG-Au；對照組則 加入PBS 及帶金粒子的 goat anti-Mouse IgG-Au。並且置於細胞培養 箱中與儀器連結，連續量測24 小時。
96 孔盤待細胞接種後 24 小時後做免疫螢光染色。第一級抗體使 用 mouse anti-Integrin β1 IgG；第二級抗體則使用帶螢光的 goat anti-Mouse IgG-FITC。在細胞培養箱中與細胞共同培養，於第 48 小 時結束實驗，並以PBS 清洗 96 孔盤三次，移去液體後利用多功能微 盤分析儀(Chameleon, Hidex, Turka, Finland)於激發光 485nm 及發射光 535nm 讀取螢光密度之數值。
最後將晶片第 48 小時之電阻抗變化量與螢光讀值做相關比較及 分析。