月芽藻毒性試驗

本實驗中所使用的月芽藻 （Pseudokirchneriella subcapitata，舊名 Selenastrum

capricornutum）

其優點為：取得容易、培養簡單、容易觀察、生長期短、可以大量生長、具有本土代表 性而且比大部分生物試驗來的敏感(Rojíčková-Padrtová et al., 1998)。當培養過程中缺少 營養鹽或溫度、光照、pH、有毒物質侵害或細菌滋生等環境條件不佳時，月芽藻會逐漸 呈現明顯的黃綠色，故從外觀可以容易地去判斷生長情形。另外也可透過顆粒計數器觀 察其粒徑的分佈，若發現顆粒數變少、聚集成團的藻類數量變多時，表示藻的生長狀況 不佳。

圖 2.3.1 光學顯微鏡下的月芽藻外觀

2.3.2 密閉式藻類毒性試驗

月芽藻毒性試驗的標準方法有很多種，例如：U.S. EPA (1996)、OECD (2006) 、ISO (2012b)、APHA (1995)和 ASTM (2012b)，都是使用錐形瓶作為試驗容器進行實驗，為開 放式系統。其優點在於實驗期間能和外界空氣接觸，提供生長基質二氧化碳，給予藻類 生長所需的碳源，而且能維持生長基質的 pH 值。但是，若試驗毒物具有揮發性，則會 因為毒物散失，影響實驗結果。因此，使用密閉式試驗方法可解決此問題，然而，在實

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和比生長率（specific growth rate）。抑制率的計算公式如下：

（1）以溶氧變化量計算抑制率：

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2.3.4 藻類毒性試驗之影響因子

1. pH 和碳源

根據 U.S. EPA 標準方法製備的培養基 pH 值為 7.5±0.1，而 OECD 和 ISO 方法使用 的培養基 pH 值約為 8.1。另外，OECD 和 ISO 規定試驗期間 pH 的變化不可超過 1.5。

圖 2.3.2 為氣相中二氧化碳傳輸至藻類細胞的示意圖。藻類的生長主要利用水中溶 解的二氧化碳，其次是碳酸氫根離子。當藻類消耗二氧化碳的速率高於二氧化碳從氣相 傳輸至液相的速率時，則開始利用培養基（medium）中的碳酸氫根離子，使得氫氧根 離子濃度增加，導致 pH 上升。其反應式及 pH 計算公式如下：

2

3 OH CO

HCO ^ ^

] [CO

] log[HCO pK

pH

2 3 a







為了實驗的再現性，必須控制試驗期間培養基的 pH 值。尤其當試驗毒物為重金屬或是 弱有機酸、弱有機鹼時，容易因為 pH 改變而影響毒性強弱。可以透過減少初始的生物 質量、縮短試驗時間(Arensberg et al., 1995)或連續震盪試驗容器提高二氧化碳質傳效率 等方法來減少 pH 的增加。

圖 2.3.2 藻類培養之二氧化碳傳輸途徑(Nyholm and Källqvist, 1989)

若毒物具有揮發性，會採用密閉式的試驗方法，避免毒物濃度改變而影響實驗結果。

許多文獻的密閉式系統都是將開放式的錐形瓶密封，然後在實驗初期透過不同的方式給 予足夠的二氧化碳。Kühn and Pattard (1990)用蓋子塞住錐形瓶口，並且將 72 小時試驗

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時間縮短為 48 小時，pH 約上升 1.5。Galassi and Vighi (1981)使用 2 L 錐形瓶，僅裝入 100 mL 培養基，來增加液面上密閉空間（headspace）的體積，避免二氧化碳缺乏。但 是此方法仍會讓部分有機物揮發至氣相，所以必須用亨利常數計算或用分析儀器定量液 相中的剩餘有機物濃度。Hermann et al. (1990)額外加入 0.4 % (w/v)的 NaHCO₃至培養基 中，作為碳源，並且將初始 pH 調至中性。但是作者並沒有量測實驗結束的 pH 值，因 此無從得知 pH 的改變為何。Brack and Rottler (1994)認為提高培養基質中 NaHCO₃濃度 雖然可以增加碳源，但是離子強度上升反而會抑制藻類生長，因此設計出一種特殊試驗 容器：下方錐形瓶裝 CO₃^2-/HCO₃^-緩衝溶液，可提供氣相 1.14 %二氧化碳；上方容器含 有 30 mL 培養基。兩者以 headspace 連接，液相並無接觸，如此可防止離子強度增加。

pH 介於 6.5 和 7.5 之間。Hailing-Sørensen et al. (1996)加入 0.19 mmol NaHCO₃至培養基，

並且將 headspace 充滿 1 %的二氧化碳，試驗時間改成 48 小時，pH 僅略微增加，從 7 上升至 7.3。Mayer et al. (2000)研究結果指出保留 headspace 仍會使大量的有機物揮發至 氣相，因此將容器裝滿培養基，使其完全密閉。將 NaHCO3濃度提高為 300 mg/L，並將 pH 調至 7，兩天試驗時間後 pH 變動小於 0.5。Lin et al. (2005)用 BOD 瓶進行實驗，同 樣採用完全密閉不保留 headspace，試驗前用含 0.5 %二氧化碳之氮氣對培養基進行曝氣，

增加碳源。48 小時後 pH 約增加 1.5。

2. 光照強度

光照強度會影響藻類行光合作用的速率，而且生長速率沿著光飽和曲線（light saturation curve）增加，因此培養時必需有足夠的攪拌，生物質量不可過高、培養體積 不可太大，以免透光不足影響藻類細胞的生長(Nyholm and Källqvist, 1989)。目前沒有文 獻指出光照強度是否會影響藻類對毒物的敏感性。U.S. EPA 和 OECD 規定光照強度為 4300 lux，ISO 則是 8000 lux。大部分的研究使用連續照光，其優點為穩定控制藻類的生 長，若用光暗交替的照光方式容易讓生物質量產生很大的變異。

3. 溫度

因為溫度的變化會影響藻類的代謝作用，所以也可能會影響毒物的抑制效應。U.S.

EPA 規定 24℃。OECD 是 21 至 24℃， ISO 則是 23℃，溫度變動必須小於 2。

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4. 藻液初始密度和試驗時間

在批次式實驗中，若藻液初始密度過低，些微細胞數量變動會大幅影響生長率，因

此數據的 EC50變異性太高，再現性很差。反之若初始密度過高，會由於藻類細胞大量

增加造成代謝物累積及碳源耗盡，而影響毒性試驗結果。

試驗時間會影響物種對毒物的敏感性。時間太長，營養不足會影響藻類生長；時間 太短，毒物和藻類的接觸時間不足，無法反映出實際的抑制情形。

U.S. EPA 規定月芽藻初始細胞密度為110⁴cells/mL，試驗時間 96 小時。OECD 則 是510³10⁴ cells/mL，試驗時間 72 小時。

5. 生長基質

培養基的成份會影響藻類生長，其中氮、磷和螯合劑（chelator）最為重要。氮和磷 為藻類生長的限制性因子（limiting factor）。在水中只有 PO4

3--P 形態能夠直接被藻類吸 收，所以標準方法皆是用正磷酸鹽，如 ISO 和 OECD 是用 KH₂PO₄，U.S. EPA 是 K₂HPO₄。 氮源可用 NO₃^--N 或 NH ₄⁺-N，ISO 和 OECD 使用 NH₄Cl，U.S. EPA 則是 NaNO₃。為了 使讓藻類有效利用微量元素，會在培養基中加入螯合劑。螯合劑扮演緩衝微量元素濃度 的角色，除了維持離子濃度的恆定，也能避免鐵元素沉澱和減低重金屬的毒性。

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2.4 水蚤急毒性試驗