48.2%、相同濃度時 PCLE 的清除率約為 18.5%、Trolox 的清除率約為 68.3%，PCRE 的清除率可達 Trolox 的 70%。
二
PCRE-EA > PCLE-EA >> PCLE-H2O。PCRE-H2O、PCRE-EA、PCLE-EA 區 分物清除 DPPH 自由基能力皆隨著濃度的增加而上升，PCLE-H2O 清除 DPPH 自由基能力則沒有明顯的濃度效應，各區分物中清除 DPPH 自由基的 效果如表一。以 PCRE-H2O 最強 EC50為 33.15
µg/mL PCRE-EA 次之 EC
50為 39.47 µg/mL，PCLE-EA 的 EC50為 55.48 µg/mL，PCLE-H2O 區分物，在 已測定的濃度 100 µg/mL 只達到 27.55%。PCLE 經過極性劃分後，PCLE-EA 及 PCLE-H2O 清除 DPPH 自由基的效果均較 PCLE 差，顯示部分純化有效 物質並未提高清除 DPPH 自由基的效果，推測 PCLE 中清除 DPPH 自由基 的有效成分，包含極性及非極性物質，且這兩種區分物中的有效成分，對 清除 DPPH 自由基有協同的加乘效果，經過部分純化後失去加乘作用，使 清除 DPPH 自由基效果較差。
另外，PCRE-EA、PCRE-H2O、PCLE-EA、PCLE-H2O 抑制 LOX 能力 如圖四。在濃度 25 µg/mL 時，抑制 LOX 的能力為 PCRE-EA > PCRE-H2O >
PCLE-EA >> PCRE-H2O。PCRE-EA、PCRE-H2O、PCLE-EA 區分物抑制 LOX 的能力皆隨著濃度增加而上升。PCLE-H2O 區分物抑制 LOX 能力則沒有明
顯的濃度效應。PCLE-EA 在濃度高於 25 µg/mL 抑制 LOX 能力增加趨勢趨 緩；PCRE-EA 及 PCRE- H2O 在濃度高於 50 µg/mL 時，抑制 LOX 能力增加 趨勢較為緩慢。四個區分物抑制 LOX 能力的 IC50如表一，以 PCRE-EA 的 能力最強 IC50 約為 13.39 µg/mL；PCRE-H2O 次之 IC50 為 20.58 µg/mL；
PCLE-EA 的 IC50 約為 98.71
µg/mL，而 PCLE-H
2O 最差，即使濃度達 200µg/mL 時，抑制率僅為 24.32%。經過極性劃分後的 PCLE-EA 和 PCRE-EA，
抑制 LOX 的能力都較劃分前的萃取物強。顯示 PCLE 和 PCRE 經過極性劃 Acetate、Dichloromethane、Acetone、Methanol、H2O 六種溶劑沖提得到之 區分物為 PCLE-EA-Hex、PCLE-EA-EA、PCLE-EA-Di、PCLE-EA-Acetone、
PCLE-EA-MeOH、PCLE-EA-H2O，其產率如表二。回收率以 PCLE-EA-EA
最高，約佔 48%、PCLE-EA-Acetone 次之約佔 32%、Hex、H2O、MeOH、
DI 分別為 11%、8%、4%、1%。比較這六個區分物清除 DPPH 自由基的能 力，如圖五。隨著區分物濃度的提高 EA、Acetone、MeOH 區分物清除 DPPH 自由基的能力也跟著提高，Acetone 及 MeOH 區分物效果最強，明顯優於其 他區分物。而 Hex、DI、H2O 區分物清除 DPPH 自由基能力並沒有明顯的 濃度效應，在濃度 50 µg/mL 時清除 DPPH 自由基能力 PCLE-EA-Acetone >
PCLE-EA-MeOH >> PCLE-EA-EA > PCLE-EA-H2O > PCLE-EA-Hex >
PCLE-EA-Di，顯示經過管柱層析後清除 DPPH 自由基的有效成分集中在 Acetone 和 MeOH 區分物中。PCLE-EA-Acetone 清除自由基的 EC50約為 52.66
µg/mL，效果略優於 PCLE-EA。PCLE-EA-MeOH 次之，EC
50 約為 70.22µg/mL ， 其 他 區 分 物 PCLE-EA-Hex 、 PCLE-EA-EA 、 PCLE-EA-DI 、
PCLE-EA-H2O 清除 DPPH 自由基的能力明顯的低於這兩個區分物，即使在 濃度達 200 µg/mL 時，清除 DPPH 自由基的能力仍低於 30%。
另外，各區分物在不同濃度下抑制 LOX 的效果，如圖六。各區分物隨 著濃度的提高抑制 LOX 的效果也越強，其中以 PCLE-EA-Acetone 和 PCLE-EA-MeOH 這兩個區分物的效果較強，PCLE-EA-Hex、PCLE-EA-EA、
PCLE-EA-H2O 這三個區分物，抑制 LOX 的能力較差幾乎沒有濃度依存性。
在濃度 50 µg/mL 時抑制 LOX 的能力 PCLE-EA-Acetone > PCLE-EA-MeOH
>> PCLE-EA-EA > PCLE-EA-Hex > PCLE-EA-H2O。PCLE-EA-Acetone 和
µg/mL 和 43.62 µg/mL(表二)。
PCLE-EA-Di 無 法 測 出 抑 制 LOX 的 活 性 ， 顯 示 經 過 管 柱 層 析 後 Dichloromethane 所 沖 提 出 的 區 分 物 不 含 抑 制 LOX 的 有 效 成 分 ， PCLE-EA-Acetone 和 PCLE-EA-MeOH 這兩個區分物其抑制 LOX 效果優於 PCLE、PCLE-EA，顯示經過管柱層析的步驟，可將具有抑制 LOX 的有效 PCRE-EA-Aceton 的回收率最高。各區分物清除 DPPH 自由基的能力如圖 七。隨著樣品濃度提高，清除 DPPH 自由基的效果越佳，濃度與清除效果 呈現正相關。各區分物中清除效果最強的兩個區分物為 PCRE-EA-Acetone 和 PCRE-EA-EA ， 在 濃 度 50
µg/mL 時 清 除 DPPH 自 由 基 效 果 以
PCRE-EA-EA > PCRE-EA-Acetone >> PCRE-EA-MeOH >> PCRE-EA-H2O>> PCRE-EA-Hex。PCRE-EA-Acetone 清除 DPPH 的 EC50約為 38.02 µg/mL、
PCRE-EA-EA 的 EC50 約為 30.64 µg/mL。PCRE-EA-Di 區分物則無法測出清 除自由基的能力，而 Hex 區分物在濃度達到 200 µg/mL 清除率也只有 5%。
觀察其他區分物發現 PCRE-EA-MeOH 區分物在濃度達 50
µg/mL 清除
DPPH 的清除率上升趨勢漸緩，但是當濃度達 200 µg/mL 時清除 DPPH 自由基 的 能 力 與 Acetone 和 EA 區 分 物 沒 有 差 異 ， 顯 示 較 高 濃 度 時 PCRE-EA-MeOH 也具有良好的清除 DPPH 自由基的效果。Acetone 和 EA 區分物在 100 µg/mL 和 200 µg/mL 的 DPPH 自由基清除能力沒有顯著差異，
與濃度的依存性也不明顯，顯示即使濃度再繼續增加清除 DPPH 自由基的 效果也不會有顯著的上升。另外將 PCRE-EA-Acetone 與 PCRE 及 PCRE-EA 比較清除 DPPH 自由基能力，發現經過管柱層析後的 PCRE-EA-Acetone 清 除 DPPH 自由基的 EC50略低於 PCRE-EA。
比較各區分物在不同濃度下抑制 LOX 的效果，隨著濃度提高，各區分 物抑制 LOX 的效果也越強，濃度與抑制效果呈現正相關(圖八)。在濃度 1
µg/mL 時 抑 制 LOX 效 果 以 PCRE-EA-Acetone > PCRE-EA-EA >
PCRE-EA-MeOH > PCRE-EA-H2O > PCRE-EA-Hex。PCRE-EA-Acetone 抑 制 LOX 效果最強在 1 µg/mL 時其抑制可達到 54%左右。PCRE-EA-Di 區分 物無法測出抑制 LOX 活性的能力，顯示經過管柱層析後 Dichloromethane 所沖提出的區分物不含抑制 LOX 的有效成分，結果與 PCLE-EA-Di 相同。
比較 PCRE-EA-Acetone、PCLE-EA-Acetone 與 PCRE 和 PCRE-EA 抑制 LOX 的效果，發現 PCRE-EA-Acetone 抑制 LOX 能力最強，且經過管柱區分後 IC50明顯降低許多。推測抑制 LOX 活性的有效成分，經過管柱層析後區分 至 PCRE-EA-Acetone。因此將繼續以 PCRE-EA-Acetone 進行管柱層析，分 離抑制 LOX 及清除 DPPH 的有效成分。
五
其中 B、C、D、E、G、H、I 等七層回收率較高，分別為 9.6%、13.5%、10.9%、
15.9%、10.0%、8.4%、19.1%。測定各區分物清除 DPPH 自由基的能力，如 強。將 PCRE-EA-Acetone-B 與 PCRE-EA-Acetone 比較清除 DPPH 自由基的 能力如表五。發現 PCRE-EA-Acetone-B 效果更強，與清除 DPPH 自由基正 對照組 Trolox 作比較，在低濃度 6.25
µg/mL 時其效果已經達到正對照組
Trolox 的 1/2 倍 ， 比 較 PCRE-EA-Acetone-B 、 一 條 根 乙 醇 萃 取 物 和 SDR-E-EA(S)-V-A 的抗氧化活性(附表一)，抑制 LOX 和清除 DPPH 自由基 的效果，都是 PCRE-EA-Acetone-B 最強，可以確定 PCRE-EA-Acetone-B 的 確含有清除 DPPH 自由基有效物質。PCRE-EA-Acetone 管 柱 層 析 區 分 物 抑 制 LOX 的 能 力 如 圖 十 。 PCRE-EA-Acetone 管柱層析區分物以 A、B、C、G、H 區分物抑制 LOX 的 效果較強，隨著樣品濃度上升抑制 LOX 活性的能力也越強，濃度跟抑制能 力呈現正相關，在濃度 10
µg/mL 時抑制率都在 80%左右，甚至在濃度 1 µg/mL 也可達到 50%左右，PCRE-EA-Acetone 管柱層析區分物抑制 LOX
的 IC50如表五。A、B、C、G、H 抑制 LOX 的 IC50分別為 1.39、0.90、0.94、
1.04、0.97 µg/mL，抑制 LOX 效果以 B > C > H > G > A。比較 A、B、C、
G、H 與 LOX 抑制劑 NDGA 如圖十二。NDGA 的抑制效果較 A、B、C、G、
H 等區分物更為顯著，A、B、C、G、H 等區分物抑制 LOX 的 IC50約為 NDGA 的 1/4 左右。另對照金門一條根乙醇萃取物及 SDR-E-EA(S)-V-A 的抑制 LOX IC50(附表一)，發現 PCRE-EA-Acetone-B 的抑制 LOX IC50低於其他兩種天 然物的區分物，顯示從 PCRE 中分離的 PCRE-EA-Acetone-B 抑制 LOX 的效 果較強，且對照 PCRE、PCRE-EA 的抑制 LOX IC50可觀察出抑制 LOX 的 成 分 的 確 有 經 過 管 柱 層 析 而 純 化 ， 顯 示 委 陵 菜 中 分 離 出 的 區 分 物 PCRE-EA-Acetone-B 具有開發成 LOX 抑制劑的價值。
附表一、比較不同天然物萃取物抑制 LOX 的 IC50
Fractions LOX IC50 DPPH EC50
PCRE-EA-Acetone-B 0.90 µg/mL 16.63 µg/mL 一條根乙醇萃取物 16.05 µg/mL 18.4 µg/mL SDR-E-EA(S)-V-A 8.94 µg/mL 291.83 µg/mL
*SDR-E-EA(S)-V-A = 高梁酒糟乙醇萃取物乙酸乙脂固態層區分物 V 的區分物 A。
六 六 六
六、、、、 PCRE-EA-Acetone 管柱層析區分物總多酚含量管柱層析區分物總多酚含量管柱層析區分物總多酚含量 管柱層析區分物總多酚含量
PCRE-EA-Acetone 管柱層析區分物中，總多酚含量如表六，以 gallic acid 作為多酚化合物含量的標準曲線(圖十三)，發現總多酚的含量以 B、C、E、 對來的低。推測 PCRE-EA-Acetone-A─K 中具有清除 DPPH 自由基能力及抑 制 LOX 活性的主要活性成分並不是來自於類黃酮類的物質，因此，將更進 一步以其他方法來鑑定化合物種類。
八 八 八
八、、、、 皂苷成分鑑定皂苷成分鑑定皂苷成分鑑定皂苷成分鑑定
參照 Farnsworth (1966) 之方法，對 PCRE、PCLE 及其極性劃分、管柱 層析後的各區分物進行乙酸酐呈色試驗，結果如表七。觀察結果可發現，
PCRE 和 PCLE 及其區分物所呈現的顏色多為紅色，表示萃取物中可能含皂 苷且為三萜類皂苷。但 Wall 等(1954)提出用 Liberman 法，若分析物含類胡 蘿蔔素和莖葉黃素，則在此試驗中也會出現紅色或是藍綠色的變化，容易 出現偽陽性的結果。參考 Tomczyk and Latte (2009)整理的委陵菜研究文獻 中，只有 Goncharov and Kotov (1989)研究的委陵菜屬(Potentilla argentea,
Potentilla erecta)中的地上莖、莖葉的部分含有類胡蘿蔔素。地下莖及根的
部分則沒有相關文獻指出含有類胡蘿蔔素和莖葉黃素。Goncharov and Kotov 使用的委陵菜屬植物與本實驗的 Potentilla chinensis 同屬但不同種，其結果 或為參考而已。但類胡蘿蔔素屬於脂溶性的化合物，在極性劃分後容易出 現在非極性層即 EA 層。因此，像 PCLE、PCLE-EA 等區分物雖然有紅色環 狀物質產生，但仍需要更進一步的鑑別方法。而 PCRE、PCRE-EA、PCRE-EA-Acetone、PCRE-EA-Acetone-B 等由委陵菜根中萃取分離出的區 分物，雖沒有文獻指出含有類胡蘿蔔素和莖葉黃素，仍須以其他的鑑別方 法來佐證。
九 九 九
九、、、、 薄層層析鑑定皂苷成分薄層層析鑑定皂苷成分薄層層析鑑定皂苷成分薄層層析鑑定皂苷成分
將 PCRE、PCRE-EA、PCRE-EA-Acetone、PCRE-EA-Acetone-B 等區分 物，分別點在薄層層析板上，以 Hexane：ethyl acetate = 7 : 3 v/v 為展開溶 劑系統，再分別以濃硫酸、氯磺酸：乙酸 = 1 : 2, v/v 呈色，結果如表八。
經過呈色劑濃硫酸噴灑後，所有樣品在可見光下可觀察到粉紅色的斑點，
Rf=0.90~0.92。另使用氯磺酸：乙酸 = 1 : 2 (v/v)作為呈色劑噴灑後，
PCRE-EA-Acetone-B 在 Rf值 0.92 的位置，在可見光下可以觀察到粉紅色的 斑點。若樣品中含有皂苷成分，以氯磺酸：乙酸 = 1 : 2 v/v 作為呈色劑則在 可見光會呈現天藍、紫、粉紅、淡棕等(Matsumoto 1963)，推測此粉紅色斑 點可能是呈色劑與皂苷反應的結果。再參考 Ikan 等(1964) 和 Murakami 等 (1965) 以 Hexane：ethyl acetate = 7 : 3 (v/v)為溶劑展開後，再以硫酸呈色的 結果，發現三萜類的β─香樹脂醇、烏蘇酸、齊墩果酸、油烷酸、長絲皮皂 苷元、常青藤等化合物經過硫酸呈色之後，會產生紅紫色的斑點，Rf相近，
在 0.91 ～ 0.95 之 間 ( 附 表 二 ) ， 其 中
β─ 香 樹 脂 醇 的
Rf 相 與 顏 色 和 PCRE-EA-Acetone-B 的呈色結果也相同，因此推測 PCRE-EA-Acetone-B 含 有β─香樹脂醇，或是含有三萜類皂苷結構的衍生物。附表二、三萜皂苷化合物對不同試劑的呈色反應及對應的 Rf值.
PCRE-EA-Acetone-B 為 PCRE-EA-Acetone 經 silica gel 管柱層析後，抗 氧化能力最強的區分物。由於經過總多酚試驗，發現 PCRE-EA-Acetone-B 的總多酚含量為最高，因此，參考 Mattila and Hellstrom (2007)的酚酸分析 方 法 分 析 區 分 物 PCRE-EA-Acetone-B ， 結 果 如 圖 十 六 。 可 發 現
PCRE-EA-Acetone-B 為 PCRE-EA-Acetone 經 silica gel 管柱層析後，抗 氧化能力最強的區分物。由於經過總多酚試驗，發現 PCRE-EA-Acetone-B 的總多酚含量為最高，因此，參考 Mattila and Hellstrom (2007)的酚酸分析 方 法 分 析 區 分 物 PCRE-EA-Acetone-B ， 結 果 如 圖 十 六 。 可 發 現