碩士論文 碩士論文 碩士論文 碩士論文

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國立宜蘭大學食品科學系 國立宜蘭大學食品科學系 國立宜蘭大學食品科學系 國立宜蘭大學食品科學系

Department of Food Science National Ilan University

碩士論文 碩士論文 碩士論文 碩士論文

Master Thesis

委陵菜抗氧化 委陵菜抗氧化 委陵菜抗氧化及抑制脂氧合酶有效 委陵菜抗氧化 及抑制脂氧合酶有效 及抑制脂氧合酶有效 及抑制脂氧合酶有效 區分物分離鑑定

區分物分離鑑定 區分物分離鑑定 區分物分離鑑定

Isolation and identification Potentilla Chinensis active fractions in anti-oxidation

and inhibition of lipoxygenase

指導教授 指導教授 指導教授

指導教授: : :陳翠瑤 : 陳翠瑤 陳翠瑤 博士 陳翠瑤 博士 博士 博士 Advisor : Tsui-Yao Chen, Ph. D.

研究生 研究生 研究生

研究生: : : :葉旻杭 葉旻杭 葉旻杭 葉旻杭

Graduate Student : Min-Hang Ye

中 中 中

中 華 華 華 華 民 民 民 民 國國 九 國 九 九 九 十十 九 十 九 九 九 年年 一 年 一 一 一 月

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謝誌 謝誌 謝誌 謝誌

兩年多的研究所生活是我求學生涯的最後一個階段,也是我學生生涯 中最有收穫一段時光。感謝恩師 陳翠瑤博士讓我進入其實驗室,學業中對 研究的方向、實驗架構、甚至於實驗技巧等方面,都悉心給予指導並提出 指正,培養我要具有獨立思考,發現並解決問題的能力。學業外的部分也 對我做人做事應有的態度,循循善誘、諄諄教誨。也分享了許多人生的經 驗扮演了良師益友的角色。師恩浩瀚,永誌於心。僅於卷首以表感激。

文稿初成,承蒙恩師 駱錫能教授、邱一鳴教授、張永鍾教授,詳細審 閱與指導,對於謬誤錯漏之部分給予教導指正。同時提出許多寶貴的意見,

使論文更加完善,僅此獻上最深的感謝。此外,感謝金門技術學院 李欣玫 博士提供委陵菜樣品,使本研究能夠有足夠的實驗材料。

研究期間感謝系上各位老師的叮嚀鼓勵,使我能有所成長;也感謝研 究所的學長姐─定宏、星宇、怡蓉、世偲,同窗好友─雅琪、貞伶、雅秀、

弘毅、維廷,及實驗室的學弟妹筱涵、雅婷、琪穎、玉婷、雅惠、怡慧、

純婷、湘伶、憶璟、明彥、琮祐、鄭儒、勇辰、馨瑩等及他成員們在實驗 器材上的協助與精神上的鼓勵,給予我研究的動力。

最後感謝默默支持我的家人老爸、老媽給予我精神上的支持,以及物 質上的資助,讓我能完成學業無後顧之憂。也感謝女友玟萱在研究所期間,

給予支持和鼓勵。

僅以此榮耀獻給所有曾經協助我完成學業的所有人們,感謝您們對於 我的照顧、關懷、與支持,謝謝您們。

旻杭 謹致於

國立宜蘭大學食品科學系研究所 中華民國九十九年二月四日

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摘要 摘要 摘要 摘要

委陵菜(Potentilla chinensis)具有清熱解毒、涼血止痢的功效,泡酒飲用 具有治療關節炎的效果。脂氧合酶(lipoxygenase;LOX)作用花生四烯酸會 引發發炎反應,氧化壓力提高。本研究目的為探討委陵菜的乙醇萃取物中 的抗發炎物質,以抑制 LOX 及抗氧化能力為指標,並以管柱層析分離抑制 LOX 的有效區分物。

先以乙醇萃取委陵菜的根及莖葉分別得到 PCRE 和 PCLE。再以乙酸乙 脂 與 水 , 進 行 萃 取 物 極 性 劃 分 , 分 別 得 到 根 和 莖 葉 的 乙 酸 乙 酯 層 (PCRE-EA、PCLE-EA)和水層(PCRE-H2O、PCLE-H2O),其中以 PCRE-EA 的區分物抑制 LOX 能力最強,IC50為 13.39 µg/mL,清除 DPPH 自由基的 能力也較強,EC50 為 39.47

µg/mL。進一步以 silica gel 管柱層析分離

PCRE-EA 及 PCLE-EA,各得到六個區分物,其中以 PCRE-EA-Acetone 的 抗氧化能力最強,抑制 LOX 的 IC50約為 1 µg/mL,清除 DPPH 自由基的 EC50

為 38.02

µg/mL。且由 Liberman 法呈色及 TLC 片初步鑑定,PCRE-EA、

PCRE-EA-Acetone 區分物都有出現皂苷類化合物的反應。

再以 silica gel 管柱層析分離 PCRE-EA-Acetone 區分物,得到 A ─ K 共 11 個區分物,以 PCRE-EA-Acetone-B 的抗氧化能力最強,抑制 LOX 的 IC50 為 0.90 µg/mL,是 NDGA 的 IC50的四倍。清除 DPPH 自由基的 EC50為 16.63

µg/mL,是 Trolox 之 EC

50的兩倍。PCRE-EA-Acetone-B 的總多酚含量高達

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560.21 mg / g extract ,總類黃酮則約只有 4.98 mg / g extract ,以 Liberman 法呈色及 TLC 鑑定,也有出現皂苷類化合物的反應。

進一步以 HPLC 酚酸分析法分析 PCRE-EA-Acetone-B 之成分,並沒有 發 現 ferulic acid 、 p-coumaric acid 、 vanillic acid 等 酚 酸 , PCRE-EA-Acetone-B,可能含有其他酚酸化合物。以 HPLC 分析皂苷分析法 的進行 PCRE-EA-Acetone-B 之鑑定,在滯留時間 9 min~23 min 之內可觀 察到 8 個 peak,吸收波峰均在 200-240 nm 之間,且紫外光的吸光圖譜與 Apers 等(1998)從 Maesa lanceolata 中分離出的三萜類皂苷紫外光吸光圖譜 相似, PCRE-EA-Acetone-B 應含有三萜類皂苷類化合物。

委 陵 菜 具 有 抑 制 LOX 活 性 及 清 除 DPPH 自 由 基 的 能 力 , 以 PCRE-EA-Acetone-B 為最有效的區分物,其有效成分可能為三萜類的皂苷 化合物,亦可能為尚未鑑定的酚酸。

關鍵字 關鍵字 關鍵字

關鍵字:委陵菜、抑制 LOX、清除 DPPH 自由基、皂苷

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Abstract

Potentilla chinensis soaked in wine has pharmacholgical activities in

analgesic, anti-pyretic and antirheumatoid effects that were claimed by local herbalists. Lipoxygenase (LOX) acts arachidonic acid induces inflammatory reaction and oxidate stress increased. The purpose of this study was to extract the anti-inflammatory material from potentilla chinensis, and screening that of the inhibitory effect of LOX and antioxidant ability, then use the silica gel column chromatography to separate the LOX inhibitory material.

First we used ethanol to extract Potentilla chinensis leaves and roots and got the PCRE and PCLE, respectively. Then using ethyl acetate and water to partition the extracts. The PCRE-EA has more stronger effect in LOX inhibition and better DPPH free radical scavenging. The half inhibitory concentration (IC50) of LOX was 13.39 µg/mL, and the DPPH half scavenging effect concentration (EC50) was 39.47

µ

g/mL. Furthermore, using the silica gel column chromatography to separate PCRE-EA and PCLE-EA and got six fractions individually. The PCRE-EA-Acetone fraction was the most strongest antioxidant ability than that of the other fractions. The IC50 of LOX inhibition was near 1

µ

g/mL, and the EC50 of DPPH scavenging effect was 38.02

µ

g/mL. Among the coloring test with Liberman method and Thin layer chromatography (TLC) of compound in the PCRE-EA and PCRE-EA-Acetone fractions that showed similar colors to that of saponins.

Using the silica gel column to separate PCRE-EA-Acetone fraction got eleven fractions that were A to K fractions. The PCRE-EA-Acetone-B was the most strongest antioxidant ability than that of the others. The IC50 of LOX inhibition was 0.90 µg/mL that was fourfold of NDGA. And the EC50 of DPPH

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scavenging effect was 16.63

µ

g/mL that was twice of Trolox. The total phenols in the PCRE-EA-Acetone-B was 560.21( mg / g extract ), and the total flavonoids was only 4.98 ( mg / g extract ). The coloring test with Liberman method and TLC also showed the similar color to that of saponins .

Using high performance liquid chromatography (HPLC) to analysis the compounds of PCRE-EA-Acetone-B, it wasn’t found ferulic acid, p-coumaric acid, and vanillic acid. The PCRE-EA-Acetone-B could have other phenolic acid compounds. We also used the saponins analysis conditions of HPLC to analysis PCRE-EA-Acetone-B, and found the retention time at 9 min to 23 min have eight peaks at wavelength on 200 nm to 240 nm. The UV chromatograms were similar to that of Apers (1998) analysis triterpenoid saponins from Maesa

lanceolata, so the PCRE-EA-Acetone-B should have triterpenoid saponin

compounds.

The Potentilla chinensis had LOX inhibition and DPPH scavenging activities, PCRE-EA-Acetone-B was the most effect fractions and its effective compounds would be saponins or phenolic acids.

Key words : Potentilla chinensis, LOX inhibitor, DPPH scavenging, saponins

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目錄 目錄 目錄 目錄

中文摘要 中文摘要 中文摘要

中文摘要………I 英文摘要

英文摘要 英文摘要

英文摘要……….III

壹 壹

壹、、、、 前言前言前言前言……….1

貳 貳 貳 貳、、、、 文獻回顧文獻回顧文獻回顧文獻回顧……….3

一、 委陵菜屬簡介………3

1. 委陵菜簡介……….3

2. 委陵菜屬之成分………...………..4

二、 酚類物質………..………...5

三、 類黃酮………..………...6

四、 皂苷簡介………...………...7

1.皂苷的功效………..….….….………...8

1.1.抗發炎……….……….………..……….8

1.2.抗癌症…….………..………….……….9

1.3.抗血栓……….…...………...10

1.4.降血糖………....………...10

1.5.抗病毒…...………….………...11

五、 脂氧合酶………...11

1. 特性………....11

(11)

2. 動物體中的生理功能……….…………...12

3. 脂氧合酶和疾病的關係………...15

4. 脂氧合酶抑制劑………...17

參 參 參 參、、、、 實驗架構實驗架構實驗架構實驗架構………...22

肆 肆 肆 肆、、、、 材料方法材料方法材料方法材料方法………...23

一、 材料………...……..23

二、 實驗藥品……….23

三、 實驗器材……….23

四、 實驗方法……….24

1. 委陵菜乙醇萃取物製備………...24

2. 極性劃分(partition)………...………...24

3. Silica gel 管柱層析……….25

3.1. PCRE-EA 或 PCLE-EA Silica gel 管柱層析………25

3.2. PCRE-EA-Acetone Silica gel 管柱層析………26

4. 區分物 TLC 分析………..27

5. 皂苷呈色反應………...27

5.1. Liberman 顏色反應……….……..27

5.2. TLC 的呈色反應………...27

5.2.1.氯磺酸─乙酸……...……….………….……..……….28

(12)

5.2.2 濃硫酸溶液……….………….……….28

6. 總多分測定方法……….………...………..28

7. 總類黃酮測定方法……….……….29

8. HPLC 分析………...29

8.1.HPLC 皂苷分析法……….……….29

8.2.酚酸分析方法………..……...29

8.3.烏蘇酸齊墩果酸分析方法………...……...30

9. 清除 DPPH 自由基能力的測定………...30

10. 抑制脂氧合酶活性之測定………..……31

伍 伍 伍 伍、、、、 結果討論結果討論結果討論結果討論……….…..32

一、 委陵菜根及莖葉乙醇萃取物的抗氧化活性………...32

二、 委陵菜根和莖葉乙醇萃取物極性劃分區分物的抗氧化活性……...33

三、 PCLE-EA 管柱層析之區分物的抗氧化活性……….………….34

四、 PCRE-EA 管柱層析各區分物的抗氧化活性………...36

五、 PCRE-EA-Acetone 管柱層析各區分物抗氧化活性……….………...38

六、 PCRE-EA-Acetone 管柱層析區分物總多酚含量………40

七、 PCRE-EA-Acetone 管柱層析區分物總類黃酮含量………40

八、 皂苷成分鑑定………...41

九、 薄層層析鑑定皂苷成分………...42

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十、 PCRE-EA-Acetone-B 之 HPLC 分析結果………..……….43

陸 陸

陸、、、、 結論結論結論結論………...47 柒

柒 柒

柒、、、、 參考文獻參考文獻參考文獻參考文獻………...……48

捌 捌

捌、、、、 表表表表...59 玖

玖 玖

玖、、、、 圖圖圖圖………...………67

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表目錄 表目錄 表目錄 表目錄

附表一、比較不同天然物萃取物抑制 LOX 的 IC50...39

附 表 二 、 三 萜 皂 苷 化 合 物 對 不 同 試 劑 的 呈 色 反 應 及 對 應 的 Rf 值...43

表一、委陵菜根及葉極性劃分後產物清除 DPPH 自由基及抑制 LOX 能 力……….59

表二、PCLE-EA 經 Silica 管柱層析各區分物的回收率、清除自由基之能力 及抑制 LOX 之效果………...………...60

表三、PCRE-EA 經管柱層析各區分物的回收率………...61

表四、PCRE-EA-Acetone 經管柱層析各區分物的回收率………..62

表五、PCRE-EA-Acetone 管柱層析後區分物清除 DPPH 和抑制 LOX 半抑制 濃度...63

表六、PCRE-EA-Acetone 管柱層析區分物總多酚及總類黃酮含量...64

表七、PCRE、PCLE 及其相關區分物 Liberman 法呈色………65

表八、PCRE 及其區分物 TLC 呈色反應...66

(15)

圖目錄 圖目錄 圖目錄 圖目錄

附圖一、委陵菜………4

附圖二、酚類物質基本結構………5

附圖三、類黃酮基本結構………6

附圖四、三萜類皂苷的基本配糖體結構………7

附圖五、5-LOX 代謝路徑………..14

附圖六、5-LOX 調節細胞的生理活性……….15

附圖七、脂氧合酶抑制劑………..21

附圖八、Maesa lanceolata 皂苷紫外光圖譜……….……….46

圖 一 、 PCRE 及 PCLE 在 不 同 濃 度 下 清 除 DPPH 能 力…………...………...67

圖二、PCRE 及 PCLE 在不同濃度下抑制 LOX 活性的能力……..…….……68

圖三、PCLE 和 PCRE 經極性劃分的區分物在不同濃度下清除 DPPH 的能 力……….……69

圖四、PCLE 和 PCRE 經極性劃分的區分物在不同濃度下抑制 LOX 活性的 能力……….………70

圖五、PCLE-EA 管柱層析的區分物在不同濃度下清除 DPPH 自由基的能 力………..……….…..71 圖六、PCLE-EA 管柱層析的區分物在不同濃度下抑制 LOX 活性的能

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力……….72

圖七、PCRE-EA 管柱層析的區分物,在不同濃度下清除 DPPH 自由基的能 力……….73

圖八、PCRE-EA 管柱層析的區分物,在不同的濃度下抑制 LOX 活性的能 力……….74

圖九、PCRE-EA-Acetone 經過管柱層析的區分物,在不同濃度下清除 DPPH 的能力……….………75

圖十、.PCRE-EA-Acetone 管柱層析的區分物,在不同的濃度下抑制 LOX 活性的能力……….………76

圖十一、Trolox 與 PCRE-EA-Acetone-fraction 清除 DPPH 自由基能力比 較……….77

圖 十 二 、 NDGA 與 PCRE-EA-Acetone-fraction 抑 制 LOX 能 力 比 較………..………...78

圖十三、沒食子酸之標準檢量線……….……….………….79

圖十四、槲皮素之標準檢量線……….………..80

圖十五、酚酸標準品 HPLC 分析圖譜………..81

圖 十 六 、 PCRE-EA-Acetone-B 區 分 物 HPLC 酚 酸 分 析 條 件 之 圖 譜……….…82

圖十七、PCRE-EA-Acetone-B 區分物 HPLC-DAD 酚酸分析條件之紫外光圖

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譜……….83 圖 十 八 、 PCRE-EA-Acetone-B 區 分 物 HPLC 皂 苷 分 析 條 件 之 圖 譜……….84 圖十九、PCRE-EA-Acetone-B 區分物 HPLC-DAD 皂苷分析條件之紫外光圖 譜……….85 圖二十、PCRE-EA-Acetone-B 區分物 HPLC 皂苷分析各 peak 之紫外光圖 譜……….86 圖二十一、烏蘇酸、齊墩果酸標準品 HPLC 分析圖譜………..87 圖二十二、PCRE-EA-Acetone-B 區分物以分析烏蘇酸、齊墩果酸 HPLC 分 析法分析之圖譜……….88 圖二十三、烏蘇酸、齊墩果酸在不同濃度下抑制 LOX 的能力………89

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壹 壹 壹

壹、 、 、 、前言 前言 前言 前言

委陵菜學名為 Potentilla Chinensis,為薔薇科(Rosaceae),委陵菜屬 (Potentilla)的多年生草本植物,別名翻白草、天青地白。委陵菜性苦、寒、

歸肝、大腸經,有清熱解毒,涼血止痢之功效,用於 赤痢腹痛、久痢不止、

痔瘡出血、癰腫瘡毒(中華人民共和國藥典,2005)。民間利用委陵菜全草整 株曬乾入藥,或是泡酒飲用,治療風濕酸痛、退化性關節炎、肌肉酸痛,

可延緩甚至根治類風濕性關節炎的復發。

金門一條根長久以來被當地民眾使用來治療風濕酸痛及筋骨酸痛,一 條根乙醇萃取物抑制脂氧合酶(lipoxygenase;LOX)的 IC50為 18.83 µg/mL、

抑制 COX-2 的 IC50為 42 µg/mL (Pan and others 2005),而根據民間治酸痛經 驗中,委陵菜的效果更優於一條根,且不只能緩解症狀,甚至能達到根治 的效果,委陵菜對於關節炎治療有待科學的驗證。

目前從委陵菜屬不同品種中已經分離出一系列三萜類皂苷、固醇類、

黃酮類、酚酸、苯甲酸及沒食子酸(王等,2006;沈等,2006;高等 2007)。

雖然這些成分也存在於其他植物中,部分成分也都具有抗氧化之生理活 性,皂苷類化合物在實驗中證實具有降低氧化壓力,抗氧化的效果(Lee and others 2008)。另外,在細胞實驗中發現委陵菜皂苷對於 B 型肝炎病毒的生 長有抑制的效果,可降低細胞中 HBeAg、HBsAg、HBV-DNA 值,證實委

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陵菜具有抗病毒之作用(Zhao and others 2008)。但是對於治療關節炎的藥理 功效和有效成分仍有待探討。

發炎反應與人體內花生四烯酸經脂氧合酶(lipoxygenase;LOX)及環氧 合酶(cycloxygenase-2;COX-2)作用後的產物有關,抑制 COX-2 的藥物常用 來治療酸痛的症狀(Dannhardt and Kiefer, 2000)。在動物實驗治療因醋酸引起 的關節酸痛,抑制 5-LOX 的藥物比抑制 COX-2 的藥物更為有效(Singh and others 2005),所以抑制 LOX 活性能力的強弱,可作為評估抗發炎的有效指 標,作為篩選區分物的依據。

本研究目的為自委陵菜中萃取及區分抑制 LOX 活性及清除 DPPH 自由 基的有效物質,篩選出具有抗氧化能力的區分物並且以試管呈色試驗、TLC 鑑定、HPLC 分析,進一步鑑定有效區分物化合物的種類。

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貳 貳 貳

貳、 、 、 、文獻回顧 文獻回顧 文獻回顧 文獻回顧

一 一 一

一、、、、委陵菜委陵菜委陵菜委陵菜

1.委陵菜簡介

委陵菜簡介委陵菜簡介 委陵菜簡介

委 陵 菜 學 名 為 Potentilla chinensis, 是 薔 薇 科 (Rosaceae) 委 陵 菜 屬 (Potentilla)的多年生草本植物,別名翻白草、天青地白,高約30 ─ 60 cm,

主根發達,圓柱形。莖直立或斜生,密生白色柔毛,羽狀複莖葉互生,基 生葉有15 ─ 31小葉,莖生葉有3 ─ 13小葉;小葉片長圓形至長圓狀倒披針 形,長1 ─ 6 cm,寬6 ─ 15 mm,邊級缺刻狀,羽狀深裂,裂片三角形,常 反卷,上面被短柔毛,下面密生長柔毛;主要分布在北半球的溫帶地區,

高山和北極等區域。生於向陽山坡、路旁、田邊。在中國委陵菜主要分布 在東北、華北、西南、陜西、甘肅、山東、江蘇、河南、湖北、福建、廣 西等省份,以山東、遼寧產量最大。4 ─ 10 月採挖帶根全草,除去花枝與 果枝,洗淨,曬乾,或是莖葉部分全部去除,只取其根。(Ball and others 1968;

Chaoluan and others 2003; USDA-ARS 2008)。

台灣民間利用委陵菜全草整株曬乾入藥,或是泡酒飲用,治療風濕 酸痛、退化性關節炎、肌肉酸痛,可延緩甚至根治類風濕性關節炎的復發。

在 希 臘 語 和 拉 丁 文 中 稱 委 陵 菜 為 Heptaphyllon 或 Pentaphyllon 和

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Septifolium,有時又稱作 Quinquefolium。在中世紀時期西方便有醫生利用 委陵菜植株包括(根莖葉)等萃取物,治療發炎、潰爛、創傷、細菌造成的感 染或傳染病、真菌和病毒、腹瀉、糖尿病和其他疾病等(Fuchs, 1543)。在中 國則是用來治療腹瀉、肝炎、風濕及其相關疾病等症狀。以此可判斷委陵 菜在傳統中藥醫學中,的確具有其療效。

附圖一、委陵菜

2.委陵菜屬之

委陵菜屬之委陵菜屬之成分委陵菜屬之成分成分成分

目前已經從委陵菜屬的植物中鑑定出的化合物有:類黃酮化合物(薛 等,2005;沈等,2006)、水解型單寧和縮合型單寧及其衍生物(Okuda and others 1982;Goncharov and others 1989)、三萜類化合物(薛等,2005;Liu and others 2006; 沈等,2006)、有機酸和酚類化合物(高等,2007)另外還有一 些其他化合物如:精油(Naumchik and Rozentsveig 1963)、果糖(Schenck and others 1957)、胺基酸(Nikolaeva 2007)、脂肪酸(Kasyanov and others 1977)、

豆甾醇(Sokołowska and others 2002)等,這些化合物各自都具有不同的生理

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活性,可能是委陵菜中抗氧化和具保健功效之有效成份( Tomczyk and Latte 2009),以下分述這些成分的基本性質及其功效。

二 二 二

二、、、、酚類物酚類物酚類物酚類物質質質

酚類物質廣泛存在於各種植物中,屬於植物代謝過程中的二次代謝產 物,以化學結構來定義,是指芳香環狀物質中有一個或是多個羥基(Hydroxyl) 取代基的化合物及其衍生物,酚類物質的基本結構如下圖

附圖二、酚類物質基本結構

在植物性的食品中酚類化合物可以說是無處不在,除了已知的維生素 之外,為人們最常攝取的抗氧化物質。而酚類物質從簡單的苯酚到較複雜 的單寧已經被鑑定出超過八千種(Ferguson 2000)。酚類化合物具有多種抗氧 化、抗發炎、抗癌症等效果。委陵菜屬中被鑑定出數種酚酸:沒食子酸(gallic acid)、苯甲酸(Benzoic acid) (高等 2007) 、香草酸(Vanillic acid)、香豆酸 (ρ-Coumaric acid)( Krzaczek 1984)、芥子酸(Sinapic acid)(Bate-Smith 1961) 等,另外還有縮合型單寧及水解型單寧等( Tomczyk and Latte 2009)。這些酚 類物質或許就是委陵菜能夠具有強的清除自由基能力,及抑制脂氧和酶活

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性的來源。

三 三 三

三、、、、類黃酮類黃酮類黃酮類黃酮(Flavonoids)

附圖三、類黃酮基本結構

類黃酮化合物(flavonoids),又稱為生物類黃酮(bioflavonoids),為植物 酚類化合物之主要組成分,存在於蔬菜、水果、堅果、種子、莖葉、花、

茶以及酒、蜂蜜和蜂膠等許多天然物質中,其中以黃酮及黃酮醇廣泛存在 於植物組織中。截至目前為止,已鑑定有六千多種。黃酮類的基本化學結 構為 15 個碳構成一個三環的化合物(C6-C3-C6, A-C-B)。環上常見的取代基 為 OH 基、OCH3基,而類黃酮的生化活性取決於環上取代基及 OH 基的數 目與位置,其抗氧化活性也隨著結構排列之不同,而有所差異(Cook and Samman 1996)。類黃酮中,主要可分為:黃酮(flavones)、黃烷酮(flavanones)、

黃酮醇(flavonols)、黃烷醇(flavanols)、異黃酮(isoflavones),及花青素配基 (anthocyanidins)等,其結構的分別主要在含有氧的雜環上,其色澤多為黃色 或無色,主要存在於蔬果、茶飲料及紅酒中(Dreosti 2000; Bravo 1998)。

類黃酮之抗氧化活性與其結構官能基及氫原子排列有關。類黃酮亦有螯合 金屬之能力,B環上若有鄰位雙羥基(ortho-dihydroxyl)的結構,會增加螯合 金屬的能力。類黃酮的抗氧化機制包括去除自由基及活性氧分子;利用螯

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合能力抑制金屬離子;與蛋白質形成複合物;還原氧化的維生素E或C以顯 示抗氧化的加乘效果。大部分類黃酮的分布隨植物種類而不同。每一種植 物有其特殊的類黃酮,例如柑橘類主要是黃烷酮,葡萄則富含黃烷醇之果 實(Catherine and others 1996,1997)。委陵菜屬植物中已經被鑑定出的類黃 酮種類有Quercetin、Kaempferol、Luteolin、Myricetin、Naringenin、cyanidin 等( Tomczyk and Latte 2009),其中沈等(2006)從Potentilla chinensis 中分離 出Quercetin、apigenin 分別屬於黃酮醇和黃酮類,為委陵菜清除自由基等抗 氧化活性的主要成分。

四 四 四

四、、、、皂皂皂皂苷簡介苷簡介苷簡介苷簡介(saponin)

附圖四、三萜類皂苷的基本配糖體結構

皂苷(saponin)為植物體中廣泛存在的糖苷化合物(glycosides),其組成為 配醣體(aglycone)與糖基結合而成。皂苷依配醣體的化學結構可分為兩類,

有類固醇配醣體結構者(由 27 個碳鏈組成),稱固醇類皂苷;有三萜類配醣 體結構者(由 30 個碳鏈組成),稱三萜類皂苷(triterpenoid saponin)。三萜類皂 苷是由六個異戊二烯所組成的 30 個碳五環化合物,三萜類皂苷在結構上可 以連接許多 OH 基、COOH 基或是糖苷鍵等。三萜類皂苷所具有的生理活

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性,是由不同位置上的碳連接不同的糖苷鍵而產生生理活性的差異,常見 連接有 glucose、galactose、rhamnose、arabinose、xylose 等或由這幾種複合 成的多醣糖苷鍵,由於結構複雜而具有許多相似之化合物,目前仍無法將 其完全分類出來。

三萜類皂苷廣泛存在於植物中,目前已經有多種植物經鑑定含有三萜 類 皂 苷 , 如 繖 形 花 科 Umbelliferae (Huang and others 2008) 、 遠 志 科 Polygalaceae (Wang and others 2007)、無患子科 Sapindaceae (Huang and others 2008)、桔梗科 Campanulaceae (He and others 2005)、薔薇科 Rosaceae (Zhao and others 2008)、玄蔘科 Scrophulariaceae (Ganzera and others 2004) 、菊科 Asteraceae 等(Yadava and Jharbade 2008)。委陵菜屬中被分離鑑定的三萜類 皂苷目前有烏蘇酸(Ursolic acid)、2α-Hydroxyoleanolic acid 等 (沈等,2006;

Xue and others 2005;Liu and others 2006)。

1.皂苷的功效

皂苷的功效皂苷的功效 皂苷的功效

1.1.抗發炎

抗發炎抗發炎抗發炎

皂苷已被證實具有抗發炎的功效,Matsuda等(1997)從歐洲七葉樹中分 離出”escin”皂苷及其相關化合物。結果”escin”皂苷及其相關化合物具有抑制 以乙酸誘導小鼠血管通透性上升並發生腫脹的效果 (Matsuda and others 1997)。Sirtori(2001)從七葉樹屬中萃取的皂苷”aescin”, 進行治療ddY mice 慢性靜脈功能不全的模式動物,證明皂苷具有抑制水腫、抗發炎的功效。

(26)

Wang等(2008)以甲醇萃取瓜子金,再將萃取物分離純化得到saponin 5,可抑 制以卡德蘭膠注射到小鼠足部,產生的發炎腫脹現象,saponin 5的確能有效 抑制小鼠足腫脹且其效果比正對照的Indomethacin更佳。此外,MTT試驗中 saponin 5在濃度100 µM 時對於小鼠正常的細胞,也沒有細胞毒性。

1.2.抗癌症

抗癌症抗癌症抗癌症

D’Acquarica等(2002),從海桐(七里香)中分離鑑定出了四種新結構的皂 苷分別是IIA2、IIIA3、IIIB2、和 IIIC4 藉由質譜儀鑑定它們的結構,發現這 四種三萜類化合物都具有一個acylated pentacyclic triterpenoid aglycone 的 糖苷鍵,而且此類皂苷粗萃物不論在體內或體外試驗都對癌細胞具有顯著 的毒性。Fu等(2006)以乙醇萃取Symplocos chinensis(灰木)的根,再將萃取物 進行區分,從正丁醇區分物中分離出八種新的三萜類皂苷symplocososides L-S (1-8),並且發現皂苷結構上,在C21-22的糖苷鍵結將影響皂苷及其水解 物對癌細胞生長的抑制的效果。Chan(2007)從Xanthoceras sorbifolia中分離 出的皂苷為具有三醣鏈的三萜類皂苷,並且在C3、C21、C22鍵上接有糖苷 鍵。以MTT試驗測試分離出的皂苷對多種腫瘤細胞生長的影響,皂苷皆有 抑制腫瘤細胞生長的效果,作者同時也探討此類皂苷的C3、C21、C22鍵結 Xanifolia-Y、Xanifolia-X、β-Escin可抑制卵巢癌細胞株OVCAR-3的活性,

且有最佳抑制生長的效果,IC50約在14.5 µg/mL。Zhang和Li (2007)針對七葉 樹屬的Aesculus pavia L.的果實進行化學分析,並且從中分離出五環的三萜

(27)

類皂苷,以NMR鑑定其結構,有30種鍵結不同的糖苷鍵化合物,其中 Compound 14─22 和 Compound 26─28 這 幾 個 結 構 的 C21─22 位 置 上 接 aesculiosides Ia─Ie (Compound 14─18),aesculiosides IIa─IId (Compound 19─22),Compound 26─28 C21─22位置接GlcA-p、Gal-p、Glc-p、Ara-f 的 三萜類皂苷化合物,對白血病、肺癌分類中的非小細胞癌、大腸癌、黑色 素瘤、中樞神經、卵巢、腎臟、前列腺及乳癌以下九種癌症細胞株分別進 行試管培養,發現在C21-C22有兩個醯基的化合物具有有細胞毒性,GI50約 在0.175 ─ 0.871

µM,而在此兩個位置沒有醯基的化合物則不具有細胞毒

性,也間接說明了三萜類結構之化合物在C21─C22有酰基的化合物的結構 對於癌症細胞有抑制的作用。

1.3.抗血栓

抗血栓抗血栓抗血栓

Zhang等(1999)從Anemarrhena asphodeloides Bunge (Liliaceae)中萃取出 anemarrhenasaponin I、anemarrhenasaponin Ia、timosaponin B-I、timosaponin B-II、timosaponin B-III等六種皂苷,以體外試驗評估這六種皂苷抗血小板凝 集 及 溶 血 栓 的 作 用 , 僅 timosaponin A-III 出 現 較 強 的 溶 血 栓 的 作 用 , anemarrhenasaponin Ia 則有些微的溶血栓作用,結果顯示從Anemarrhena

asphodeloides Bunge (Liliaceae) 萃取出的甾族皂苷可做為開發抗血栓藥物

用來治療心肌梗塞的新來源。

1.4.降血糖

降血糖降血糖降血糖

(28)

Cho等(2006)使用糖尿病模式動物的大鼠,從第六週開始餵食人蔘皂苷 Re,並且分別在第六、第七、第八週測定血糖、總膽固醇、三酸甘油脂,

其中大鼠在餵食人蔘皂苷兩週後,血糖含量有明顯的下降,顯示人蔘皂苷 能對模式動物體內的血糖含量產生影響,達到控制血糖變化的效果。

1.5.抗病毒

抗病毒抗病毒抗病毒

Aquino等(1991)證實薯預皂苷等具有抗病毒的活性,且其抗病毒的結構主要 為菲類(phenanthrene)的衍生物。Zhao等(2008)以鵝絨委陵菜乙醇萃取物,經 過乙醇-水的混合溶液梯度區分成A-C三層區分物,再從B層中以二氯甲烷- 甲醇混合溶液區分出 compound 2進行抗 B型肝炎病毒功效的評估,以 lamivudine(3TC)做為正對照,以2.2.1.5細胞係在in. vitro的試驗中,發現 compound 2 確有抑制HBeAg (hepatitis B "e" antigen)、HBsAg (hepatitis B surface antigen)、HBV-DNA (hepatitis B virus)的效果。此外compound 2也具 有效使B型肝炎病毒不再復發的作用。推測三萜類皂苷所具有的生理活性與 傳統中藥所宣稱之功效有關。

五 五 五

五、、、、脂氧合酶脂氧合酶脂氧合酶脂氧合酶

1.特性

特性特性 特性

脂氧合酶 (lipoxygenase ; LOX E.C. 1.13.11.12 ) ,為一含鐵的 non-heme 雙氧合酶,專一性地作用在具有 1,4-順、順-戊二烯結構的多元不飽和脂肪 酸(polyunsaturated fatty acid ; PUFA)。能催化氧分子結合在多元不飽和脂肪

(29)

酸的雙鍵位置進行氧合作用,可將 1 莫耳氧分子納入基質,形成共軛雙烯 鍵不安定的氫過氧化物,其催化作用具有基質特異性、作用特異性及立體 構型上的特異性。LOX,包括自由態及酯化型態,常見基質為 C18:2、C18:3

、C20:4、C20:5、C22:6。當脂氧合酶作用於花生四烯酸( arachidonic acid, AA ) , 依 據 反 應 位 置 的 不 同 , 產 生 不 同 的 氫 過 氧 化 物 , 有 5-hydroperoxyeicosatetraenoic acid (5-HpETE)、12-HpETE、15- HpETE,這 些產物將進一步還原成氫氧化物 5-hydroxyeicosatetraenoic acid (5-HETE)、

12-HETE、15-HETE,以此將脂氧合酶區分為 5-LOX、12-LOX、15-LOX 異 構酶 (Yamamoto, 1992)。5-LOX、12-LOX 或 15-LOX 在聯合作用後,產生 lipoxins (LX),為一種脂質介質含有 trihydroxytetraene,具有停止傷口發炎 症狀信號的功能,並且能促進傷口癒合修復(Serhan 1999)。

2.動物體中的生理功能

動物體中的生理功能動物體中的生理功能 動物體中的生理功能

在動物體中 LOX 大都存在於富含血液的組織,如血小板、白血球、淋 巴細胞及肺,與免疫發炎反應有關(Sloane and others 1990)。當細胞受到刺 激或是組織受到傷害、感染,這些刺激因子會刺激體內白細胞,開始合成 白三烯素(leukotrienes)。白三烯素合成的路徑為:當組織受損時,細胞外的 鈣離子會流入細胞內,促使細胞質中的磷脂質水解酶 A2(phospholipase A2,PLA2)轉移至細胞膜上作用磷脂質,水解甘油脂 sn-2 的位置,產生游離 態的花生四烯酸,會產生這些反應的細胞包括巨噬細胞、嗜中性細胞、血

(30)

小板及肥胖細胞。接著細胞膜上的花生四烯酸與由細胞內移動到細胞膜上 的 5-LOX , 會 將 花 生 四 烯 酸 催 化成 5-hydroperoxyeicosatetraenoic acid (5-HpETE) 和 leukotriene A4 (LTA4) (Samuelsson and others 1987; Funk 2001)。而不穩定的中間物 LTA4會被 LTA4水解酶催化成 leukotriene B4 (LTB4) (Haeggström 2004),或是由 leukotriene C4 synthase 和其異構酶同功酶 MGST2 ( microsomal glutathione S-transferase 2)和 MGST3 ( microsomal glutathione S-transferase 3)變成 leukotriene C4 (LTC4) (Schröder and others 2003)(Fig.1)。

LTB4 是中性粒細胞(neutrophils)、嗜酸性粒細胞(eosinophils)和單核細胞 (monocytes)強而有力的趨化因子,導致吞噬細胞(phagocytes)附著在血管壁 上,中性粒細胞發生去粒作用(degranulation)及釋放超氧陰離子,而超氧陰 離子又會形成過氧化氫產生一連串的氧化反應。而 LTC4及其代謝產物則為 強大的刺激物,會使血管通透性提高,也使呼吸道產生黏膜導致氣喘或哮 喘的發生(Werz and Steinhilber 2006)。

(31)

附圖五、5-LOX 代謝路徑

白三烯素(leukotrienes ; LT)為一種具有生物活性的脂質介質,由白細 胞中產生及釋放,影響細胞中的G protein-coupled receptors(GPCR),LT顯示 多 種 的 生 物 效 應 。 控 制 細 胞 產 生 5-LOX 的 代 謝 物 主 要 是 受 到 cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) 的作用釋放花生四烯酸,影響5-LOX的活性。在 休眠細胞中根據細胞的類型,不論在細胞質或是細胞核中5-LOX可作為一種

(32)

可溶性的酵素酶,在普遍接受的情況下,5-LOX和cPLA2在細胞核外作用,

由細胞膜上連結的5-LOX使蛋白質(FLAP)產生活性代謝磷脂質釋放出 AA(Werz 2002)。

附圖六、5-LOX 調節細胞的生理活性

3.脂氧合酶和疾病的關係

脂氧合酶和疾病的關係脂氧合酶和疾病的關係 脂氧合酶和疾病的關係

Qu 等(2000)研究 5-LOX 和神經退行性疾病的關係,以 F344 品系的大 鼠分成兩組,分別為 24 個月跟 2 個月。利用 PCR、RT-PCR 及西方墨點法 檢查兩種大鼠的海馬迴跟小腦中,是否含有 5-LOX、mRNA、FLAP (5-LOX activating protein) mRNA 和 5-LOX protein。發現 24 個月的大鼠腦中的海馬 迴跟小腦內含有較高量的 5-LOX 蛋白質,另外也確定在老年大鼠的小腦中

,細胞膜/細胞質含有 5-LOX 的比例是比年輕的大鼠高,結果說明了 5-LOX

(33)

系統在神經退行性疾病中,扮演了重要的角色(Qu and others 2000)。

15-LOX 轉換花生四烯酸後會產生具有生物活性的花生酸衍生物、

15-HpETE 和 13-S-hydroxyoctadecadienoic acid (HODE)等,已知具有多種 功 能 包 括 抑 制 癌 細 胞 運 動 和 侵 入 。 而 15-LOX 又 分 為 兩 種 類 型 type-1(leukocyte type)白細胞型和 type-2(epidermis type)表皮型。Jiang 等人對 15-LOX 和癌症跟腫瘤的關係進行研究,採用免疫組織和基因轉錄進行化學 分析定量,正常的 15-LOX-1 和 15-LOX-2 在正常的乳腺上皮細胞和乳腺內 皮細胞中都可以被發現,在乳腺腫瘤中 15-LOX-1 和 15-LOX-2:CK19 的比 率均小於正常的乳腺細胞,總之 15-LOX 中的 15-LOX-1 和 15-LOX-2 在人 類的乳腺癌中有抑制乳腺癌腫瘤的效果(Jiang and others 2005)。

目前對於15-LOX-1和大腸癌的發生及其他癌症發生的切確生物學作用 仍然有些爭議,因此Yoshinaga等人針對15-LOX-1對於調控人類結腸癌細胞 p21 (Cip/WAF 1)的影響進行試驗,利用15-LOX-1轉換產生的13-S-HODE作 用在p21 (Cip/WAF 1)上,並且個別或是共同使用sodium butyrate (NaBT)、

nordihydroguaiarectic acid (NDGA)這兩種LOX的抑制劑來做處理,並且評估 大腸癌株細胞Caco-2 cells的表現。發現15-LOX-1及其代謝物13-S-HODE對 結腸癌細胞HCT-116具有增殖的作用,過度表現15-LOX-1會誘導細胞膜外 的訊息傳遞酶(ERK)1/2,磷酸化減少p21 (Cip/WAF 1)的表現和增加結腸癌 細胞HCT-116的生長,利用NDGA處理則可以降低(ERK )1/2訊息傳遞酶磷酸

(34)

化,增加p21 (Cip/WAF1)的表現,使15-LOX-1過度表現的HCT-116細胞生長 速率下降。實驗結果顯示15-LOX-1及其代謝物13-S-HODE在大腸癌中可能 具有幫助腫瘤生長的效果(Yoshinaga and others 2004)。

另外 LTB4在免疫系統中扮演重要的角色,發生急性髓系白血病( acute myeloid leukemic, AML)和急性淋巴細胞白血病( acute lymphoid leukemic, ALL)的患者體內產生的 LTB4較高,Vincent 等人以 RT-PCR 測定 LOX 的 mRNA 顯示 5-LOX 轉錄的遠比 12-LOX 和 15-LOX 要多。以鈣離子載體刺 激白血病細胞 5-LOX 活性蛋白表現增加,LTB4量也較高,相反的卻沒有發 現 15-HETE 的存在。鈣離子載體刺激了白血病細胞(leukemic blast)產生 12-HETE,血小板同時也釋放了(thromboxane A2)血栓素 A2,顯示 LTB4和 12-HETE 活化血小板。對於白血病細胞而言 LTB4、12-HETE、15-HETE 對 細胞的增殖和凋亡沒有顯著的影響,研究顯示不成熟的白血病細胞會產生 LTB4,但是三大主要脂氧合酶代謝花生四烯酸產生的代謝物:LTB4、 12-HETE、15-HETE,沒有明顯的影響白血病的細胞生長或是凋亡。作者推 測 LTB4可能由不成熟的白血球細胞中產生,會增加或延長組織的發炎症狀

,並且傷害或影響骨髓或血液的網絡因子(Vincent and others 2008)。

4.脂氧合酶抑制劑

脂氧合酶抑制劑脂氧合酶抑制劑 脂氧合酶抑制劑

目前對於脂氧合酶抑制劑的研究,已經有顯著的進展。其中一類是 以細胞中5-LOX的活性蛋白FLAP(5-lipoxygenase activating protein)為標的,

(35)

此類抑制劑有MK886。FLAP是一個18kDa的膜結合蛋白,為活化5-LOX的 蛋白質,當組織受損時,細胞外的鈣離子會流入細胞內,促使細胞質中的 PLA2轉移至細胞膜上作用磷脂質,水解甘油脂sn-2的位置,產生游離態的 花生四烯酸,FLAP同時會活化5-LOX,使白三烯素增加(Miller and other 1990)。MK886可以抑制細胞中白三烯素的合成,但是在破碎細胞中卻不影 響5-LOX的活性發生。FLAP屬於MAPEG (membrane-associated proteins in eicosanoid and glutathione metabolism)蛋白質家族的一員,其中還包括了 LTC4 synthase 、 mPGE synthase-1 and MGST1、-2和-3(Lam and others 1994;

Jakobsson and others 2000)。FLAP位置位在核膜上,除了T淋巴細胞之外,

大多數的細胞上的FLAP會伴隨著5-LOX的表現。使用人類骨肉瘤細胞系進 行細胞轉染實驗證明FLAP合成酶是細胞中合成白三烯素所必須的合成酶 (Dixon and others 1990),細胞內合成白三烯素需要5-LOX和FLAP共轉染合 成後刺激載體才能產生白三烯素,而MK886則可抑制FLAP的活性,使細胞 中的5-LOX即使具有活性也無法產生白三烯素。此外,在有FLAP缺陷的老 鼠的巨噬細胞中也無法檢測出白三烯素(Byrum and others 1997)。因此FLAP 被認為是細胞合成白三烯素所必須的酶(內源性),但對於5-LOX的活性則沒 有影響(Rouzer and others 1990)。因此確定FLAP至少是抑制白三烯素生成的 一個目標合成酶,除了MK886之外有效抑制FLAP的化合物還包含了Bay-X 1005、MK0591 ,其中FLAP抑制劑Bay-X 1005已經在臨床上宣稱可以治療

(36)

多發性硬化症(Werz and Steinheilber 2005)。

另一方面則是發展選擇性拮抗劑,目標是5-LOX產物的受體,也就是白 三烯素的受體。分為有BLT、CysLT 、OXE受體這三類,這些受體的作用 在於將白三烯素的生理活性,藉由受體傳導到特定的細胞表面,對細胞組 織產生影響。白三烯素分別結合BLT1和BLT2兩種受體,這兩種受體具有高 同源性,但是各自分布在不同的組織及具有獨特的藥理特性(Brink and others 2003)。對LTB4而言,BLT1為一種高親和力的受體,在一些白細胞量 較低的組織,大量表現白細胞的活性,像是脾、胸腺、骨髓和其他一些組 織(Owman and others 1996; Yokomizo and others 1997)。而BLT2對於LTB4的 親和力比BLT1還要低20倍,但是表現活性的範圍更廣,例如在內皮細胞或 是中性粒細胞。不過目前開發干擾LTB4受體的藥物的進度比起CysLT受體拮 抗劑慢,現有LY293111這種藥物在進行第二階段臨床試驗,針對IIb或IV期 的非小細胞肺癌(NSCLC)和結合另一種藥物gemcitabine治療胰腺癌(Ding and others 2005)。

CysLT 受體為異質結合受體,已鑑定 CysLT1和 CysLT2有,可能還有 第三種 CysLT 受體。CysLT2受體比起 CysLT1受體更廣泛的分布在組織中並 且對於傳統的 CysLT1 受體拮抗劑不敏感。CysLT1 受體表現在嗜酸性粒細 胞、單核細胞、巨噬細胞和支氣管平滑肌細胞,但是在人類脊髓血源性肥 大細胞中卻只有 CysLT1 表現活性沒有發現 CysLT2 (Mellor and others

(37)

2001)。CysLT2受體的表現在嗜酸性粒細胞,外周血單核細胞,肺巨噬細胞 和內皮細胞(Kanaoka and Boyce, 2004)。白三烯素使 CysLT1受體產生激活細 胞的效果是以 LTD4≫LTC4>LTE4,LTC4 和 LTD4同樣也具有使 CysLT2激 活細胞的效果,而 LTE4的效果則較差(Brink and others 2003)。在 CysLT 所 使用的拮抗劑為 montelukast 和 zafirlukast 在哮喘的臨床實驗上已確認有 效,並且成功的進入市場(Kemp 2003)。

5-Oxo-ETE 是 一 種 由 花 生 四 烯 酸 代 謝 物 5-HETE 氧 化 形 成 5-hydroxyeicosanoid dehydrogenase (5-HEDH) 後 的 終 產 物 , 生 物 合 成 5-Oxo-ETE是由於超氧陰離子及氧化力的刺激(Powell and others 1994)。

5-Oxo-ETE會趨化嗜酸性粒細胞和中性粒細胞和誘導肌動蛋白聚合、鈣離子 的通透、整合表現及脫粒的擴散及刺激前列腺癌細胞(Powell and Rokach 2005)5-Oxo-ETE的活性需要透過 OXE 受 體 的 傳 導 (Hosoi and others 2002),和Gi蛋白連結時有較強的表現 (Jones and others 2003 ; Brink and

others 2004),在體內試驗時會誘導嗜酸性粒細胞活化顯示可能參與過敏性

疾病,如哮喘等。

除了人工製造的抑制劑外,在天然物中也有脂氧合酶的抑制劑,

Schewe 等(2002)研究類黃酮物化合物對人類 5-LOX 代謝化生四烯酸的影 響,發現 5-HETE 的產生被表兒茶素(—)-epicatechin 所抑制,並且隨著表兒 茶素濃度的提高,抑制生成的效果越佳,IC50約為 22 µmol/L,表兒茶素也

(38)

抑制了雙氧酶(dioxygenase)和 LTA4和 5-LOX 的活性,顯示表兒茶素可以在 5-LOX 將花生四烯酸轉化成其他各種造成發炎的白三烯素前,就能夠先結 合 5-LOX 上的活性部位,使反應不會繼續(Schewe and others 2002)。

附圖七、脂氧合酶抑制劑

(39)

參 參

參 參、 、 、 、實驗架構 實驗架構 實驗架構 實驗架構

(40)

肆 肆 肆

肆、 、 、 、材料方法 材料方法 材料方法 材料方法

一 一 一

一、、、、材料材料材料材料:::

取自於金門縣野生之委陵菜(Potentilla Chinensis),由金門技術學院協助 採收,經過清洗曬乾後,分成根及莖葉分別密封保存寄送至實驗室,根約 15─20 cm 左右,莖葉則約 5─12 cm

二 二 二

二、、、、實驗藥品實驗藥品實驗藥品實驗藥品:::

乙酸乙酯、乙醇、甲醇、丙酮、正己烷、三氯醋酸、氯磺酸、二氯甲 烷、三氯乙酸、硫酸、亞麻油酸、AeCN、FeCl2、 Tris-HCl 、Tween 20、

nordihydroguaiaretic acid (NDGA) 、 15- lipoxygenase from soybeen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 、 HCl 、 Gallic acid 、 Quercetin 、 DPPH(α, α-diphenyl-β-picrylhydrazyl, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A.)、silica gel G60 (40- 60

µm, 230-400 mesh; Silia Flash, Silicycle,

U.S.A.)。Quercetin (Sigma)、Vanillic acid、p-Coumaric acid、Ferulic acid、

Sinapic acid、AlCl3‧6H2O、Folin-Ciocalteu’s phenol reagent (Sigma)、Ursolic acid、Oleanolic acid。

三 三 三

三、、、、實驗器材實驗器材實驗器材實驗器材:::

1、快速粉碎機 (FRITSCH PU14, GERMANY) 2、恆溫震盪機 (友榆科技公司。台北)

3、超音波洗滌機 (Bransonic 3510R-DTH, U.S.A.)

(41)

5、真空凍結乾燥機 (TLSHIN LAB CO LTD, KOREA) 6、減壓濃縮機 (BUCHI-WaterbathB-480, Sweden) 7、真空烘箱(CHANNEL V40 U.S.A.)

8、ELISA (BioTek® Instruments, Inc. U.S.A.)

9、高效能液相層析儀 pump : (Model SIL-10ADVP, Shimadzu, Japan)

DAD : Diode array detector (Model SPD-M10Avp, Shimadzu, Japan) 10、紫外燈(Model CC-10, wavelength 254 nm and 366nm, Raytech

Industries, Inc., Upland, CA, U.S.A)

11、薄層層析片 silica gel(60 F254 5 cm x 7.5 cm, Merck, Germany) 四

四 四

四、、、、實驗方法實驗方法實驗方法實驗方法:::

1、

、、、委陵菜委陵菜委陵菜委陵菜乙醇乙醇乙醇萃取物製備乙醇萃取物製備萃取物製備 萃取物製備

委陵菜樣品的莖葉先以磨碎機磨碎;根則先用刀切成小塊後,再以磨 碎機磨碎,分次秤取根或莖葉粉末 20 g 加入乙醇 400 mL 中,經震盪機在室 溫(25 ℃)搖晃 8~10 小時萃取乙醇可溶物,立即進行抽氣過慮,收集濾液後,

殘渣部份再加入 400 mL 乙醇以同樣條件進行二次萃取,之後再進行抽氣過 濾,合併兩次萃取液以減壓濃縮去除溶劑,使萃取液成漿狀後,再利用真 空烘箱將樣品完全去除溶劑,形成莖葉的乙醇萃取物(PCLE)或根的乙醇萃 取物(PCRE)秤重後放入樣品瓶中,於-18 ℃保存,並計算萃取物產率。

2、

、、、極性劃分極性劃分極性劃分極性劃分(partition)

秤取 5 g 的委陵菜根或莖葉之乙醇萃取物(PCRE、PCLE)倒入分液漏斗

(42)

中,先加入乙酸乙酯 300 mL 充分混合委陵菜根或莖葉之乙醇萃取物,再加 入 300 mL 的 RO 水,劇烈震盪分液漏斗數分鐘後靜置。待分層後上層為乙 酸乙酯層,下層為水層。將乙酸乙酯層取出,再加入 300 mL 的乙酸乙酯於 分液漏斗中劇烈震盪數分鐘後,各別收集乙酸乙酯層和水層,合併兩次的 乙酸乙酯層。水層部分利用凍亁機凍亁,乾燥粉末為水區分物(PCLE-H2O,

PCRE- H2O),而乙酸乙酯層減壓濃縮至亁,並放入真空烘箱將溶劑完全去

除,形成粉狀的乙酸乙酯區分物(PCLE-EA, PCRE-EA),秤重後裝入樣品瓶 保存在-18 ℃中並計算回收率。

3.Silica gel 管柱層析

管柱層析管柱層析管柱層析

3.1.PCRE-EA 或

或或或 PCLE-EA Silica gel 管柱層析管柱層析管柱層析管柱層析

兩種樣品分別為 PCLE-EA 及 PCRE-EA。秤取 9 g 的 PCLE-EA 或 PCRE-EA 以甲醇 1:10 (w/v)回溶後,加入與樣品等重的 silica gel 攪拌均勻 形成懸浮的膠體溶液,以減壓濃縮去除甲醇成粉末狀,使 silica gel 吸附樣 品。管柱充填:以 314 g silica gel 加入 2.5 倍(w/v)的起始溶劑(Hexane)混合 成泥狀,緩慢的倒入玻璃管柱(Ø5.0 cm × 40 cm)中,到入矽膠同時拍打管 壁,使 silica gel 沉降堆疊的更均勻,形成矽膠管柱。將吸附樣品的 silica gel 粉末平鋪在管柱上方並且在樣品層上再覆蓋約 0.1 cm 乾淨的 silica gel 後,

依溶劑的極性從小到大進行沖提。以 Hexane、Dichloromethane、Ethyl Acetate、Acetone、Methanol 和 H2O 等六種溶劑各 2100 mL 依序進行沖提,

(43)

沖提液每 2100 mL 為一區分物共收集六個區分物。即 PCRE-EA-Hex、

PCRE-EA-EA 、 PCRE-EA-Di 、 PCRE-EA-Acetone 、 PCRE-EA-MeOH 、 PCRE-EA-H2O 或 是 PCLE-EA-Hex 、 PCLE-EA-EA 、 PCLE-EA-Di 、 PCLE-EA-Acetone、PCLE-EA- MeOH、PCLE-EA-H2O 將所有區分物以減壓 濃縮去除溶劑後,秤重裝入樣品瓶中保存在-18 ℃中,並計算回收率。

3.2.PCRE-EA-Acetone 管柱層析

管柱層析管柱層析管柱層析

PCRE-EA-Acetone 秤取 2 g 後以甲醇溶解樣品,經上述製備樣品的方法 使 silica gel 與樣品吸附。製備矽膠管柱以 40 g 的 silica gel 經上述充填管 柱之方法,充填於玻璃管柱(Ø2.2 cm × 29 cm)中。將吸附樣品的 silica gel 粉末平鋪在管柱上方並且在樣品層上再覆蓋約 0.1 cm 乾淨的 silica gel,即 為 PCRE-EA-Acetone 的製備管柱。同樣由極性小到大的溶劑分別各以 300 mL 進行沖提。起始溶劑的選擇,是將 PCRE-EA-Acetone 點在 TLC 片上,

分別測定不同極性的展開溶劑系統,展開後選擇 Rf值在 1/3 左右的溶劑作 為起始溶劑,測試結果 Ethyl Acetate 展開後的 Rf 值約為 1/3,即以 Ethyl Acetate 為起始溶劑。依序提高沖提溶劑的極性進行沖提,即以 Ethyl Acetate、Ethyl Acetate : Acetone = 2 : 1、Ethyl Acetate : Acetone = 1 : 1、

Acetone、Methanol 和 H2O 等六種溶劑各 300 mL 進行沖提。沖提液以試管 收集,每支試管收集 10 mL,共收集 180 支試管。以 TLC 判別各試管中區 分物的 Rf值,將有相同 Rf值的試管合併成為一個區分物,共分 11 個區分

(44)

物,即 PCRE-EA-Acetone-A─K。將區分物減壓濃縮去除溶劑後,秤重裝入 樣品瓶中,保存在-18 ℃,並計算回收率。

4.區分物

區分物區分物 TLC 分析區分物 分析分析分析

以 silica gel(60 F254 5 cm x 7.5 cm)薄層層析 (Thin layer chromatography, TLC) 片進行區分物的鑑定。在 TLC 下緣 1.5 cm 處及上端 1.5 cm 處,以 鉛筆畫一水平直線,進行萃取物初步鑑定。以管口平整之毛細管(內徑約 0.5 mm)吸取樣品液,輕點於線上同一點,待亁後,將 TLC 片垂直放入含 有展開液的密閉容器中,TLC 下端直線離液面約 0.5 cm,當展開至上方直 線處時,將 TLC 片從展開槽中取出,並於抽氣櫃中乾燥,以紫外燈觀察斑 點的螢光位置,並且計算斑點的 Rf值。

5.皂苷

皂苷皂苷呈色反應皂苷呈色反應呈色反應 呈色反應

5.1.Liberman 顏色反應

顏色反應顏色反應 顏色反應

參照 Farnsworth (1966) 之方法,在試管中放入濃度 1 mg/mL 的萃取物 1 mL 加入 1 mL 的乙酸酐溶解後,沿試管壁緩緩以滴加方式加入 0.2 mL 的 濃硫酸,試管保持靜置狀態,使兩種溶液介面澄清,觀察兩層液中間出現 環狀的顏色,進行萃取物初步鑑定。兩溶劑界面呈藍色或藍綠色表示含有 甾體皂苷;呈紅色、粉紅色或紫色,則為含有三萜類皂苷。

5.2.TLC 的呈色反應

的呈色反應的呈色反應的呈色反應

委陵菜之區分物經薄層層析,烘乾之後,分別噴灑下列呈色劑。皂苷

(45)

類常用的顯色劑有濃硫酸或氯磺酸─乙酸 1 : 2 (v/v)等(Seikel, 1964;Pratt and Miller, 1984)

5.2.1.氯磺酸

氯磺酸氯磺酸氯磺酸─乙酸乙酸乙酸乙酸

參照 Mastumoto (1963) 之方法,先將區分物樣品以甲醇回溶,每次取 約 5

µL 緩慢的點在 TLC 片上,使用展開劑 Hexane:ethyl acetate = 7 : 3 展

開後,再噴上氯磺酸─乙酸 1 : 2 (v/v)試劑後,在 130℃熱 5 分鐘後,在可見 光下觀察 TLC 片上斑點的顏色,若出現天藍、紫、粉紅、淡棕則表示樣中 具有不同種類的皂苷。

5.2.2.濃硫酸

濃硫酸濃硫酸濃硫酸溶液溶液溶液溶液:::

以上述展開溶劑展開後的 TLC 片,均勻噴灑濃硫酸後,在 70℃加熱 10 分鐘,在可見光下觀察 TLC 片上斑點的顏色,顯示橙色、紅紫、紅褐色、

紫色、黃色或淡棕色,則表示樣品中具有三萜類結構的皂苷化合物。

6.總多分測定方法

總多分測定方法總多分測定方法 總多分測定方法

參考 Christel 等(2000)之方法,將樣品 PCRE-EA-Acetone-A─K 以甲醇 配製成適當濃度後,在試管中放入樣品溶液 0.1 mL,以 RO 水稀釋 10 倍的 Folin-Ciocaltou 試劑 0.5 mL,混合後靜置 5 分鐘,再加入 0.7 M 的 Na2CO3

溶液 0.4 mL,混和均勻後再靜置 45 分鐘,最後在波長 675 nm 下測定吸光 值,使用 gallic acid 作為標準檢量線,以內插法來判斷樣品中總多酚的含量。

空白:0.1 mL 甲醇 + 0.5 mL Folin + 0.4 mL Na2CO3

(46)

樣品:0.1 mL 樣品 + 0.5 mL Folin + 0.4 mL Na2CO3

標準曲線:0.1 mL gallic acid + 0.5 mL Folin + 0.4 mL Na2CO3

7.總類黃酮測定方法

總類黃酮測定方法總類黃酮測定方法 總類黃酮測定方法

參考 Christel 等(2000)之方法,取適當濃度 PCRE-EA-Acetone-A─K 甲 醇溶液 1 mL,加入 2% methanolic AlCl3‧6H2O 水溶液 1 mL,在室溫下靜 置 10 分鐘後,在波長 430 nm 下測定吸光值。以 Quercetin (Sigma)製做標準 檢量線,並以內插法求取樣品中的總類黃酮含量。

8. HPLC 分析

分析分析分析

8.1 HPLC 皂苷分析

皂苷分析皂苷分析皂苷分析法法法

參考 Wan 等 (2006) 及 Apers 等(1998)HPLC 分析三萜類皂苷的方法,

利用 HPLC 分析。管柱為 Lichocart® 100 PR-18e C18 (250 mm × 4 mm, 5 µm particles, Merck, Germany),移動相的 A 液為水含 0.05% TFA 、B 液為氰甲 烷含 0.05% TFA 進行梯度的分析,移動相流速為 1 mL/min。梯度程式為 0─20 min B 液從 10%提升至 18%,20─40 min B 液從 18%提升至 19%,40─60 min B 液從 19%提升至 55%, 最後 B 液再降回 10%平衡 10 min,經過梯度沖提 之後,連結 DAD 偵測器在 203、205、210 nm 等波長下進行三萜類皂苷的 分析。

8.2 酚酸分析方法

酚酸分析方法酚酸分析方法酚酸分析方法

參考Mattila and Hellstrom (2007)的HPLC酚酸分析方法,分析委陵菜中

(47)

所含有酚類物質。使用HPLC分析,管柱為Lichocart® 100 PR-18e C18 (250 mm × 4 mm, 5 µm particles, Merck, Germany),偵測器DAD波長設定在254 nm、280 nm、329 nm、移動相A液為50 mM的H3PO4水溶液,並且以KOH 調整pH值到2.5。B液為Acetonitrile,移動相經過震盪脫氣後,以梯度模式 進行酚酸的分析,流速為0.7 mL / min。起始梯度為95%的A液、0─5分鐘將 A液由95%降至85%、5─17分鐘將A液由85%降至80%、17─40分鐘將A液由 80%降至50%、40─60分鐘時將A液保持在50%、60─65分鐘時將A液由50%

升至95%結束整個分析過程,最後讓機器平衡六分鐘後,再注進行射下一個 樣品。

8.3 烏蘇酸

烏蘇酸烏蘇酸烏蘇酸、、、齊墩果酸分析方法、齊墩果酸分析方法齊墩果酸分析方法 齊墩果酸分析方法

參考 Liang 等(2007)的方法,以 HPLC 連接管柱為 Lichocart® 100 PR-18e C18 (250 mm × 4 mm, 5 µm particles, Merck, Germany),移動相為甲醇:水 為 83:17,並且添加 0.2%的醋酸氨,以 0.1N HCl 調整 pH 值到 6.74。再以 0.22 µm 膜過濾後,震盪脫氣 30 min。偵測器為波長設定為 210 nm,流速 為 1 mL / min,分析時間約為 40 分鐘,比對烏蘇酸齊墩果酸等標準品的滯 留時間,分析 PCRE-EA-Acetone-B 中是否含有三萜類物質烏蘇酸、齊墩果 酸及其含量。

9.清除

清除清除 DPPH 自由基能力清除 自由基能力自由基能力自由基能力的的的測定的測定測定 測定

參考 shimada 等(1998)的方法,並修飾之。秤取 10 mg 委陵菜之萃取物

(48)

或區分物,加入 10 mL 甲醇溶液配置成 1 mg / mL 為原液,再以甲醇進行 分別稀釋成 2、4、10、20、40、50、100 倍,取稀釋液 0.4 mL 分別加入已 配製好的 0.1 mM DPPH 甲醇溶液 2 mL 混和均勻,反應 10 分鐘。在 517nm 的波長下測定其吸光值。另取 0.4 mL 的樣品加入 2 mL 的甲醇做 sample

blank。

DPPH scavenging efficiency (%) 1 × 100 %

 

 − −

= B

C A

A

:樣品在波長

517nm

的吸光值

B

:控制組在波長

517nm

的吸光值

C

:樣品未混合

DPPH

在波長

517 nm

的吸光值

10. 抑制

抑制抑制脂氧合酶抑制脂氧合酶脂氧合酶(lipoxygenase;脂氧合酶 ;;;LOX)活性之測定活性之測定活性之測定 活性之測定

參考

Kondo

(1994)

之方法,測定委陵菜根及莖葉乙醇萃取物、區分

物抑制

LOX

活性。黃豆

15-

脂氧合酶

(lipoxygenase, LOX)

溶於

0.05 M Tris-HCl

緩衝液

(pH 9.0,

0.04% Tween 20)

於試管中備用,活性為

4.6 U/mL

。各取

0.1 mL Tris-HCl

緩衝溶液、

LOX 0.1 mL

及適當濃度之樣品溶 液和

100 mM linoleic acid 40 µ L

混合均勻後,立即以分光光度計測定波長

234 nm

的吸光值變化。每

30

秒測定一次吸光值,測定時間為

3

分鐘。以脂

氧合酶抑制劑

nordihydroguaiaretic acid (NDGA)

為正對照組,以

0.1 mL

Tris-HCl

緩衝溶液取代樣品溶液為控制組,依下列公式計算抑制率

(%)

% 100 1

(%) effect

Inhibitory ×

 

 −

= B

A

A

:試樣組在波長

234 nm

下,第三分鐘與第零分鐘吸光值的差。

:控制組在波長 下,第三分鐘與第零分鐘吸光值的差。

(49)

伍 伍 伍

伍、 、 、 、結果與討論 結果與討論 結果與討論 結果與討論

一 一 一

一、、、、 委陵菜根和委陵菜根和委陵菜根和委陵菜根和莖葉莖葉莖葉莖葉乙醇萃取物的抗氧化活性乙醇萃取物的抗氧化活性乙醇萃取物的抗氧化活性乙醇萃取物的抗氧化活性

委陵菜根及莖葉的乙醇萃取物分別是 PCRE 和 PCLE,萃取率約為 9.1%

和 8.7%,分別測定委陵菜根及莖葉的乙醇萃取物清除 DPPH 自由基的能 力,結果如圖一。清除能力隨著乙醇萃取物的濃度增加而上升,且 PCRE 清除能力較強,PCRE 的 DPPH 半清除有效濃度( EC50 )約為 21.82 µg/mL,

PCLE 的 EC50約為 56.11

µg/mL。另外,PCRE 在 20 µg/mL 清除率約為

48.2%、相同濃度時 PCLE 的清除率約為 18.5%、Trolox 的清除率約為 68.3%,PCRE 的清除率可達 Trolox 的 70%。

除了評估清除 DPPH 的能力外,也評估 PCRE 和 PCLE 抑制脂氧合酶 (lipoxygenase;LOX)的能力,如圖二。脂氧合酶活性的抑制效果隨著 PCRE 和 PCLE 的濃度增加而提升,濃度為 10 ─ 100 µg/mL 時呈直線上升,濃度 超過 100 µg/mL 時則呈現曲線緩慢上升的情況,PCRE 的脂氧合酶半抑制濃 度(IC50)約為 44.26 µg/mL,PCLE 的 IC50約為 98.89 µg/mL,PCRE 的抑制效 果較 PCLE 強。由圖一及圖二的結果顯示在清除自由基及抑制 LOX 的能 力,都以 PCRE 較 PCLE 的效果強。根據清除自由基及抑制 LOX 能力的結 果,民間以委陵菜全株或根泡酒飲用治療關節炎,可能以根泡酒飲用效果 較佳。

(50)

二 二 二

二、、、、 委陵菜根和委陵菜根和委陵菜根和委陵菜根和莖葉莖葉莖葉莖葉乙醇萃取物極性劃分區分物的抗氧化活性乙醇萃取物極性劃分區分物的抗氧化活性乙醇萃取物極性劃分區分物的抗氧化活性乙醇萃取物極性劃分區分物的抗氧化活性

將 PCRE 和 PCLE 以 EA:H2O = 1:1 極性劃分,得到 PCRE-EA、PCRE- H2O、PCLE-EA、PCLE-H2O 四種區分物,各區分物清除 DPPH 自由基能力 如圖三,在濃度 50

µg/mL 時,清除 DPPH 自由基的效果為 PCRE-H

2O >

PCRE-EA > PCLE-EA >> PCLE-H2O。PCRE-H2O、PCRE-EA、PCLE-EA 區 分物清除 DPPH 自由基能力皆隨著濃度的增加而上升,PCLE-H2O 清除 DPPH 自由基能力則沒有明顯的濃度效應,各區分物中清除 DPPH 自由基的 效果如表一。以 PCRE-H2O 最強 EC50為 33.15

µg/mL PCRE-EA 次之 EC

50

為 39.47 µg/mL,PCLE-EA 的 EC50為 55.48 µg/mL,PCLE-H2O 區分物,在 已測定的濃度 100 µg/mL 只達到 27.55%。PCLE 經過極性劃分後,PCLE-EA 及 PCLE-H2O 清除 DPPH 自由基的效果均較 PCLE 差,顯示部分純化有效 物質並未提高清除 DPPH 自由基的效果,推測 PCLE 中清除 DPPH 自由基 的有效成分,包含極性及非極性物質,且這兩種區分物中的有效成分,對 清除 DPPH 自由基有協同的加乘效果,經過部分純化後失去加乘作用,使 清除 DPPH 自由基效果較差。

另外,PCRE-EA、PCRE-H2O、PCLE-EA、PCLE-H2O 抑制 LOX 能力 如圖四。在濃度 25 µg/mL 時,抑制 LOX 的能力為 PCRE-EA > PCRE-H2O >

PCLE-EA >> PCRE-H2O。PCRE-EA、PCRE-H2O、PCLE-EA 區分物抑制 LOX 的能力皆隨著濃度增加而上升。PCLE-H2O 區分物抑制 LOX 能力則沒有明

(51)

顯的濃度效應。PCLE-EA 在濃度高於 25 µg/mL 抑制 LOX 能力增加趨勢趨 緩;PCRE-EA 及 PCRE- H2O 在濃度高於 50 µg/mL 時,抑制 LOX 能力增加 趨勢較為緩慢。四個區分物抑制 LOX 能力的 IC50如表一,以 PCRE-EA 的 能力最強 IC50 約為 13.39 µg/mL;PCRE-H2O 次之 IC50 為 20.58 µg/mL;

PCLE-EA 的 IC50 約為 98.71

µg/mL,而 PCLE-H

2O 最差,即使濃度達 200

µg/mL 時,抑制率僅為 24.32%。經過極性劃分後的 PCLE-EA 和 PCRE-EA,

抑制 LOX 的能力都較劃分前的萃取物強。顯示 PCLE 和 PCRE 經過極性劃 分後,抑制 LOX 的有效成分會集中在 EA 區分物中,屬於較非極性的物質,

部分純化抑制 LOX 的有效物質,使區分物的半抑制濃度更低。繼續以 PCLE-EA 及 PCRE-EA 進行管柱層析,分離抑制 LOX 及清除 DPPH 自由基 的有效成分。另外 PCRE-H2O 抑制 LOX 的 IC50為 20.58 µg/mL,只略低於 PCRE-EA 的 IC50 13.39 µg/mL,推測 PCRE-H2O 亦含有抑制 LOX 的其他較 極性化合物,也值得進一步分離鑑定,唯因回收率較低,本研究未以分離 此區分物的有效物質。

三 三 三

三、、、、 PCLE-EA 管柱層析之管柱層析之管柱層析之管柱層析之區分物的抗氧化活性區分物的抗氧化活性區分物的抗氧化活性區分物的抗氧化活性

將 PCLE-EA 利用 silica gel 管柱(Ø5.0 cm × 40 cm),以 Hexane、Ethyl Acetate、Dichloromethane、Acetone、Methanol、H2O 六種溶劑沖提得到之 區分物為 PCLE-EA-Hex、PCLE-EA-EA、PCLE-EA-Di、PCLE-EA-Acetone、

PCLE-EA-MeOH、PCLE-EA-H2O,其產率如表二。回收率以 PCLE-EA-EA

數據

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參考文獻

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