nordihydroguaiaretic acid (NDGA) 、 15- lipoxygenase from soybeen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 、 HCl 、 Gallic acid 、 Quercetin 、 DPPH(α, α-diphenyl-β-picrylhydrazyl, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A.)、silica gel G60 (40- 60
µm, 230-400 mesh; Silia Flash, Silicycle,
U.S.A.)。Quercetin (Sigma)、Vanillic acid、p-Coumaric acid、Ferulic acid、Sinapic acid、AlCl3‧6H2O、Folin-Ciocalteu’s phenol reagent (Sigma)、Ursolic acid、Oleanolic acid。
三 三 三
三、、、、實驗器材實驗器材實驗器材實驗器材：：：：
1、快速粉碎機 (FRITSCH PU14, GERMANY) 2、恆溫震盪機 (友榆科技公司。台北)
3、超音波洗滌機 (Bransonic 3510R-DTH, U.S.A.)
5、真空凍結乾燥機 (TLSHIN LAB CO LTD, KOREA) 6、減壓濃縮機 (BUCHI-WaterbathB-480, Sweden) 7、真空烘箱(CHANNEL V40 U.S.A.)
8、ELISA (BioTek® Instruments, Inc. U.S.A.)
9、高效能液相層析儀 pump : (Model SIL-10ADVP, Shimadzu, Japan)
DAD : Diode array detector (Model SPD-M10Avp, Shimadzu, Japan) 10、紫外燈(Model CC-10, wavelength 254 nm and 366nm, Raytech
Industries, Inc., Upland, CA, U.S.A)
中，先加入乙酸乙酯 300 mL 充分混合委陵菜根或莖葉之乙醇萃取物，再加 入 300 mL 的 RO 水，劇烈震盪分液漏斗數分鐘後靜置。待分層後上層為乙 酸乙酯層，下層為水層。將乙酸乙酯層取出，再加入 300 mL 的乙酸乙酯於 分液漏斗中劇烈震盪數分鐘後，各別收集乙酸乙酯層和水層，合併兩次的 乙酸乙酯層。水層部分利用凍亁機凍亁，乾燥粉末為水區分物(PCLE-H2O,
PCRE- H2O)，而乙酸乙酯層減壓濃縮至亁，並放入真空烘箱將溶劑完全去
除，形成粉狀的乙酸乙酯區分物(PCLE-EA, PCRE-EA)，秤重後裝入樣品瓶 保存在-18 ℃中並計算回收率。
3.Silica gel 管柱層析
管柱層析管柱層析管柱層析3.1.PCRE-EA 或
或或或 PCLE-EA Silica gel 管柱層析管柱層析管柱層析管柱層析兩種樣品分別為 PCLE-EA 及 PCRE-EA。秤取 9 g 的 PCLE-EA 或 PCRE-EA 以甲醇 1：10 (w/v)回溶後，加入與樣品等重的 silica gel 攪拌均勻 形成懸浮的膠體溶液，以減壓濃縮去除甲醇成粉末狀，使 silica gel 吸附樣 品。管柱充填：以 314 g silica gel 加入 2.5 倍(w/v)的起始溶劑(Hexane)混合 成泥狀，緩慢的倒入玻璃管柱(Ø5.0 cm × 40 cm)中，到入矽膠同時拍打管 壁，使 silica gel 沉降堆疊的更均勻，形成矽膠管柱。將吸附樣品的 silica gel 粉末平鋪在管柱上方並且在樣品層上再覆蓋約 0.1 cm 乾淨的 silica gel 後，
依溶劑的極性從小到大進行沖提。以 Hexane、Dichloromethane、Ethyl Acetate、Acetone、Methanol 和 H2O 等六種溶劑各 2100 mL 依序進行沖提，
沖提液每 2100 mL 為一區分物共收集六個區分物。即 PCRE-EA-Hex、
PCRE-EA-EA 、 PCRE-EA-Di 、 PCRE-EA-Acetone 、 PCRE-EA-MeOH 、 PCRE-EA-H2O 或 是 PCLE-EA-Hex 、 PCLE-EA-EA 、 PCLE-EA-Di 、 PCLE-EA-Acetone、PCLE-EA- MeOH、PCLE-EA-H2O 將所有區分物以減壓 濃縮去除溶劑後，秤重裝入樣品瓶中保存在-18 ℃中，並計算回收率。
3.2.PCRE-EA-Acetone 管柱層析
管柱層析管柱層析管柱層析PCRE-EA-Acetone 秤取 2 g 後以甲醇溶解樣品，經上述製備樣品的方法 使 silica gel 與樣品吸附。製備矽膠管柱以 40 g 的 silica gel 經上述充填管 柱之方法，充填於玻璃管柱(Ø2.2 cm × 29 cm)中。將吸附樣品的 silica gel 粉末平鋪在管柱上方並且在樣品層上再覆蓋約 0.1 cm 乾淨的 silica gel，即 為 PCRE-EA-Acetone 的製備管柱。同樣由極性小到大的溶劑分別各以 300 mL 進行沖提。起始溶劑的選擇，是將 PCRE-EA-Acetone 點在 TLC 片上，
分別測定不同極性的展開溶劑系統，展開後選擇 Rf值在 1/3 左右的溶劑作 為起始溶劑，測試結果 Ethyl Acetate 展開後的 Rf 值約為 1/3，即以 Ethyl Acetate 為起始溶劑。依序提高沖提溶劑的極性進行沖提，即以 Ethyl Acetate、Ethyl Acetate : Acetone = 2 : 1、Ethyl Acetate : Acetone = 1 : 1、
Acetone、Methanol 和 H2O 等六種溶劑各 300 mL 進行沖提。沖提液以試管 收集，每支試管收集 10 mL，共收集 180 支試管。以 TLC 判別各試管中區 分物的 Rf值，將有相同 Rf值的試管合併成為一個區分物，共分 11 個區分
物，即 PCRE-EA-Acetone-A─K。將區分物減壓濃縮去除溶劑後，秤重裝入 樣品瓶中，保存在-18 ℃，並計算回收率。
4.區分物
區分物區分物 TLC 分析區分物 分析分析分析以 silica gel(60 F254 5 cm x 7.5 cm)薄層層析 (Thin layer chromatography, TLC) 片進行區分物的鑑定。在 TLC 下緣 1.5 cm 處及上端 1.5 cm 處，以 鉛筆畫一水平直線，進行萃取物初步鑑定。以管口平整之毛細管(內徑約 0.5 mm)吸取樣品液，輕點於線上同一點，待亁後，將 TLC 片垂直放入含 有展開液的密閉容器中，TLC 下端直線離液面約 0.5 cm，當展開至上方直 線處時，將 TLC 片從展開槽中取出，並於抽氣櫃中乾燥，以紫外燈觀察斑 點的螢光位置，並且計算斑點的 Rf值。
5.皂苷
皂苷皂苷呈色反應皂苷呈色反應呈色反應 呈色反應5.1.Liberman 顏色反應
顏色反應顏色反應 顏色反應參照 Farnsworth (1966) 之方法，在試管中放入濃度 1 mg/mL 的萃取物 1 mL 加入 1 mL 的乙酸酐溶解後，沿試管壁緩緩以滴加方式加入 0.2 mL 的 濃硫酸，試管保持靜置狀態，使兩種溶液介面澄清，觀察兩層液中間出現 環狀的顏色，進行萃取物初步鑑定。兩溶劑界面呈藍色或藍綠色表示含有 甾體皂苷；呈紅色、粉紅色或紫色，則為含有三萜類皂苷。
5.2.TLC 的呈色反應
的呈色反應的呈色反應的呈色反應委陵菜之區分物經薄層層析，烘乾之後，分別噴灑下列呈色劑。皂苷
類常用的顯色劑有濃硫酸或氯磺酸─乙酸 1 : 2 (v/v)等(Seikel, 1964；Pratt and Miller, 1984)
5.2.1.氯磺酸
氯磺酸氯磺酸氯磺酸─乙酸乙酸乙酸乙酸參照 Mastumoto (1963) 之方法，先將區分物樣品以甲醇回溶，每次取 約 5
µL 緩慢的點在 TLC 片上，使用展開劑 Hexane：ethyl acetate = 7 : 3 展
開後，再噴上氯磺酸─乙酸 1 : 2 (v/v)試劑後，在 130℃熱 5 分鐘後，在可見 光下觀察 TLC 片上斑點的顏色，若出現天藍、紫、粉紅、淡棕則表示樣中 具有不同種類的皂苷。5.2.2.濃硫酸
濃硫酸濃硫酸濃硫酸溶液溶液溶液溶液：：：：以上述展開溶劑展開後的 TLC 片，均勻噴灑濃硫酸後，在 70℃加熱 10 分鐘，在可見光下觀察 TLC 片上斑點的顏色，顯示橙色、紅紫、紅褐色、
紫色、黃色或淡棕色，則表示樣品中具有三萜類結構的皂苷化合物。
6.總多分測定方法
總多分測定方法總多分測定方法 總多分測定方法參考 Christel 等(2000)之方法，將樣品 PCRE-EA-Acetone-A─K 以甲醇 配製成適當濃度後，在試管中放入樣品溶液 0.1 mL，以 RO 水稀釋 10 倍的 Folin-Ciocaltou 試劑 0.5 mL，混合後靜置 5 分鐘，再加入 0.7 M 的 Na2CO3
溶液 0.4 mL，混和均勻後再靜置 45 分鐘，最後在波長 675 nm 下測定吸光 值，使用 gallic acid 作為標準檢量線，以內插法來判斷樣品中總多酚的含量。
空白：0.1 mL 甲醇 + 0.5 mL Folin + 0.4 mL Na2CO3
樣品：0.1 mL 樣品 + 0.5 mL Folin + 0.4 mL Na2CO3
標準曲線：0.1 mL gallic acid + 0.5 mL Folin + 0.4 mL Na2CO3
7.總類黃酮測定方法
總類黃酮測定方法總類黃酮測定方法 總類黃酮測定方法參考 Christel 等(2000)之方法，取適當濃度 PCRE-EA-Acetone-A─K 甲 醇溶液 1 mL，加入 2% methanolic AlCl3‧6H2O 水溶液 1 mL，在室溫下靜 置 10 分鐘後，在波長 430 nm 下測定吸光值。以 Quercetin (Sigma)製做標準 檢量線，並以內插法求取樣品中的總類黃酮含量。
8. HPLC 分析
分析分析分析8.1 HPLC 皂苷分析
皂苷分析皂苷分析皂苷分析法法法法參考 Wan 等 (2006) 及 Apers 等(1998)HPLC 分析三萜類皂苷的方法，
利用 HPLC 分析。管柱為 Lichocart® 100 PR-18e C18 (250 mm × 4 mm, 5 µm particles, Merck, Germany)，移動相的 A 液為水含 0.05% TFA 、B 液為氰甲 烷含 0.05% TFA 進行梯度的分析，移動相流速為 1 mL/min。梯度程式為 0─20 min B 液從 10%提升至 18%，20─40 min B 液從 18%提升至 19%，40─60 min B 液從 19%提升至 55%， 最後 B 液再降回 10%平衡 10 min，經過梯度沖提 之後，連結 DAD 偵測器在 203、205、210 nm 等波長下進行三萜類皂苷的 分析。
8.2 酚酸分析方法
酚酸分析方法酚酸分析方法酚酸分析方法參考Mattila and Hellstrom (2007)的HPLC酚酸分析方法，分析委陵菜中
所含有酚類物質。使用HPLC分析，管柱為Lichocart® 100 PR-18e C18 (250 mm × 4 mm, 5 µm particles, Merck, Germany)，偵測器DAD波長設定在254 nm、280 nm、329 nm、移動相A液為50 mM的H3PO4水溶液，並且以KOH 調整pH值到2.5。B液為Acetonitrile，移動相經過震盪脫氣後，以梯度模式 進行酚酸的分析，流速為0.7 mL / min。起始梯度為95%的A液、0─5分鐘將 A液由95%降至85%、5─17分鐘將A液由85%降至80%、17─40分鐘將A液由 80%降至50%、40─60分鐘時將A液保持在50%、60─65分鐘時將A液由50%
升至95%結束整個分析過程，最後讓機器平衡六分鐘後，再注進行射下一個 樣品。
8.3 烏蘇酸
烏蘇酸烏蘇酸烏蘇酸、、、齊墩果酸分析方法、齊墩果酸分析方法齊墩果酸分析方法 齊墩果酸分析方法參考 Liang 等(2007)的方法，以 HPLC 連接管柱為 Lichocart® 100 PR-18e C18 (250 mm × 4 mm, 5 µm particles, Merck, Germany)，移動相為甲醇：水 為 83：17，並且添加 0.2%的醋酸氨，以 0.1N HCl 調整 pH 值到 6.74。再以 0.22 µm 膜過濾後，震盪脫氣 30 min。偵測器為波長設定為 210 nm，流速 為 1 mL / min，分析時間約為 40 分鐘，比對烏蘇酸齊墩果酸等標準品的滯 留時間，分析 PCRE-EA-Acetone-B 中是否含有三萜類物質烏蘇酸、齊墩果 酸及其含量。
9.清除
清除清除 DPPH 自由基能力清除 自由基能力自由基能力自由基能力的的的測定的測定測定 測定參考 shimada 等(1998)的方法，並修飾之。秤取 10 mg 委陵菜之萃取物
或區分物，加入 10 mL 甲醇溶液配置成 1 mg / mL 為原液，再以甲醇進行
氧合酶抑制劑