三種人類常用抗生素之環境風險評估

國 立 交 通 大 學

環 境 工 程 研 究 所

碩 士 論 文

三種人類常用抗生素之環境風險評估

Environmental risk assessment of three commonly

used human antibiotics

研 究 生：王 騏 瑋

指 導 教 授：陳 重 元 教授

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摘要

抗生素是人類最常用的藥物之一，在水體環境檢測出的頻率相當高，因此需要評估 是否會對生態環境造成危害。本研究選擇三種在台灣河川中偵測濃度高的抗生素： lincomycin、suflamethoxazole 和 flumequine，使用月芽藻和水蚤進行單一毒性試驗。抗 生素對月芽藻的毒性由高至低為 lincomycin > flumequine > sulfamethoxazole，而對水蚤 則是 sulfamethoxazole > flumequine > lincomycin。根據歐洲藥物管理局制定的準則，對 抗生素進行初步環境風險評估。預測無效應濃度之計算使用本研究月芽藻以及文獻中最 敏感物種的急慢毒性數據。使用月芽藻 EC50計算的 lincomycin 的風險商數為 1.82，而 用低 NOEC 計算的 sulfamethoxazole 之風險商數為 1.102，表示具有潛在環境風險。本研 究以月芽藻測試抗生素兩兩混合之毒性效應，發現 lincomycin 和 sulfamethoxazole 混合 產生簡單相加作用，其餘兩組混合則為拮抗作用。考慮最壞情況，將三個抗生素依測得 最高濃度混合，分別以月芽藻、水蚤和鯉魚進行試驗，結果顯示沒有生物死亡或抑制情 形發生。

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Abstract

Antibiotics are one of the most widely used pharmaceuticals and can be frequently detected in aquatic environment. Therefore, it is necessary to evaluate the potential risks of antibiotics to the environment. Lincomycin, sulfamethoxazole and flumequine are three antibiotics found in Taiwan’s river with considerably high concentrations. Based on toxicity tests using Pseudokirchneriella subcapitata and Daphnia magna, the relative toxicity relationships were: lincomycin>flumequine>sulfamethoxazole for P. subcapitata and

sulfamethoxazole>flumequine>lincomycin for D. magna. The preliminary environmental risk assessment was conducted following the European Medicines Agency Guideline. Predicted no effect concentrations (PNECs) were derived from the acute and chronic toxicity data obtained from P. subcapitata in this study and from the literatures. Risk quotient for lincomycin was 1.82 calculated by EC50 of P. subcapitata and 1.102 for sulfamethoxazole based on the NOEC of S. leopolensi. The observed results suggest that, for lincomycin and sulfamethoxazole, potential risks still exist to the aquatic environment. The toxicity of binary mixtures was based on the effects on P. subcapitata. Simple addition effect was observed with the combination of lincomycin and sulfamethoxazole. On the other hand, the mixture effects of three antibiotics tested in the present study at the maximal MEC levels displayed no adverse effect or

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致謝

在兩年的碩士班生活中，除了學到新知識和實驗方法，也因為承擔許多事情，覺得 自己有些微成長。 首先，非常感謝我的指導教授–陳重元老師，引領我進入環境毒物學領域，並且給 予許多建議和啟發，使我能確立研究題目並將其順利完成。也感謝其他兩位口試委員– 張玉明老師和林志高老師，提供論文撰寫的指導及建議，讓我的論文能更完善、有條理。 如果沒有以前實驗室學長姐辛苦建立的研究基礎，我也無法順利進行實驗，特此感謝。 另外，非常感激孫鼎立先生不厭其煩地解決儀器問題，而且指導儀器的操作與保養。 感謝實驗室的詔棻學姊，總是熱心協助我處理實驗室的大小事情。感謝家祥學長， 自我進實驗室以來，總是樂意回答我眾多的疑問，甚至畢業後仍願意和我討論實驗，而 且無私地傳承經驗以及觀念，讓我從中獲得許多啟發，也順利解決不少困難。感謝萱芳 學姊和思宏學長改進培養條件，讓我有穩定的系統進行實驗。感謝我的同學姵如和宜君， 協助我解決課業問題和處理實驗室的事務。感謝學弟明彰、宗翰及昱辰，為實驗室帶來 熱鬧氣氛，也幫忙處理許多瑣事。感謝林老師實驗室的同學和學妹，願意借我實驗藥品 及儀器。另外，感謝清大的同學和朋友們，不論是一起打球、吃飯聊天、看電影或出遊， 都讓我的生活增添許多樂趣。 最後，非常感謝父母的支持和體諒。從上大學以來，我一直投入在追求自己的目標 而鮮少回家，然而父母卻不曾為此抱怨，總是支持我做的每個決定。非常謝謝你們!

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目錄

摘要 ... i Abstract ... ii 致謝 ... iii 圖目錄 ... vii 表目錄 ... ix 第一章 前言 ... 1 1.1 研究緣起 ... 1 1.2 研究內容 ... 3 1.3 研究目的 ... 3 第二章 文獻回顧 ... 4 2.1 抗生素介紹 ... 4 2.2 環境風險評估 ... 7 2.2.1 人用藥物之環境風險評估流程 ... 7 2.2.2 抗生素之環境風險評估 ... 11 2.3 月芽藻毒性試驗 ... 13 2.3.1 試驗物種介紹 ... 13 2.3.2 密閉式藻類毒性試驗 ... 13 2.3.3 藻類試驗終點 ... 14 2.3.4 藻類毒性試驗之影響因子 ... 15 2.4 水蚤急毒性試驗 ... 18 2.4.1 物種介紹 ... 18 2.4.2 水蚤急毒性試驗方法 ... 19 2.5 鯉魚急毒性試驗 ... 19

v 2.5.1 物種介紹 ... 19 2.5.2 鯉魚急毒性試驗方法 ... 20 2.6 混合毒性 ... 20 2.6.1 聯合效應 ... 20 2.6.2 混合毒性預測模式 ... 21 2.6.3 抗生素之混合毒性效應 ... 22 第三章 基本理論 ... 24 3.1 劑量反應模式 ... 24 3.2 混合毒性理論 ... 27 3.2.1 混毒效應判別方式 ... 27 3.2.2 非交互作用混合毒性模式 ... 29 3.2.3 混合毒性效應參數ρ 和 λ 值 ... 30 第四章 實驗材料與方法 ... 33 4.1 實驗藥品與儀器 ... 33 4.1.1 實驗藥品 ... 33 4.1.2 儀器 ... 34 4.2 藻類培養 ... 34 4.2.1 生長基質 ... 34 4.2.2 連續式藻類培養 ... 37 4.3 密閉式藻類毒性試驗 ... 37 4.4 水蚤急毒性試驗 ... 39 4.5 鯉魚急毒性試驗 ... 39 4.6 混合毒性試驗 ... 40 第五章 結果與討論 ... 41

vi 5.1 單一抗生素之毒性試驗 ... 41 5.1.1 月芽藻毒性試驗 ... 41 5.1.2 水蚤急毒性試驗 ... 43 5.1.3 月芽藻、水蚤和魚類敏感性之比較 ... 45 5.2 抗生素之環境風險評估 ... 45 5.3 抗生素之混合毒性 ... 53 5.3.1 抗生素兩兩混合 ... 53 5.3.2 三個抗生素混合 ... 57 第六章 結論與建議 ... 60 6.1 結論 ... 60 6.2 建議 ... 61 參考文獻 ... 62 附錄一 單一毒性數據 ... 67 附錄二 混合毒性數據 ... 71

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圖目錄

圖 1.1.1 抗生素進入水體環境的可能途徑(Kumar et al., 2005) ... 2 圖 2.1.1 抗生素作用位置(Neu, 1992) ... 4 圖 2.1.2 乙內醯胺的作用機制(Kohanski et al., 2010) ... 5 圖 2.1.3 胺基糖苷的作用機制(Kohanski et al., 2010) ... 6 圖 2.1.4 喹諾酮的作用機制(Kohanski et al., 2010) ... 6 圖 2.1.5 抑制葉酸代謝之作用機制 ... 7 圖 2.2.1 環境風險評估流程 ... 10 圖 2.3.1 光學顯微鏡下的月芽藻外觀 ... 13

圖 2.3.2 藻類培養之二氧化碳傳輸途徑(Nyholm and Källqvist, 1989) ... 15

圖 2.4.1 水蚤之雌性成蚤(環境檢驗所, 2011a) ... 18 圖 2.5.1 鯉魚幼魚(環境檢驗所, 2011b) ... 19 圖 3.1.1 劑量反應曲線 ... 24 圖 3.2.1 isobologram 示意圖 ... 29 圖 3.2.2 兩化學物毒性容忍度之相關係數之示意圖。 ... 30 圖 4.3.1 連續式藻類培養系統簡圖 ... 38

圖 5.1.1 lincomycin 之劑量反應曲線。(■) ΔDO，(●) yield，(▲) growth rate ... 42

圖 5.1.2 sulfamethoxazole 之劑量反應曲線。(■) ΔDO，(●) yield，(▲) growth rate ... 42

圖 5.1.3 flumequine 之劑量反應曲線。(■) ΔDO，(●) yield，(▲) growth rate ... 43

圖 5.1.4 sulfamethoxazole 對水蚤之劑量反應曲線 ... 44

圖 5.1.5 flumequine 對水蚤之劑量反應曲線 ... 44

圖 5.2.1 以本研究月芽藻計算三個抗生素之 RQ ... 48

圖 5.2.2 以最敏感物種數據計算三個抗生素之 RQ ... 49

viii

圖 5.3.2 lincomycin + sulfamethoxazole 之 isobologram（試驗終點 growth rate） ... 55

圖 5.3.3 flumequine + sulfamethoxazole 之 isobologram（試驗終點 growth rate） ... 56

圖 5.3.4 以月芽藻進行三個抗生素混毒試驗。(a) ∆DO，(b) yield，(c) growth rate ... 58

圖 5.3.5 以水蚤進行三個抗生素混毒試驗 ... 59

ix

表目錄

表 2.2.1 第二階段階層 A 中物化特性、宿命和毒性試驗的研究方法 ... 11 表 2.2.2 第二階段階層 B 中宿命和毒性試驗的研究方法 ... 11 表 2.6.1 四種聯合效應型式 ... 21 表 3.1.1 Probit、Logit 和 Weibull 模式轉換 ... 26 表 3.2.1 聯合效應指標(Altenburger et al., 2003) ... 28 表 3.2.2 四種混合毒性效應模式 ... 32 表 4.1.1 三種抗生素的物化性質、代謝率、半生期和河川檢測最高濃度 ... 34 表 4.2.1 月芽藻生長所需之微量營養鹽成份 ... 36 表 4.2.2 月芽藻生長所需之微量營養鹽成份 ... 36 表 5.1.1 月芽藻單一抗生素之毒性試驗結果（試驗終點為 ΔDO） ... 41 表 5.1.2 月芽藻單一抗生素之毒性試驗結果（試驗終點為 yield） ... 41 表 5.1.3 月芽藻單一抗生素之毒性試驗結果（試驗終點為 growth rate） ... 42 表 5.1.4 水蚤單一抗生素之急毒性試驗結果 ... 43 表 5.1.5 月芽藻、水蚤以及斑馬魚 EC50之比較 ... 45

表 5.2.1 計算水體 PNEC 之評估因子(European Chemicals Bureau, 2003)... 47

表 5.2.2 以本研究月芽藻數據計算三個抗生素之 RQ ... 48

表 5.2.3 以最敏感物種數據計算三個抗生素之 RQ ... 49

表 5.2.4 lincomycin、sulfamethoxazole 和 flumequine 的急毒性數據（EC50或 LC50） .. 50

表 5.2.5 lincomycin、sulfamethoxazole 和 flumequine 的慢毒性數據（NOEC） ... 52

表 5.3.1 抗生素以毒性單位 1:1 混合之毒性效應（試驗終點為 growth rate） ... 53

表 5.3.2 以生長率為試驗終點之混合毒性模式預測（毒性單位比 1：1） ... 54

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第一章

前言

1.1 研究緣起

新興污染物（Emerging contaminants）包括化學物質和微生物之代謝物，為新認定 或已存在於環境中、但近期才被發現的污染物，由於分析儀器的進步，能夠偵測到水中 微量的化學物質。大多數的新興污染物無法經由傳統生物處理程序完全去除，因此對生 態環境及人體健康的影響不容忽視。藥物和個人保健用品（pharmaceutical and personal care products, PPCPs）屬於新興污染物中的一大類化學物質，包含處方藥、診斷劑、動 物用藥、營養素、香水和防曬產品等等。這些化合物和其代謝產物持續排入水體環境中， 造成水中生物整個生命週期、多代的長時間暴露，產生潛在危害(Daughton and Ternes, 1999)。

抗生素廣泛用於人類和動物的醫療，也是畜牧和水產養殖常用的生長促進劑。圖 1.1.1 說明抗生素的來源和進入環境中的可能途徑。許多抗生素進入人體和動物後並無法 完全代謝，腸道吸收的效率極低，最後以原化合物（parent compounds）的形式經由尿 液和糞便排出體外(Hirsch et al., 1999; Chee-Sanford et al., 2001)，污染土壤或隨著地表逕 流至地表水或滲濾至地下水層。養殖漁業使用的抗生素直接投入水中或在飼料添加，殘 留在水體環境或底泥中。根據許多研究發現，在廢水處理廠的放流水和水體環境中測得 抗生素濃度介於 ng - μg/L 範圍(Kolpin et al., 2002; Calamari et al., 2003; Miao et al., 2004; Wiegel et al., 2004; Karthikeyan and Meyer, 2006; Watkinson et al., 2009)，雖然如此低的濃 度不至於威脅人類健康，但是對於水中的敏感生物，在長期暴露下，可能會產生毒性效 應，因此必須對這類藥物進行環境風險評估（environmental risk assessment, ERA）。另外， 在環境中通常含有多種抗生素，並非只有單一藥物存在，所以須要考慮混毒效應對水體 生物的影響。

水體生態食物鏈三種代表性生物為藻類、甲殼類（水蚤）和魚類，因此環境風險評 估須包含此三種生物之急慢毒性數據。其中，藻類為水體生態系的主要生產者，是食物

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鏈的基礎，在水體環境中物質的循環中扮演重要的角色。一些文獻的毒性數據顯示，藻 類對抗生素的敏感性高於甲殼類和魚類，例如 ofloxacin、sulfamethoxazole、triclosan 和 ciprofloxacin (Orvos et al., 2002; Ferrari et al., 2004; Isidori et al., 2005; Robinson et al., 2005; Martins et al., 2012)。由於在真實環境中，同時存在多種抗生素，因此不能忽略藥 物混合後產生的毒性變化，尤其是當協同作用發生時，會提高對水體生物的毒性。另外， 目前文獻甚少討論作用機制不同抗生素之混毒效應，所以在本篇研究中，選擇三種機制 不同而且在台灣河川檢測濃度較高(林郁真, 2010)的抗生素：lincomycin、sulfamethoxazole 和 flumequine，其濃度分別為 1640、650 和 198 ng/L，並且使用涵蓋三個營養階層的物 種：月芽藻、水蚤和鯉魚，測試抗生素的毒性、評估對台灣河川環境的風險性以及探討 混合毒性效應。 圖 1.1.1 抗生素進入水體環境的可能途徑(Kumar et al., 2005)

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1.2 研究內容

1. 以月芽藻、水蚤和鯉魚測試三種抗生素之生物毒性。月芽藻試驗是以溶氧變化量 （ΔDO）、生物質量產量（yield）和比生長率（specific growth rate）作為試驗終點 （endpoint）。水蚤急毒性試驗之終點為判斷水蚤是否具有游泳能力。鯉魚急毒性 試驗則是根據鯉魚死亡情形做為試驗終點。將得到的實驗數據用 Probit 模式計算 抗生素的 EC50。 2. 使用歐洲藥物管理局制定的環境風險評估流程，計算抗生素的風險商數（risk quotient, RQ），藉此判斷是否具有潛在風險。依據抗生素在台灣河川的檢測濃度以 及毒性資料計算風險商數。毒性數據是使用本研究之月芽藻和參考文獻中最敏感 物種的數據。 3. 抗生素兩兩混合毒性試驗使用月芽藻作為試驗生物。混合比例是依毒性單位 （toxicity unit, TU）計算，進行 1：1、1：3 和 3：1 三個混合比例的毒性試驗。用 總毒性單位（sum of toxic units）指標判斷抗生素 1：1 混合所產生的毒性效應。並 且將實驗結果和混毒預測模式 Multox 之預測值進行比較，藉此討論模式的預測能 力。另外，將 1：1、1：3 和 3：1 三個混合比例之毒性數據繪製成 isobologram， 探討不同比例所產生的混毒作用，並藉此判斷不符合模式預測的原因。 4. 將三種抗生素依其在台灣河川測得的最高濃度混合，以月芽藻、水蚤和鯉魚進行 毒性試驗，評估在最壞情況下是否會對三個階層的水中生物產生危害。

1.3 研究目的

1. 了解 lincomycin、sulfamethoxazole 和 flumequine 對月芽藻、水蚤和鯉魚，三個階層 的水體生物之毒性。 2. 以風險商數判斷三個抗生素對台灣河川是否具有潛在風險性。 3. 了解抗生素兩兩混合後是否會對月芽藻產生更高的毒性以及探討混合毒性作用。 4. 了解三個抗生素以最高濃度混合下，是否會對三個階層的物種產生急毒性的危害。

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第二章

文獻回顧

2.1 抗生素介紹

抗生素（antibiotics）是由細菌、真菌和放射菌產生的代謝產物，能殺死或抑制微生 物生長。目前臨床上用的抗生素來自微生物培養液提取或化學合成。抗生素依作用機制 可分五大類：抑制細胞壁合成、破壞細胞膜或抑制其合成、抑制蛋白質合成、抑制核酸 合成和抑制葉酸代謝，如圖 2.3.1 所示。 圖 2.1.1 抗生素作用位置(Neu, 1992) 1. 抑制細胞壁合成 細菌的細胞壁成分為肽聚醣，它是由多醣類骨架彼此經由短的多肽類交聯形成的網 狀結構。盤尼西林（penicillin）會和許多參與細胞壁合成的酵素鍵結，這些酵素通稱為 盤尼西林結合蛋白（penicillin-binding proteins, PBP）。其中，轉肽酶（transpeptidase）的 作用是讓多醣類產生交聯（cross-linking），使細胞壁穩固，因此為最重要的酵素。乙內 醯胺（β-lactam）類藥物會和轉肽酶結合，抑制其作用，進而活化細菌的自溶解酵素

5 （autolysin），使細菌死亡(Tuomanen, 1986)。另一種抑制肽聚醣合成的抗生素為萬古黴 素（vancomycin），其作用機制是透過和肽聚醣末端結合，阻止轉肽酶繼續延長網狀結 構，影響細胞壁的合成。 圖 2.1.2 乙內醯胺的作用機制(Kohanski et al., 2010) 2. 破壞細胞膜 多黏菌素（Polymyxin）為多肽類抗生素，包含五種化合物，其中用於臨床的只有 Polymyxin B 和 Polymyxin E，因為此兩個藥物對腎臟的毒性較低。多黏菌素和細胞膜的 脂多醣（lipopolysaccharide）鍵結，改變細胞膜通透性，使胞內物質流出，造成細菌死 亡(Newton, 1956)。

3. 抑制蛋白質合成

細菌的核醣體（ribosome）包含 30 S 和 50 S 兩個次單元（subunit）。30 S 讀取 mRNA 的密碼子，攜帶胺基酸的 tRNA 附著至核醣體，將胺基酸連結形成多肽鏈。有些抗生素 即是干擾上述轉譯過程來抑制細菌蛋白質合成。例如胺基糖苷（aminoglycosides）類藥 物和 30 S 次單元結合，使其誤讀（misreading）密碼子，讓錯誤的胺基酸接上多肽鏈(Davies et al., 1965)。另外，也會抑制核醣體轉位（translocation），終止多肽鏈的形成。四環素 （tetracycline）、巨內脂環（macrolide）和林可黴素（lincosamide）這三類的抗生素則是 和核醣體 50 S 結合，干擾胺基酸的鍵結。

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圖 2.1.3 胺基糖苷的作用機制(Kohanski et al., 2010)

4. 抑制核酸合成

細菌的 DNA 旋轉酶（gyrase）能引入負超螺旋至 DNA，減少 DNA 複製和轉錄時 產生的張力。喹諾酮（quinolone）類抗生素能和 DNA 旋轉酶結合，干擾 DNA 複製(Drlica and Zhao, 1997)。立汎黴素（rifampin）抑制 DNA-依賴性 RNA 聚合酶（DNA-dependent RNA polymerase），導致細菌無法進行轉錄，影響 RNA 合成。

圖 2.1.4 喹諾酮的作用機制(Kohanski et al., 2010)

5. 抑制葉酸代謝

細菌的葉酸代謝受到抑制會影響去氧核苷酸的製造，使得 DNA 合成受阻。對胺基 安息香酸（para - aminobenzoic acid, PABA）是合成葉酸的重要受質，而磺胺類

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（sulfonamide）類藥物的結構和 PABA 相似，因此會和 PABA 競爭 Dihydropteroate synthase 的結合位置，抑制二氫葉酸合成。另一種磺胺類抗生素 Trimethoprim ，與 dihydrofolate reductase 的親和力極強，因此抑制四氫葉酸合成。 圖 2.1.5 抑制葉酸代謝之作用機制

2.2 環境風險評估

2.2.1 人用藥物之環境風險評估流程

過去二十年間，許多國家的水體環境中都檢測出多種的藥物，而且由於大量地使用， 不斷排放到環境中，持續對水體生物產生危害，因此已經是受到矚目的環境議題。歐洲 藥物管理局（European Medicines Agency, EMEA）針對人用的藥物訂定環境風險評估的 準則(EMEA, 2006)，藉此管制對生態環境有危害的藥物。評估方式採取逐步階層的流程， 分為兩個階段（Phase I 和 Phase II），第二階段又再分成兩個階層（Tier A 和 Tier B），如 圖 2.2.1 所示。

在第一階段，目的是預測藥物在環境中的濃度。若藥物的辛醇-水分配係數（logarithm of the octanol-water partitioning coefficient, logKow)大於 4.5，不適用此流程，而是採用持

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久性累積毒性物質（persistence, bioaccumulation and toxicity, PBT) 的風險評估(European

Chemicals Bureau, 2003)。藥物在表體水中的預測環境濃度（predicted environmental

concentration, PEC）是依下列公式計算： dilution WasteW F Dose PEC inhab pen ai SW _   PECSW：預測在表體水中的濃度 Doseai：每人每天消耗最大劑量 Fpen：市場滲透比例 WasteWinhab：每人每天排放的廢水體積 dilution：污水處理廠的出流水排放至承受水體之稀釋因子 若 PECSW小於 0.01 μg/L，表示不會對環境造成影響；PECSW等於或大於 0.01 μg/L， 則須進行第二階段。

在第二階段階層 A，也稱為初步風險評估（initial risk assessment），進行藥物的物化 性質和環境宿命的測試，以及水體生物（藻類、水蚤和魚類）的毒性試驗（表 2.2.1）。 將實驗得到的無效應濃度（no observed effect concentration, NOEC），並參考技術指導文 件（technical guidance document, TGD）提供的評估因子（assessment factor, AF），可計 算出預估無效應濃度（predicted no effect concentration, PNEC），公式如下：

AF NOEC

PNEC

最後，計算 PECSW和 PNEC 的比值，藉此判斷藥物是否對水體生態具有風險性。 許多文獻將 PECSW / PNEC 稱作風險商數（risk quotient, RQ）。當 RQ 大於 1，意即預測 藥物在表體水中的濃度高於預測無效應濃度，表示具有潛在風險性，此時須進行階層 B 的評估。

在初步的風險評估時，由於 EMEA 準則中 PEC 的計算比較保守且考慮的是最壞情 況，所以通常和實際檢測的環境濃度（measured environmental concentration, MEC）產生 落差，而且若缺少可靠的數據會不利於 PEC 的計算。因此有些研究是以 MEC 取代 PEC ，認為 MEC 能反映藥物實際在水體的濃度(Grung et al., 2008)。

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第二階段階層 B 為精確風險評估（refined risk assessment）。首先計算精確 PEC （refined PEC），公式如下： dilution Factor Capacity WasteW f Elocal PEC stp inhab water stp water SW      Elocalwater：每天當地的藥物排放量 Fstp water：處理場出流水直接排放至表體水的比例 WasteWinhab：每人每天排放的廢水體積 Capacitystp：污水處理廠之容量，單位為居民人數 Factor：污泥之吸附性 dilution：污水處理廠的出流水排放至承受水體之稀釋因子 另外，在此階層，進行藥物在土壤中的宿命研究，並且將毒性試驗的物種延伸至底 泥生物、土壤中的微生物和陸地的動植物，如表 2.2.2 所示，並計算其 PNEC。若 refined PEC 和 PNEC 比值仍高於 1，表示須要管制藥物的使用量。

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表 2.2.1 第二階段階層 A 中物化特性、宿命和毒性試驗的研究方法 Study Type

Adsorption – Desorption Using a Batch Equilibrium Method Ready Biodegradability Test

Aerobic and Anaerobic Transformation in Aquatic Sediment Systems Algae, Growth Inhibition Test

Daphnia sp. Reproduction Test

Fish, Early Life Stage Toxicity Test Activated Sludge, Respiration Inhibition Test

表 2.2.2 第二階段階層 B 中宿命和毒性試驗的研究方法 Study Type

Aerobic and anaerobic transformation in soil Soil Microorganisms: Nitrogen Transformation Test

Terrestrial Plants, Growth Test Earthworm, Acute Toxicity Test

Collembola, Reproduction Test

2.2.2 抗生素之環境風險評估

Halling-Sørensen et al. (2000)對 mecillinam、trimethoprim 和 ciprofloxacin 三種廣泛用 於治療尿道感染的抗生素，進行初步風險計算。假設污水處理廠的移除率為零，也就是 計算最壞情況下的 PEC。以最敏感物種（藍綠藻）的 NOEC 計算 PNEC。ciprofloxacin 的 PEC/PNEC 為 12.7，其餘兩個抗生素不具風險性。Isidori et al. (2005)計算 erythromycin、 oxytetracyclin、sulfamethoxazole、ofloxacin、lincomycin 和 clarithromycin 六種抗生素之 風險商數。將 MEC 除以月芽藻的 PNEC，發現 erythromycin、lincomycin 和

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clarithromycin 的 RQ 高於 1。Hernando et al. (2006)評估多種藥物在污水處理廠放流水、 表體水和底泥的風險性。其中，erythromycin 在放流水中的濃度相當高，因此 RQ 大於 1， 其餘抗生素皆無風險性。Kim et al. (2007)使用海洋螢光菌（V. fischeri）、水蚤（D. magna） 和青鱂魚（O. latipes）對六種磺胺類藥物進行毒性試驗，並且參考文獻數據，選出最敏 感物種的 EC50計算風險商數。結果發現 sulfamethoxazole 的 RQ 為 6.3，有很高的潛在 風險。Park et al. (2008)挑選 11 種抗生素，以 V. fischeri、兩種水蚤（D. magna 和

M. macrocopa）和 O. latipes 作為試驗生物。將實驗數據和文獻比較後選出最低的 EC50 和 NOEC，並且用 MEC 取代 PEC 來計算 RQ。其中有五個抗生素具有風險性。作者認 為根據慢毒性計算得到的 RQ 比較有意義，而且能觀察到生物受到抗生素影響所產生的 慢毒性效應。Martins et al. (2012)針對 ciprofloxacin 進行廣泛探討。使用六種試驗生物： 海洋螢光菌、月芽藻、浮萍、水蚤和食蚊魚（G. holbrooki）。計算醫院放流水、污水處 理廠放流水和河川表體水的 PEC，並分別用急毒性和慢毒性數據的 PNEC，計算 RQ。 結果顯示，以慢毒性評估皆無風險性。然而，以急毒性數據計算三種水體的 RQ 極大， 尤其是醫院放流水（RQ 為 2192.6），因此作者仍認為有必要進行精確風險評估。

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2.3 月芽藻毒性試驗

2.3.1 試驗物種介紹

本實驗中所使用的月芽藻 （Pseudokirchneriella subcapitata，舊名 Selenastrum

capricornutum），外型呈半月型，為成群體但不糾結、不能移動之淡水綠藻（Chlorophceae）。 其優點為：取得容易、培養簡單、容易觀察、生長期短、可以大量生長、具有本土代表 性而且比大部分生物試驗來的敏感(Rojíčková-Padrtová et al., 1998)。當培養過程中缺少 營養鹽或溫度、光照、pH、有毒物質侵害或細菌滋生等環境條件不佳時，月芽藻會逐漸 呈現明顯的黃綠色，故從外觀可以容易地去判斷生長情形。另外也可透過顆粒計數器觀 察其粒徑的分佈，若發現顆粒數變少、聚集成團的藻類數量變多時，表示藻的生長狀況 不佳。 圖 2.3.1 光學顯微鏡下的月芽藻外觀

2.3.2 密閉式藻類毒性試驗

月芽藻毒性試驗的標準方法有很多種，例如：U.S. EPA (1996)、OECD (2006) 、ISO (2012b)、APHA (1995)和 ASTM (2012b)，都是使用錐形瓶作為試驗容器進行實驗，為開 放式系統。其優點在於實驗期間能和外界空氣接觸，提供生長基質二氧化碳，給予藻類 生長所需的碳源，而且能維持生長基質的 pH 值。但是，若試驗毒物具有揮發性，則會 因為毒物散失，影響實驗結果。因此，使用密閉式試驗方法可解決此問題，然而，在實

14 驗初期需要提高生長基質中的碳源，避免影響藻類生長。本研究使用 Lin et al. (2005)建 立的的密閉式藻類毒性試驗，以 BOD 瓶做為實驗容器，在試驗前用含 0.5 %二氧化碳之 氮氣對生長基質曝氣，提供溶解性二氧化碳。

2.3.3 藻類試驗終點

目前藻類毒性試驗的標準方法皆是以藻類的生物質量（biomass），評估毒物抑制藻 類生長現象。量測生物質量最直接的方法是秤乾重，但是需要花費較久的時間，所以用 電子顆粒計數器、UV/Vis 光譜儀和螢光光譜儀等間接測量方法取代之，由於這些方法 操作簡單、快速、只需少量藻液而且與乾重有良好的相關性。 在本研究中，藻類的試驗終點（endpoint）有三種：溶氧變化量（ΔDO）、產量（yield） 和比生長率（specific growth rate）。抑制率的計算公式如下：

（1）以溶氧變化量計算抑制率： 100% ΔDO ΔDO -ΔDO rate Inhibition C T C   ΔDOC和ΔDOT分別為控制組和實驗組的產氧量之平均值。 （2）產量的計算為生物質量在暴露時間內的改變量，其抑制率算法如下： 100% Y Y -Y rate Inhibition C T C   YC和 YT分別為控制組和實驗組的產量之平均值。 （3）平均比生長率的計算公式如下： ln ln (day1) i j i j -t t X -X μ μ 為第 i 天到第 j 天的平均比生長率。_i-j X 和_i Xj分別為第 i 天和第 j 天的生物質量。 以平均比生長率計算抑制率： Inhibitionrate - 100% C T C      _C和



_T分別為控制組和實驗組的平均比生長率。

15

2.3.4 藻類毒性試驗之影響因子

1. pH 和碳源

根據 U.S. EPA 標準方法製備的培養基 pH 值為 7.5±0.1，而 OECD 和 ISO 方法使用 的培養基 pH 值約為 8.1。另外，OECD 和 ISO 規定試驗期間 pH 的變化不可超過 1.5。 圖 2.3.2 為氣相中二氧化碳傳輸至藻類細胞的示意圖。藻類的生長主要利用水中溶 解的二氧化碳，其次是碳酸氫根離子。當藻類消耗二氧化碳的速率高於二氧化碳從氣相 傳輸至液相的速率時，則開始利用培養基（medium）中的碳酸氫根離子，使得氫氧根 離子濃度增加，導致 pH 上升。其反應式及 pH 計算公式如下： 2 3 OH CO HCO   ] [CO ] [HCO log pK pH 2 3 a    為了實驗的再現性，必須控制試驗期間培養基的 pH 值。尤其當試驗毒物為重金屬或是 弱有機酸、弱有機鹼時，容易因為 pH 改變而影響毒性強弱。可以透過減少初始的生物 質量、縮短試驗時間(Arensberg et al., 1995)或連續震盪試驗容器提高二氧化碳質傳效率 等方法來減少 pH 的增加。

圖 2.3.2 藻類培養之二氧化碳傳輸途徑(Nyholm and Källqvist, 1989)

若毒物具有揮發性，會採用密閉式的試驗方法，避免毒物濃度改變而影響實驗結果。 許多文獻的密閉式系統都是將開放式的錐形瓶密封，然後在實驗初期透過不同的方式給 予足夠的二氧化碳。Kühn and Pattard (1990)用蓋子塞住錐形瓶口，並且將 72 小時試驗

16

時間縮短為 48 小時，pH 約上升 1.5。Galassi and Vighi (1981)使用 2 L 錐形瓶，僅裝入 100 mL 培養基，來增加液面上密閉空間（headspace）的體積，避免二氧化碳缺乏。但 是此方法仍會讓部分有機物揮發至氣相，所以必須用亨利常數計算或用分析儀器定量液 相中的剩餘有機物濃度。Hermann et al. (1990)額外加入 0.4 % (w/v)的 NaHCO3至培養基 中，作為碳源，並且將初始 pH 調至中性。但是作者並沒有量測實驗結束的 pH 值，因 此無從得知 pH 的改變為何。Brack and Rottler (1994)認為提高培養基質中 NaHCO3濃度 雖然可以增加碳源，但是離子強度上升反而會抑制藻類生長，因此設計出一種特殊試驗 容器：下方錐形瓶裝 CO32-/HCO3-緩衝溶液，可提供氣相 1.14 %二氧化碳；上方容器含 有 30 mL 培養基。兩者以 headspace 連接，液相並無接觸，如此可防止離子強度增加。 pH 介於 6.5 和 7.5 之間。Hailing-Sørensen et al. (1996)加入 0.19 mmol NaHCO3至培養基， 並且將 headspace 充滿 1 %的二氧化碳，試驗時間改成 48 小時，pH 僅略微增加，從 7 上升至 7.3。Mayer et al. (2000)研究結果指出保留 headspace 仍會使大量的有機物揮發至 氣相，因此將容器裝滿培養基，使其完全密閉。將 NaHCO3濃度提高為 300 mg/L，並將 pH 調至 7，兩天試驗時間後 pH 變動小於 0.5。Lin et al. (2005)用 BOD 瓶進行實驗，同 樣採用完全密閉不保留 headspace，試驗前用含 0.5 %二氧化碳之氮氣對培養基進行曝氣， 增加碳源。48 小時後 pH 約增加 1.5。

2. 光照強度

光照強度會影響藻類行光合作用的速率，而且生長速率沿著光飽和曲線（light saturation curve）增加，因此培養時必需有足夠的攪拌，生物質量不可過高、培養體積 不可太大，以免透光不足影響藻類細胞的生長(Nyholm and Källqvist, 1989)。目前沒有文 獻指出光照強度是否會影響藻類對毒物的敏感性。U.S. EPA 和 OECD 規定光照強度為 4300 lux，ISO 則是 8000 lux。大部分的研究使用連續照光，其優點為穩定控制藻類的生 長，若用光暗交替的照光方式容易讓生物質量產生很大的變異。

3. 溫度

因為溫度的變化會影響藻類的代謝作用，所以也可能會影響毒物的抑制效應。U.S. EPA 規定 24℃。OECD 是 21 至 24℃， ISO 則是 23℃，溫度變動必須小於 2。

17 4. 藻液初始密度和試驗時間 在批次式實驗中，若藻液初始密度過低，些微細胞數量變動會大幅影響生長率，因 此數據的 EC50變異性太高，再現性很差。反之若初始密度過高，會由於藻類細胞大量 增加造成代謝物累積及碳源耗盡，而影響毒性試驗結果。 試驗時間會影響物種對毒物的敏感性。時間太長，營養不足會影響藻類生長；時間 太短，毒物和藻類的接觸時間不足，無法反映出實際的抑制情形。

U.S. EPA 規定月芽藻初始細胞密度為1104cells/mL，試驗時間 96 小時。OECD 則

是5103104 cells/mL，試驗時間 72 小時。

5. 生長基質

培養基的成份會影響藻類生長，其中氮、磷和螯合劑（chelator）最為重要。氮和磷 為藻類生長的限制性因子（limiting factor）。在水中只有 PO43--P 形態能夠直接被藻類吸 收，所以標準方法皆是用正磷酸鹽，如 ISO 和 OECD 是用 KH2PO4，U.S. EPA 是 K2HPO4。 氮源可用 NO3

--N 或 NH 4

+

-N，ISO 和 OECD 使用 NH4Cl，U.S. EPA 則是 NaNO3。為了 使讓藻類有效利用微量元素，會在培養基中加入螯合劑。螯合劑扮演緩衝微量元素濃度 的角色，除了維持離子濃度的恆定，也能避免鐵元素沉澱和減低重金屬的毒性。

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2.4 水蚤急毒性試驗

2.4.1 物種介紹

本研究使用的水蚤（Daphnia magna），屬於甲殼綱（crustacea）之淡水浮游動物， 廣泛分布於北半球。水蚤族群是由雌蚤組成，並且進行孤雌生殖，產生的子代皆為雌性。 當水溫較低、族群密度高、代謝廢物累積過多和食物不足時，雌蚤會產生受精卵，也稱 為卵鞍（ephippium），會在脫殼的時候排出，並且產生雄性子代。數量會增加。雄蚤相 對於雌蚤，其體型較小、觸角大而且前腳彎曲成魚鉤狀。水蚤生命週期包含四個階段： 卵（egg）、幼年期（juvenile）、青年期（adolescence）和成年期（adult）。通常水蚤約兩 天脫一次殼，意即齡期（instar）為兩天。幼年期約 3 至 5 個齡期。青年期非常短，只有 1 個齡期，期間第一代的卵在育兒室發育成熟，並在齡期結束前產生第一子代的小蚤。 成蚤則有 6 至 22 個齡期。齡期通常隨著水蚤年紀增加，但是也會受到環境情況影響。 在 25℃時，平均壽命為 40 天。每一代約有 6 至 10 個卵進到育兒室（food chamber），最 多 30 個左右，當小蚤在育兒室孵化並排出後，成蚤會脫殼並同時將新的卵移至育兒室。 水蚤對環境變化以及化學物的敏感性高，所以常用來檢測放流水的毒性。 圖 2.4.1 水蚤之雌性成蚤(環境檢驗所, 2011a)

19

2.4.2 水蚤急毒性試驗方法

水蚤急毒性試驗的標準方法都是靜水式（static test），例如 U.S. EPA (2002)、OECD (2004)、ISO (2012a)和 ASTM (2012a)，試驗期間不換水也不餵食。使用時零 24 小時的 水蚤進行實驗，暴露時間皆為 48 小時，試驗終點是 immobilization，觀察水蚤是否具有 游泳的能力。其作法是輕輕晃動燒杯後，觀察水蚤於 15 秒內是否由游動情形。另外， 有些文獻開發新的試驗終點，依據水蚤的生理功能變化，例如趨光游泳行為或進食效率 (Barata et al., 2008)，而且比標準方法更具敏感性。

2.5 鯉魚急毒性試驗

2.5.1 物種介紹

鯉魚學名為 Cyprinus carpio，俗稱 Common carp.，為淡水食用魚類，分布於台灣河 川中下游及池塘。魚體側扁略呈紡錘型，具鬚 2 對，魚背部黃綠色，腹部淡黃色，體長可

達 120 公分，有集體群游習性，為雜食性魚類，以小型無脊椎動物與底棲動物為主。雌

魚兩年達性成熟，在 3 到 8 月可開始產卵， 受精卵 3 至 5 天即可孵化。

20

2.5.2 鯉魚急毒性試驗方法

本研究使用環境檢驗所制定的鯉魚急毒性試驗方法，為靜水式試驗。使用體長 2 至 3 公分的鯉魚進行實驗，暴露時間 96 小時，試驗終點為鯉魚死亡情形發生。試驗期間須 將死亡移除，避免影響結果。由於死亡率終點敏感性低，所以有學者以魚類的游泳能力 作為試驗終點(Beggel et al., 2010)，得到較敏感的數據。

2.6 混合毒性

2.6.1 聯合效應

混合毒性理論的發展已有數十年的時間，研究者致力於開發預測化學物混毒效應的 方法。最早在 1939 年，Bliss 以 Probit 模式畫出毒物的劑量反應曲線（dose-response curve）， 並且依兩毒物之曲線平行與否，首先提出混合毒性作用所產生的兩種基本聯合效應 （joint effect）：相似作用（simple similar action）和獨立作用（independent joint action） 。兩個化學物混合若為相似作用，表示兩者有相同作用機制，不會影響彼此的毒性；若 是獨立作用，意即兩者有不同的作用機制，但是並不會干擾彼此在生物反應位置（reaction site）的作用。

在 1952 年，Plackett and Hewltt (1952)擴展 Bliss 的理論，根據混合毒性作用的相似 性和獨立性與化學物之間交互作用的關係，提出四種聯合效應的型式（表 2.6.1）。以兩 化學物影響相同生理系統與否分為相似（similar）和不相似（dissimilar）。若兩化學物為 相似作用，混合後的效應來自兩者貢獻的毒性相加（additive）。以一化學物會改變另一 個在其生化反應位置的作用與否，分為交互作用（interactive）和非交互作用 （non-interactive）。若兩化學物有交互作用，使得混合效應大於毒性相加，則稱為協同 作用（synergism），反之，則稱為拮抗作用（antagonism）。

之後於 1985 年，Christensen and Chen (1985)延伸 Plackett 和 Hewltt 的理論，使其可 應用於探討多種化學物的非交互作用混合效應，並可使用 Probit、Logit 和 Weibull 三種 劑量反應模式。

21

表 2.6.1 四種聯合效應型式

Similar Dissimilar Non-interactive Simple similar Independent

Interactive Complex similar Dependent

2.6.2 混合毒性預測模式

預測非交互作用混合物毒性的兩個常用參考模式（reference model）為 Loewe 和 Muischnek 提出的濃度相加（concentration addition, CA）模式以及 Bliss 提出的獨立作用 （independent action, IA）模式。CA 表示毒物機制相同，有相同的作用位置，可用數學 式表示： 1 1 



 n i i i ECx c 其中，n 為混合物中化學物的數量，ECxi表示第 i 個成分單獨存在能產生 x %效應的濃 度，ci是混合物中第 i 個化學物的濃度。IA 則是作用機制不同且毒性物質在生物體上之 作用位置不同，以數學式表示：







    n i i mix E c c E 1 ) ( 1 1 ) (

其中，cmix是混合物總濃度，E(cmix)表示預測混合後產生的效應，E(ci)為第 i 個成分以此 濃度單獨存在時產生的效應。

許多研究者認為 CA 具有較好的預測能力，比 IA 更適合當作參考模式(Greco et al., 1995)。Broderius (2005)以鰷魚（fathead minnow）作為有機物混合毒性試驗物種，比較 CA 與 IA 的預測能力。結果顯示相同機制的毒性物質混合時，CA 有很好的預測效果， 而不同作用機制相混時，雖然不完全符合 CA，但仍優於 IA 的預測。Backhaus (2004) 用綠藻（Scenedesmus vacuolatus）進行作用機制相同的除草劑之混合毒性試驗，發現 CA 及 IA 都有很好的預測效果。然而，Olmstead andLeBlanc (2005)用水蚤（Daphnia magna） 對機制相同的多環芳香烴的混合毒性試驗，卻發現 CA 高估混合毒性效應，反而 IA 預

22 測效果較佳。因此大部分的研究都會同時使用 CA 和 IA 兩個模式，來預測化學物的混 合毒性效應並比較兩模式的預測能力。Cedergreen et al. (2006)選四種試驗生物評估抗真 菌劑和八種殺蟲劑的混合毒性效應，並且比較 CA 及 IA 模式的預測能力。結果發現， 當毒物的的劑量反應曲線的斜率為 1.25 時，CA 與 IA 模式的預測能力幾乎相同；若斜 率小於 1.25，IA 預測力較佳；反之，CA 則為較適當的預測模式。

Chen and Chiou (1995)以 Microtox 對非反應性及反應性有機物進行混合毒性試驗。 結果發現，當兩非反應性有機物的斜率相近，意即兩劑量反應曲線平行，則混合後大多 數產生相加作用。若劑量反應曲線非平行，則會產生 complex joint action 現象，也就是 斜率大的毒物會大幅減弱另一個斜率較小的毒物之毒性。當混合物含有反應性有機物時， 混合毒性效應多為拮抗作用，而且由於作用機制不同，導致預測效果不佳。Chen and Yeh (1996)用 Microtox 研究反應性有機物的混合毒性，並且根據作用機制將有機物分為四類： 親電型毒性、前親電型毒性、具氰基型毒性和多機制型毒性。結果顯示，機制相同的有 機物混合時，產生相加作用或拮抗。不同機制且兩種有機物的劑量反應曲線斜率甚小時， 發生協同的機率很高。若兩種有機物斜率為一高一低時（斜率比大於 1.5），明顯產生拮 抗效應。

2.6.3 抗生素之混合毒性效應

近年來，水體環境中殘留的抗生素對生態造成的影響已受到重視，許多文獻研究這 類藥物對水體生物的急慢毒性。然而，環境中同時存在多種抗生素，混合後可能產生更 強的毒性效應，因此評估風險時不可忽視混合毒性。 目前探討抗生素混合對水體生物影響之研究極少，而且大部分是以作用機制相同的 藥物相混。Backhaus et al. (2000)將十種喹諾酮（quinolone）類藥物混合，對海洋螢光菌 （V. fischeri）進行 24 小時試驗，結果顯示符合 CA 模式預測。另外，作者也發現以 NOEC 濃度混合下仍會嚴重抑制螢光菌生長。Zou et al. (2012)使用另一種海洋螢光菌（P.

23

混合，發現急毒試驗結果都是拮抗作用，而慢毒試驗卻產生協同作用。作者利用定量活 性關係（QSAR）和分子對接（molecule docking）方法證明這是由於磺胺類抗生素在急 毒和慢毒混合時，和不同的受體蛋白質（receptor protein）結合所致，因為暴露時間長 短的作用機制不同，所以產生不同混毒效應。De Liguoro et al. (2009; 2010) 用水蚤（D.

magna）探討磺胺類抗生素兩兩混合之毒性效應，透過 isobologram 可發現皆為拮抗作用。 Christensen et al. (2006)研究養殖漁業使用的五種抗生素之混合毒性，其中三種藥物的機 制為抑制蛋白質合成，其餘兩種為抑制 DNA 複製，並且以月芽藻和活性污泥微生物進 行試驗。從 isobologram 可知大多數不符合 CA 或 IA 模式的預測，而且月芽藻的混毒能 產生協同、相加和拮抗三種不同的作用，無法歸納出機制和混毒效應的相關性，因此認 為生物利用度（bioavailability）可能是影響的因素。另外，活性污泥微生物的混毒則皆 是協同作用。Hagenbuch et al. (2012)選擇三種廣泛使用的抗生素，對兩種海洋矽藻 C.

closteriumc 和 N. ramosissima 進行混毒試驗。結果發現對 C. closteriumc 皆為協同，而對 N. ramosissima 則是相加作用，但是並沒有探討作用機制的影響。Yang et al. (2008)選十

二種抗生素，試驗物種為月芽藻。抗生素依照同類別、不同類別和常用的藥物分成三組， 將同組的藥物兩兩混合，並使用總毒性單位判斷混毒效應。同類別和常用抗生素的混合 毒性幾乎都是協同作用，只有磺胺類相混產生相加作用，而不同類別混合，多數為相加， 拮抗和協同則占少部分。若以作用機制相同與否分類，相同機制抗生素大部分產生協同， 僅兩組為相加作用。不同機制混合，則是出現三種效應，其中大部分為相加作用。另外， 十二種抗生素以同濃度混合，其毒性單位接近 20，為強烈拮抗作用。

24

第三章

基本理論

3.1 劑量反應模式

當毒性物質和生物發生作用時，產生的毒性效應和化學物的濃度會呈現 S 型曲線， 稱之為劑量反應曲線（dose-response curve）。在毒性試驗中，使 50 %的生物產生抑制情 況的毒物濃度，稱為半數效應濃度 EC50（median effect concentration）；若抑制現象為死 亡，則稱為半數致死濃度 LC50（median lethal concentration）。由於直接從原始數據求得 EC50非常困難，因此必須藉由劑量反應模式，將曲線轉換成線性。Probit、Logit 和 Weibull 是三種常見的模式。 圖 3.1.1 劑量反應曲線 1. Probit 模式： 由 Gaddum(1933)和 Bliss(1934a, b)建立。假設生物的死亡率和毒性物質的濃度為對 數常 態分布。轉換方式為先將抑制率轉變為常態對等離差（normal equivalent deviation, NED），NED 加上 5 為 Probit 單位，再由 Probit 和取 log 的濃度形成之線 性關係，可算出半致死濃度。轉換公式如下：                2 5 Y erf 1 5 . 0 P

 

z log b a Y  1 10 100 1000 0 50 100 In hib iti on rat e (%) Concentration (mg/L)

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P 代表抑制率，erf 為 error function，Y 是 Probit 單位，z 是化學物的濃度。 2. Logit 模式： 最早用於描述人口的成長曲線，也用來計算自催化的反應速率。之後，Berkson (1944) 認為羅吉斯函數（logisitc function）計算簡單而且有理論基礎，因此提出將此函數 應用在劑量反應曲線的轉換上。 3. Weibull 模式： 在生物醫學上，此模式用來預測動物體內的腫瘤發生時間。Christensen (1984)使用 Weibull、Probit 和 Logit 三種模式分析藻類毒性試驗數據，發現 Weibull 模式同樣能 符合劑量反應曲線，然而計算出的 EC10和 EC90通常偏低。

26

表 3.1.1 Probit、Logit 和 Weibull 模式轉換

*

z 為毒物濃度。α、β、θ、φ、k 和 η 是常數。

Type Probit Logit Weibull

Transformation* Yαβ log z( ) lθ ln z( ) uln(k)η ln(z) Probability density ) 2 exp( 2 1 t2   ₎ 2 ( cosh 4 1 2 t ) exp(tet Probability of response P



  _   _  ₂ ) 5 ( erf 1 2 1 d ) 2 exp( 2 1 5 -Y -2 Y t t  t e z e  1  1 -1 1   1exp(-kz)1exp(eu) Transformation vs P Y5 2erf1(2P1) ) 1 ln( P P l   uln(ln(1P))

27

3.2 混合毒性理論

3.2.1 混毒效應判別方式

常用於分析和闡述混毒效應的方法分為兩類：指標（index）和圖解法（graphical method）。 1. 指標

(1) 毒性單位（toxic unit, TU）(J. B. Sprague, 1965)

M 代表毒性單位總和，zi是毒性物質的濃度。當 M < 1 為協同作用，M > 1 為 拮抗作用，M = 1 為相加作用。

(2) 相加指標（additive index, AI）

Marking (1977)為了將參考點定為零，並且使指標和混毒效應呈線性關係，將毒性 單位修正：當 M≦1，則 AI = 1/M-1；當 M > 1，則 AI = 1 – M。若 AI > 0，為協 同作用，AI < 0，為拮抗作用，AI = 0，為相加作用。

(3) 混合毒性指標（mixture toxicity index, MTI）

K onemann(1981)認為不論混合物中的化合物數量或是混合比例，濃度相加 （concentration addition）和沒有相加（no addition）這兩個參考點必須為定值。而 且，因為半致死濃度是由對數常態分佈轉換而求得，所以毒性單位要以對數形式 表示。故定義： 0 0 M log M log M log M TI  其中， ) max(TU M M₀ i  。max(TU_i)為混合物中最大的毒性單位。當 MTI < 1，為 協同作用，MTI > 0，為拮抗作用，MTI = 1，為相加作用。     



50,2 2 50,1 1 EC z EC z TU M _i

28

表 3.2.1 聯合效應指標(Altenburger et al., 2003) Type of index and type of

interaction

Joint effect index

Toxic unit (TU) Additive index (AI) Mixture toxicity index (MTI)

Mathematical definition



    i i i i i i i i z z TU M component of EC50 EC50 , component of ion concentrat where EC50 TU M -1 = AI then 1, M if 1; -M 1 = AI then 1, M If   ) max(TU M M where M log M log M log M TI 0 0 0 i    Additive M = 1 AI = 0 MTI = 1 Synergism M < 1 AI > 0 MTI < 1 Antagonism M > 1 AI < 0 MTI > 1 No addition M = M0 - MTI = 0

29 2. 圖解法 最常用的方法是繪製 isobologram，如圖 3.3.1。isobologram 是以 CA 為參考模式， 即圖中的直線，表示兩化學物的毒性單位相加恆為 1，為相加作用。向外彎曲的曲線 （isobole）表示拮抗作用，向原點彎曲則是協同作用。因此，將不同混合比例之實驗數 據點描繪在圖上，透過和 CA 模式預測線比較，可判斷混合毒性效應。若實驗數據點落 在 NA 預測線內，表示兩毒物混合屬於非交互作用（non-interactive），可以用本研究的 非交互作用模式 Multox 預測。若落在範圍外，則表示毒物發生交互作用，產生強烈的 拮抗效應，Chen 和 Chiou (1995)稱此為 complex joint action，此時無法用模式去預測。

圖 3.2.1 isobologram 示意圖

3.2.2 非交互作用混合毒性模式

Hewlett 和 Plackett 於 1959 年提出二維非交互作用混合毒性模式，假設生物和毒物 接觸後產生全或無反應（quantal response or all-or-non response），以下列數學式表示：

      _{ } Pr 1 1 2 1 1    Q ，01 Q 表示不反應率（non-response fraction），即存活率。Pr 為機率分布函數，可為常態分 布或其他機率分佈。為相似係數（similarity coefficient）。_i  z /_i Zi，zi為毒性物質的 濃度，Zi為毒物單獨作用產生抑制的濃度。

Christensen 和 Chen 於 1985 年擴充此理論，發展出可選用 Probit、Logit 或 Weibull 三種劑量反應模式來分析，並且能多種毒物混合的預測混合毒性之應用程式 Multox。

30

3.2.3 混合毒性效應參數 ρ 和 λ 值

Christensen 和 Chen 開發的 Multox 考慮相關係數（correlation coefficient, ρ）和相似 係數（similarity coefficient, λ）兩參數來預測混合毒性效應。

1. 相關係數：

由 Hewlett 和 Plackett 於 1959 年提出。假設兩毒性物質的機率分佈函數為二維常態 分佈（bivariate normal distribution），以毒性容忍度的相關係數 ρ，代表單一生物對兩毒 性物質之毒性容忍濃度的相關性，意即 EC50,1和 EC50,2的相關性。ρ 值範圍為1ρ1， ρ= 1 表示兩毒性物質容忍分布為完全正相關，ρ = -1 為完全負相關，ρ = 0 則為無相關性， 如圖 3.3.2 所示。 圖 3.2.2 兩化學物毒性容忍度之相關係數之示意圖。（a）完全正相關，ρ = 1（b）完全 負相關，ρ = -1（c）無相關性，ρ = 0 2. 相似係數： 描述兩毒性物質作用在生物體的位置或生化系統的相似程度，範圍為0λ1，當 λ 愈接近 1，表示毒性物質的作用位置愈相近，當 λ = 1 時，代表兩種毒性物質作用在同

31 一個生物系統，即相似作用。當λ = 0 時，則表示作用位置不同，為獨立作用。在混合 效應判別方面，當λ 介於 0 和 1 之間，為拮抗作用，λ 等於 1 為毒性相加作用。 同時考慮



與λ，可得到四種混合毒性效應模式，如表 3.3.2 所示。 1. 當兩毒物容忍度無相關性（ρ0），作用位置不同（λ = 0），混毒效應稱為 response multiplication。









2 1 12 2 1 2 1 2 2 2 2 1 1 1 1 0 , ; 0 , ; ` Q Q Q P P z z Z z P Q Z z P Q                       2. 當兩毒物容忍度完全正相關（ρ1），作用位置不同（λ = 0），混毒效應稱為 no addition。











1 2



12 2 1 2 1 2 2 2 2 1 1 1 1 , 0 , ; 1 , ; ` Q Q Min Q P P z z Z z P Q Z z P Q                      3. 當兩毒物容忍度完全正相關（ρ1），作用位置相同（λ = 1），混毒效應稱為 concentration addition。













                           2 2 1 1 12 2 1 2 1 2 1 2 2 2 2 1 1 1 1 1 , ; 1 , ; ` Z z Z z P Q P P z z P P P Z z P Q Z z P Q    4. 當兩毒物容忍度完全負相關（ρ1），作用位置不同（λ = 0），混毒效應稱 為 response addition。











1

 

2



12 2 1 2 1 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 0 , ; 1 , ; ` Q Q Q P P z z Z z P Q Z z P Q                          

32

表 3.2.2 四種混合毒性效應模式 Parameter values

Type of action Abbreviation Response

 _

0 0 Response multiplication RM 1-



1-P₁



1-P₂



1 0 No addition NA max



P₁,P₂



1 1 Concentration addition CA - -1 0 Response addition RA min



1,P₁ P₂



33

第四章

實驗材料與方法

4.1 實驗藥品與儀器

4.1.1 實驗藥品

1. 氯化鈉（Sodium chloride），99.8 %，Sigma-Aldrich 2. 碳酸氫鈉（Sodium bicarbonate），100.3 %，J.T.Baker 3. 硫酸鎂（Magnesium Sulfate），100.2 %，J.T.Baker 4. 氯化鉀（Potassium chloride），99.5 %，Sigma-Aldrich 5. 硫酸鈣（Calcium sulfate），99.5 %，J.T.Baker

6. 氫氧化鈉（Sodium hydroxide），99 %，Sigma-Aldrich 7. 硝酸鈉（Sodium nitrate），99 %，Sigma-Aldrich

8. 磷酸氫二鉀（Dipotassium phosphate），100 %，J.T.Baker 9. 氯化鎂（Magnesium chloride），100 %，J.T.Baker

10. 氯化鈣（Calcium chloride），94 %，Merck 11. 硼酸（Boric acid），100 %，Riedel-deHaen

12. 氯化錳（Manganese chloride），100 %，Riedel-deHaen 13. 氯化鋅（Zinc chloride），Fluka

14. 氯化鈷（Cobaltous chloride），Alfa Aesar 15. 氯化銅（Copper chloride），100 %，J.T.Baker

16. 鉬酸鈉（Sodium molybdate），100 %，Riedel-deHaen 17. 氯化鐵（Ferric Chloride），100 %，Riedel-deHaen

18. 乙二胺四乙酸二鈉（Disodium ethylenediaminetetraacetate），100 %，J.T.Baker 19. 鹽酸林絲菌素（Lincomycin hydrochloride），95 %，Fluka

20. 磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole），Sigma-Aldrich 21. 氟滅菌（Flumequine），Fluka

本研究中使用的抗生素作用機制分別為：lincomycin 和細菌核醣體的 50S 次單元結 合，阻止胜肽鍵形成；sulfamethoxazole 和對胺基安息香酸競爭二氫葉酸還原的結合位 置，抑制二氫葉酸合成；flumequine 抑制 DNA 旋轉酶，干擾細菌 DNA 複製和轉錄。

34

表 4.1.1 三種抗生素的物化性質、代謝率、半生期和河川檢測最高濃度 Lincomycin Sulfamethoxazole Flumequine Therapeutic class Macrolide Sulfonamide Fluoroquinolone

CAS 859-18-7 723-46-6 42835-25-6 Molecule weight (g/mol) 443.0 253.3 261.25

Solubility (mg/L) 927 510 71 logKow 0.56 0.89 1.6

pKa 7.6 5.7 6.4

% excretion as parent

compound 50 15 -

Half-life in environment - No degradation

after 40 d - Occurrence in surface water 1640 ng/L 650 ng/L 198 ng/L -：no data

4.1.2 儀器

1. 庫爾特計數器（Coulter counter），Multisizer II（Coulter Electronics, USA） 2. 溶氧測定儀（Dissolved oxygen meter），Model 5100（YSI, USA）

3. 酸鹼測定計（pH meter），SP-2200（Suntex instrument, Taiwan）

4. 總有機碳分析儀（TOC analyzer），Aurora Model 1030W（O. I. Analytical, USA）

4.2 藻類培養

4.2.1 生長基質

製備方法參考 U.S EPA。使用 0.45 μm 濾膜過濾去離子水配置下列七個 500 mL 的 stock solution： 1. 12.750 g NaNO ₃ 2. 6.082 g MgCl26H2O 3. 2.205 g CaCl₂2H₂O 4. 微營養鹽（micronutrient）包含下列藥品：

35 (1) 92.760 mg H₃BO₃ (2) 0.714 mg CoCl26H2O (3) 207.690 mg MnCl₂4H₂O (4) 3.630 mg Na₂MoO₄2H₂O (5) 1.635 mg ZnCl₂ (6) 0.006 mg CuCl₂2H₂O (7) 79.880 mg FeCl₃6H₂O (8) 150 mgNa₂EDTA2H₂O 5. 7.35 g MgSO₄7H₂O 6. 0.522 g K2HPO4 7. 7.5 g NaHCO ₃ 從 stock solution 各取 1 ml 到約 900 ml 已過濾的去離子水中，再稀釋至 1 L。接著 用 0.l N 的 NaOH 或 HCl 將 pH 調至 7.5 ± 0.1。另外配置不含 EDTA 的微營養鹽做為毒 性試驗時使用。裝生長基質的血清瓶使用前先經過高壓滅菌釜滅菌，之後用鋁箔紙包覆 避免照光，放在 4℃冰箱中保存。所有營養鹽一個月更換一次，防止變質對培養造成影 響。

36 表 4.2.1 月芽藻生長所需之微量營養鹽成份 化合物 濃度（µg/L） 元素 各元素濃度（µg/L） NaNO3 25.5 N 4.2 NaHCO3 15.0 C 2.14 Na 11.0 K2HPO4 1.04 P 0.186 K 0.649 MgSO4．7H2O 14.7 S 1.91 MgCl2 5.7 Mg 2.9 CaCl2．2H2O 4.41 Ca 1.20 表 4.2.2 月芽藻生長所需之微量營養鹽成份 化合物 濃度（µg/L） 元素 各元素濃度（µg/L） H3BO3 186 B 32.5 MnCl2 264 Mn 115 ZnCl2 3.27 Zn 1.57 CoCl2 0.780 Co 0.354 CuCl2 0.009 Cu 0.04 Na2MoO4．2H2O 7.26 Mo 2.88 FeCl3 96.0 Fe 30.0 Na2EDTA．2H2O 300

37

4.2.2 連續式藻類培養

本研究使用的藻種為月芽藻，購買自德州大學 The Culture Collection of Algae （UTEX 1648）。將藻種取至 250 mL 的錐形瓶中，並加入 100 mL 含 EDTA 生長基質後，放在轉 速 100 rpm 的迴轉式震盪器上，開始培養。當藻類生長達到對數期時，取 2 mL 藻液至 裝有 100 mL 生長基質的錐形瓶中，繼續培養。重複幾次上述批次方式的培養後，可將 藻液移至 4 L 的培養槽中，進行連續式培養。以磁石攪拌，避免藻細胞聚集。用蠕動幫 浦控制營養鹽的入流率，即控制稀釋率（dilution rate, D）： V F D F 代表入流率，V 為培養槽的體積。藉由入流率的調控，讓藻類生長維持在對數期和穩 定期。空氣會先經過潤濕並通過 0.45 μm 濾膜去除雜質才通入培養槽。待系統達到平衡 後，即可進行毒性試驗。連續式培養能讓新鮮營養鹽不斷流入、代謝廢物不斷排出，使 藻類生長環境長時間維持穩定。另外，連續式培養的藻類比起批次式培養，在毒性試驗 結有較佳的敏感性和再現性(Chen and Lin, 1997)。

培養控制條件如下： (1) 溫度：241℃。

(2) 照度：430010% lux，冷白光。 (3) 曝氣：400mL/day。

(4) 溢流率：1300 10 %mL/day（稀釋率為 0.3 /day）。

每日量測培養槽中藻細胞的細胞密度（cell density）、平均細胞體積（mean cell volume, MCV）和溢流率，來判斷是否已經達到穩定狀態（steady state）。當上述參數值連續三 天皆在一定範圍內，即認為系統達到穩定狀態，可以進行實驗。

4.3 密閉式藻類毒性試驗

實驗的稀釋水（dilution water）使用不含 EDTA 的生長基質。因為密閉式試驗是以 BOD 瓶作為實驗容器，不會和外界空氣接觸，所以為了避免碳源不足影響藻類生長， 使用含 0.5 %二氧化碳的氮氣將稀釋水曝氣。由於二氧化碳溶於水時會降低 pH，因此曝 氣前會先加入些許 0.1 N 的氫氧化鈉，使曝氣後之 pH 在 7.5 ± 0.1 的範圍內。

從培養母槽中取出適量之藻液，分別加入 BOD 瓶中使藻類初始細胞密度為 1.5×104 cells/ml。之後加入曝氣過的稀釋水至八分滿，再加入試驗藥品，最後補滿稀釋水至磨砂

38 口一半，加蓋完成水封，放在轉速 100 rpm 的迴轉式震盪器上。每次實驗一組八瓶，包 含一個控制組和七個實驗組，每組做三次重複，共 24 個 BOD 瓶。48 小時後測量各瓶 的溶氧量和細胞密度，並根據試驗前後溶氧變化量（∆DO）、產量和比生長率三個試驗 終點去計算抑制率。公式如下： （1）以溶氧變化量計算抑制率： 100% ΔDO ΔDO -ΔDO rate Inhibition C T C   ΔDOC和ΔDOT分別為控制組和實驗組的產氧量之平均值。 （2）產量的計算為生物質量在暴露時間內的改變量，其抑制率算法如下： 100% Y Y -Y rate Inhibition C T C   YC和 YT分別為控制組和實驗組的產量之平均值。 （3）平均比生長率的計算公式如下： ln ln (day1) i j i j -t t X -X μ μ 為第 i 天到第 j 天的平均比生長率。_i-j X 和_i Xj分別為第 i 天和第 j 天的生物質量。 以平均比生長率計算抑制率： Inhibitionrate - 100% C T C      圖 4.3.1 連續式藻類培養系統簡圖

39

4.4 水蚤急毒性試驗

本研究使用的水蚤品種為 Daphnia magna。馴養與試驗方法是依照環境檢驗所公告 的水蚤靜水式法。以高硬度稀釋水（硬度約為 168 mg CaCO3/L）為馴養水，溫度控制在 25 ± 2℃，光照時間 16 ± 1 小時。每天餵食飼料和月芽藻液。水蚤飼料的配製是將魚飼 料、乾酵母粉和葉草粉，以稀釋水溶解並均質攪拌，靜置 1 小時後取其上清液。月芽藻 液的製備方式為，將培養的月芽藻離心去除培養基質，再用稀釋水回溶，調整濃度為 3 × 107 cells/mL。 以時齡 24 小時內的水蚤進行毒性試驗。其做法為在實驗 24 小時前，將母蚤自馴養 容器移至裝有稀釋水的燒杯中，24 小時內生出的水蚤即可用於實驗。在試驗 2 小時前， 需先餵食，而試驗期間不餵食也不換水，溫度和光照時間與培養的條件相同。試驗容器 為裝有 25 mL 試驗溶液之 50 mL 小燒杯，每個燒杯放入 5 隻水蚤。暴露時間為 48 小時。 毒性試驗之控制組死亡率若超過 10 %，則該次實驗數據不得採用。 若不確定毒物的 EC50落在哪個濃度範圍內，則需要先進行範圍尋找試驗 （range-finding test），用較高的倍率，例如 5 或 10 倍，做毒物濃度的序列稀釋。每個濃 度水蚤總數為 5 隻，意即只做 1 重複的試驗。找到 EC50的區間後，即可進行確定試驗 （definitive test）。使用不超過 2 倍的濃度稀釋序列，並且每個濃度做 4 重複，共 20 隻 水蚤。試驗終點是水蚤失去游泳的能力（immobilization），判定方法為輕輕晃動燒杯後， 水蚤於 15 秒內沒有游動。EC50的計算是使用 Probit 模式。

4.5 鯉魚急毒性試驗

本研究是依照環境檢驗所制定的鯉魚靜水式法。鯉魚（Cyprinus carpio）購買自彰 化某魚場。馴養水為中硬度稀釋水（硬度為 80-100mg CaCO3/L），溫度控制在 25 ± 2℃， 光照時間 16 ± 1 小時。馴養時間為 7 天，若死亡率低於 10 %始可進行試驗。 以全長（上顎前端至尾鰭後端的長度）2.0 至 3.0 公分之鯉魚幼魚進行試驗。實驗前 24 小時不餵食，而試驗期間不餵食也不換水，溫度和光照時間與培養的條件相同。試驗 容器為裝有 1.5 L 試驗溶液之 2 L 燒杯。暴露時間為 96 小時，期間須將死亡的鯉魚移出。 毒性試驗之控制組死亡率若超過 10 %，則該次實驗數據不得採用。 若不確定毒物的 LC50落在哪個濃度範圍內，同樣需要先進行範圍尋找試驗 （range-finding test），用較高的倍率，例如 5 或 10 倍，做毒物濃度的序列稀釋。每一個 濃度的鯉魚總數為 5 隻，每個燒杯各放 5 隻。找到 EC50的區間後，即可進行確定試驗

40

（definitive test）。使用不超過 2 倍的濃度稀釋序列，而且每個濃度共 20 隻鯉魚，每個 燒杯裝 10 隻，做 2 重複的試驗。試驗終點為鯉魚死亡，死亡判定須符合兩條件：鰭及 鰓的活動停止以及魚體經輕觸沒反應。LC50的計算是使用 Probit 模式。

4.6 混合毒性試驗

本研究對三個抗生素進行二元混合（binary mixture）和三元混合（tertiary mixture） 毒性試驗。二元混合比例是依據月芽藻的生長率之 EC50，計算抗生素的毒性單位比，公 式如下： 50,2 2 50,1 1 2 1 EC z : EC z TU : TU  其中，z1和 z2為抗生素之濃度。使用毒性單位判斷混合毒性效應時，是用等毒性去計算， 意即毒性單位比 1：1，並且和 Multox 預測的混合效應做比較。繪製 isobologram 時則是 用毒性單位 3：1、1：1 和 1：3 三個實驗數據描點，再加上 Multox 四個預測模式的預 測線。三元混合比例是依照檢測出的環境最高濃度混合，試驗生物為月芽藻、水蚤和鯉 魚。以變異數分析（ANOVA）和杜納法（Dunnett’s test）比較控制組和實驗組是否有顯 著差異。若有差異表示在此試驗濃度，會明顯對生物造成影響。

41

第五章

結果與討論

5.1 單一抗生素之毒性試驗

5.1.1 月芽藻毒性試驗

本研究使用密閉式藻類毒性試驗，對三個作用機制不相同的抗生素進行實驗。表 5.1.1 至表 5.1.3 分別為三種試驗終點的結果。圖 5.1.1 至圖 5.1.3 為劑量反應曲線。三個 試驗終點以生長率（growth rate）的敏感度最低，溶氧變化量（ΔDO）和產量（yield） 得到的 EC50相近，唯一例外的是 sulfamethoxazole，ΔDO 的敏感性較產量差，可能原因 為此藥物不會抑制藻類的光合作用。以三種試驗終點比較抗生素對藻類的毒性強弱，可 知依據ΔDO 和生長率的毒性大小為 lincomycin > flumequine > sulfamethoxazole；以產量 得到的趨勢則是 lincomycin > sulfamethoxazole > flumequine。

從表 5.2.4，可以發現部分研究 EC50和本實驗結果相近，例如 sulfamethoxazole 1.53 mg/L 和 flumequine 2.6 mg/L。然而也有文獻得到極低的 EC50，例如 lincomycin 0.07 mg/L 和 sulfamethoxazole 0.146 mg/L，相差十倍以上，原因應是試驗條件不同所致，例如照度 或生長培養基。 表 5.1.1 月芽藻單一抗生素之毒性試驗結果（試驗終點為 ΔDO） Antibiotic EC50 (mg/L) 95% CI A B Lincomycin 0.656 0.612-0.699 5.374 1.657 Sulfamethoxazole 5.535 4.218-7.937 4.242 1.015 Flumequine 2.319 1.079-3.560 4.251 2.103

95% CI：95% confidence interval。A、B 分別為 Probit 模式之截距和斜率。

表 5.1.2 月芽藻單一抗生素之毒性試驗結果（試驗終點為 yield）

95% CI：95% confidence interval。A、B 分別為 Probit 模式之截距和斜率。

Antibiotic EC50 (mg/L) 95% CI A B Lincomycin 0.902 0.712-1.091 5.085 1.917 Sulfamethoxazole 1.423 0.663-2.182 4.786 1.341 Flumequine 2.041 1.799-2.284 4.091 2.936

42

表 5.1.3 月芽藻單一抗生素之毒性試驗結果（試驗終點為 growth rate）

95% CI：95% confidence interval。A、B 分別為 Probit 模式之截距和斜率。

圖 5.1.1 lincomycin 之劑量反應曲線。(■) ΔDO，(●) yield，(▲) growth rate

0.1 1 10 100 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 DO Yield Growth rate In hib iti on rat e ( %) Sulfamethoxazole (mg/L)

圖 5.1.2 sulfamethoxazole 之劑量反應曲線。(■) ΔDO，(●) yield，(▲) growth rate Antibiotic EC50 (mg/L) 95% CI A B Lincomycin 2.669 2.301-3.036 4.375 1.458 Sulfamethoxazole 6.493 5.521-7.464 4.176 0.913 Flumequine 3.215 1.760-4.670 4.193 1.469 0.1 1 10 100 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 DO Yield Growth rate In hib iti on rat e ( %) Lincomycin (mg/L)