連續式藻類培養

本研究使用的藻種為月芽藻，購買自德州大學 The Culture Collection of Algae （UTEX 1648）。將藻種取至 250 mL 的錐形瓶中，並加入 100 mL 含 EDTA 生長基質後，放在轉 速 100 rpm 的迴轉式震盪器上，開始培養。當藻類生長達到對數期時，取 2 mL 藻液至 裝有 100 mL 生長基質的錐形瓶中，繼續培養。重複幾次上述批次方式的培養後，可將 藻液移至 4 L 的培養槽中，進行連續式培養。以磁石攪拌，避免藻細胞聚集。用蠕動幫 浦控制營養鹽的入流率，即控制稀釋率（dilution rate, D）：

V D F

F 代表入流率，V 為培養槽的體積。藉由入流率的調控，讓藻類生長維持在對數期和穩 定期。空氣會先經過潤濕並通過 0.45 μm 濾膜去除雜質才通入培養槽。待系統達到平衡 後，即可進行毒性試驗。連續式培養能讓新鮮營養鹽不斷流入、代謝廢物不斷排出，使 藻類生長環境長時間維持穩定。另外，連續式培養的藻類比起批次式培養，在毒性試驗 結有較佳的敏感性和再現性(Chen and Lin, 1997)。

培養控制條件如下：

(1) 溫度：

24  1

(2) 照度：430010% lux，冷白光。

(3) 曝氣：400mL/day。

(4) 溢流率：1300 10 %mL/day（稀釋率為 0.3 /day）。

每日量測培養槽中藻細胞的細胞密度（cell density）、平均細胞體積（mean cell volume, MCV）和溢流率，來判斷是否已經達到穩定狀態（steady state）。當上述參數值連續三 天皆在一定範圍內，即認為系統達到穩定狀態，可以進行實驗。

4.3 密閉式藻類毒性試驗

實驗的稀釋水（dilution water）使用不含 EDTA 的生長基質。因為密閉式試驗是以 BOD 瓶作為實驗容器，不會和外界空氣接觸，所以為了避免碳源不足影響藻類生長，

使用含 0.5 %二氧化碳的氮氣將稀釋水曝氣。由於二氧化碳溶於水時會降低 pH，因此曝 氣前會先加入些許 0.1 N 的氫氧化鈉，使曝氣後之 pH 在 7.5 ± 0.1 的範圍內。

從培養母槽中取出適量之藻液，分別加入 BOD 瓶中使藻類初始細胞密度為 1.5×10⁴ cells/ml。之後加入曝氣過的稀釋水至八分滿，再加入試驗藥品，最後補滿稀釋水至磨砂

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4.4 水蚤急毒性試驗

本研究使用的水蚤品種為 Daphnia magna。馴養與試驗方法是依照環境檢驗所公告 的水蚤靜水式法。以高硬度稀釋水（硬度約為 168 mg CaCO₃/L）為馴養水，溫度控制在 25 ± 2℃，光照時間 16 ± 1 小時。每天餵食飼料和月芽藻液。水蚤飼料的配製是將魚飼 料、乾酵母粉和葉草粉，以稀釋水溶解並均質攪拌，靜置 1 小時後取其上清液。月芽藻 液的製備方式為，將培養的月芽藻離心去除培養基質，再用稀釋水回溶，調整濃度為 3 × 10⁷ cells/mL。

以時齡 24 小時內的水蚤進行毒性試驗。其做法為在實驗 24 小時前，將母蚤自馴養 容器移至裝有稀釋水的燒杯中，24 小時內生出的水蚤即可用於實驗。在試驗 2 小時前，

需先餵食，而試驗期間不餵食也不換水，溫度和光照時間與培養的條件相同。試驗容器 為裝有 25 mL 試驗溶液之 50 mL 小燒杯，每個燒杯放入 5 隻水蚤。暴露時間為 48 小時。

毒性試驗之控制組死亡率若超過 10 %，則該次實驗數據不得採用。

若不確定毒物的 EC50落在哪個濃度範圍內，則需要先進行範圍尋找試驗

（range-finding test），用較高的倍率，例如 5 或 10 倍，做毒物濃度的序列稀釋。每個濃 度水蚤總數為 5 隻，意即只做 1 重複的試驗。找到 EC50的區間後，即可進行確定試驗

（definitive test）。使用不超過 2 倍的濃度稀釋序列，並且每個濃度做 4 重複，共 20 隻 水蚤。試驗終點是水蚤失去游泳的能力（immobilization），判定方法為輕輕晃動燒杯後，

水蚤於 15 秒內沒有游動。EC₅₀的計算是使用 Probit 模式。

4.5 鯉魚急毒性試驗

本研究是依照環境檢驗所制定的鯉魚靜水式法。鯉魚（Cyprinus carpio）購買自彰 化某魚場。馴養水為中硬度稀釋水（硬度為 80-100mg CaCO₃/L），溫度控制在 25 ± 2℃，

光照時間 16 ± 1 小時。馴養時間為 7 天，若死亡率低於 10 %始可進行試驗。

以全長（上顎前端至尾鰭後端的長度）2.0 至 3.0 公分之鯉魚幼魚進行試驗。實驗前 24 小時不餵食，而試驗期間不餵食也不換水，溫度和光照時間與培養的條件相同。試驗 容器為裝有 1.5 L 試驗溶液之 2 L 燒杯。暴露時間為 96 小時，期間須將死亡的鯉魚移出。

毒性試驗之控制組死亡率若超過 10 %，則該次實驗數據不得採用。

若不確定毒物的 LC₅₀落在哪個濃度範圍內，同樣需要先進行範圍尋找試驗

（range-finding test），用較高的倍率，例如 5 或 10 倍，做毒物濃度的序列稀釋。每一個 濃度的鯉魚總數為 5 隻，每個燒杯各放 5 隻。找到 EC₅₀的區間後，即可進行確定試驗

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（definitive test）。使用不超過 2 倍的濃度稀釋序列，而且每個濃度共 20 隻鯉魚，每個 燒杯裝 10 隻，做 2 重複的試驗。試驗終點為鯉魚死亡，死亡判定須符合兩條件：鰭及 鰓的活動停止以及魚體經輕觸沒反應。LC₅₀的計算是使用 Probit 模式。