第四章 逢機增幅多型性核酸標誌分析實驗
第一節 材料與方法 一、植物材料：
台灣產石松科植物經本草學考察、參考文獻及標本核對，確定其學名無誤 後，取其新鮮嫩葉（或含莖及孢子囊）， 作為萃取全核酸之材料，該原生 植物列記如下：
台灣產千層塔（金不換）之原植物
1.長柄千層塔品種 A（Lycopodium serratum Thunb. var. longipetio -latum Spring）：
（a）民國 87 年 7 月 5 日於南投縣鹿谷鄉線浸採得。
（b）民國 88 年 4 月 3 日前往埔里凌霄殿採得。
（c）民國 89 年 2 月 10 日於南投縣武界採得。
（d）民國 89 年 8 月 18 日於新竹縣觀霧途中採得
（e）民國 89 年 10 月 14 日於南投縣卓社良久林場採得。
2.長柄千層塔品種 B（Lycopodium serratum Thunb. var. longipetio -latum Spring）：
（a）民國 88 年 4 月 11 日於嘉義縣阿里山採得。
（b）民國 89 年 2 月 8 日於屏東縣藤枝採得。
（c）民國 89 年 7 月 26 日於桃園縣達觀山（拉拉山）自然保護區採得。
（d）民國 89 年 10 月 14 日於南投縣卓社良久林場採得。
3.阿里山千層塔（Lycopodium serratum Thunb. var. myriophyllifo -lium Hayata）疑似物：
（a）民國 89 年 2 月 13 日於南投縣卓社採得。
（b）民國 89 年 8 月 18 日於新竹縣觀霧榛山採得。
台灣產石松之原植物
1.偽石松（L. pseudoclavatum Ching）：
（a）民國 89 年 2 月 13 日於南投縣卓社採得。
（b）民國 89 年 4 月 22 日於新竹縣尖石鄉高台山採得。
2.日本石松（L. japonicum Thunb.ex Murray）：
（a）民國 89 年 4 月 2 日於南投縣合歡山小風口採得。
（b）民國 89 年 8 月 28 日於南投縣合歡山 35~36 公里處採得。
台灣產地刷子之原植物
1.多穗石松
（L. multispicatum Wilce
）：（a） 民國 89 年 8 月 18 日於新竹縣觀霧榛山採得。
（b） 民國 89 年 8 月 18 日於新竹縣觀霧途中採得。
2.玉山地刷子（L. yueshenense Kuo）：
（a） 民國 89 年 8 月 19 日於新竹縣九九山莊採得。
（b） 民國 89 年 8 月 28 日於合歡山小風口採得。
其他台灣產石松科之原生植物
1.杉葉蔓石松（L. annotinum L.）：民國 89 年 9 月 1 日前往合歡山 35 ~36 公里處採得。
2.覆葉石松（L. carinatum Desv.）：民國 89 年 4 月 30 日於台中縣新 社安石園羅順安處取得。
3.木賊葉石松（石子藤）（L. casuarinoides Spring）：民國 89 年 10 月 14 日於卓社良久林場採得。
4.垂穗石松（筋骨草）（L. cernuum Linnaeus）：民國 88 年 4 月 11 日 於埔里凌霄殿採得。
5.銳葉石松（L. fargesii Hert.）：民國 89 年 10 月 11 日於南投縣梅 峰採得。
6.福氏石松（L. fordii Baker）：民國 89 年 3 月 25 日於 嘉義縣奮起 湖採得。
7.玉柏（L. obscurum L.）：民國 89 年 8 月 28 日往合歡山小風口採得。
8.垂枝石松（L. phlegmaria L.）：民國 89 年 4 月 3 日於霧峰百草谷 藥園林德寶處取得。
9.反捲葉石松（L. quasipolytrioides Hayata）：民國 89 年 8 月 19 日 於馬達拉溪登山口 2 公里處採得。
10.相馬氏石松（L. somae Hayata）：民國 89 年 8 月 18 日於新竹縣觀霧 榛山採得。
11.杉葉石松（L. squarrosum Forst.）：民國 89 年 9 月 10 日於埔里山 城園藝鍾鼎江處取得。
12.玉山石松（L. veitchii D. Christ）：民國 89 年 8 月 28 日於合歡山 小風口採得。
二、金不換市場品：
1. 民國 89 年 5 月 8 日於台中市健行路聯合中西藥局購買金不換市場品 1。
2. 民國 89 年 8 月 11 日於台中市成功路協隆藥行取得金不換市場品 2。
3. 民國 89 年 10 月 14 日埔里南盛街日榮中草藥行贈送金不換市場品 3，
以為基原鑑定用。
依據台灣市場品調查及外部形態鑑定結果顯示，金不換（千層塔）之來 源植物比較接近台灣產之長柄千層塔（L. serratum Thunb. var. longipetio - l a t u m S p r i n g）。 據中華本草（2 1 ） 及中盤商協隆藥行黃煥耀稱，千層塔來 源於廣西省，結果如何，有待深入研究證明之。
三、藥品與其配置：
1.液態氮
2.EB 萃取緩衝液（Extraction Buffer ,4℃）：
100 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mM Na-EDTA pH 8.0，
500 mM NaCl，10 mM beta-mercaptoethanol 預先配製好，殺菌後，於無菌條件下混勻
3.TE 緩衝液：
50 mM Tris-HCl （pH 8.0），10 mM Na-EDTA（pH 8.0）
4.20 %（W/V） SDS（溶解細胞）
5.K-solution （4℃）：
（由 3 M 醋酸鉀 60 ml、冰醋酸 11.5 ml 和
蒸餾水 28.5 ml 組成，含鉀離子 3 M 和醋酸根 5M）
6.PVP（Sigma No. P-67555）
7.異丙醇（isopropanol）
8.酚（phenol,pH 8.0）
9.三氯甲烷（CHCl3，含 4% 之 isoamyl alcohol）
10.無水酒精或 95% 酒精
11.7.5 M 醋酸銨（ammonium acetate）（4℃）
12.Beta-mercaptoethanol
13.Rnase A （10mg/ml）（-20℃）
14.TE 100~200μl（室溫）
四、儀器與器材：
1.磁研缽和杵
2.液氮分裝瓶
3.恆溫水浴槽（65℃）
4.冰桶
5.高速離心機
6.不織布（每樣品需一塊，約 10x10 cm）
7.漏斗（每樣品需 1 支）
8.微量離心機（Microfuge）
9.振盪器
10.乾燥器及抽氣機 11.離心管
（1）Oak Ridge tube ，每樣品需 2 支，管子容積為 30~50ml （2）1.5ml Eppendorf tube 每樣品需 4 支
12.微量分注器及其吸管（Repeating pipets，1 ml、100μl 和 20μl）
13.試管架（1）可放置 Oak Ridge tube 者 （2）可放置 Eppendorf tube 者 14.定時器
五、全植物核酸之萃取與純化（6 5 、8 6 - 9 0 ）
根據 D e l l a p o r t a 等人（8 6 ）所發表之 DNA 萃取方法，經局部修改後，用以 萃取所需之植物 DNA。主要修改處是在萃取過程前期加入 PVP （polyvinyl- pyrrolidone）（Sigma No.P-67555），後期加入酚洗步驟以提高 DNA 純度。
磨碎萃取
1.摘取幼嫩葉片 1 至 4 克，添加 PVP 約 1g，以液態氮磨碎後，迅速置入 Oak Ridge 離心管中。
2.加入 15 ml 之 EB 萃取緩衝液及 1 ml 20% SDS 和抗氧化劑 0.5 ml，並 用力搖晃約 50 次使之混合，再以 65℃水浴 10 分鐘。
3.加 5.0 ml 之 K-solution，並強力搖晃使之混合均勻，再冰浴20 分鐘。
4.經離心沉澱（以 12,000rpm 離心 20 分鐘）、過濾（利用不織布）後，取 出上清液置入另一個離心管中，再加入 10 ml isopropanol 於濾液中，
輕搖使之混勻，離心管靜置於-80℃、10 分鐘，以利 DNA 沉澱。
5.經離心沉澱（以 12,000 離心 15 分鐘）、過濾後，輕倒上清液（保留固 體），將離心管於室溫中倒放 10 分鐘，以晾乾 DNA。
6.加入 0.5 ml 之 TE 緩衝液後，將離心管置於振盪器上緩慢搖動使沉澱
物逐漸溶解。
酚洗（戴手套在抽氣櫥中操作）
7.待沉澱完全溶解後，將溶液小心移入 Eppendort tube 中，加入 0.5 ml 之 phenol，混勻後以 10,000rpm 離心 5 分鐘，取出上清液至另一乾淨之 Eppendort tube 中。
8.重複程序 7，但分別使用 0.25 ml phenol 和 0.25 ml chloroform、
0.5 ml chloroform，以代替 0.5 ml phenol，
酒精沉澱
9.加入 0.9ml 無水酒精及 7.5M ammonium acetate 0.15ml，輕輕搖晃使 之混合，此時應可看到白色懸浮狀之 DNA 沉澱物及小氣泡；否則，放 置於-80℃約 10 分鐘，再行檢視。
10.經離心（用 12,000rpm 15 分鐘）、沉澱後，倒掉上清液，再加入 70%酒 精 1 ml ，於室溫下靜置 1~3 分鐘，倒掉上層液，並將管子倒立瀝乾。
真空乾燥
11.使用真空乾燥器乾燥約 2 分鐘，以使酒精充分揮發。
T E 溶解
12.加入適量之 TE 以溶解 DNA。
13.加入適量 Rnase A 。
14.成品保存於-20℃凍箱中備用。
六、D N A 濃度測定（6 5 、9 0 ）
使用 F l u o r o m e t e r （螢光測定儀，或稱 DNA 濃度測定儀）， 型號 DyNa QuantT M200，簡稱 DQ200 儀器， 為 Hoefer Pharmacia Biotech公司產品。
D Q 2 0 0 儀器之緩衝液配製法
1 . S o l u t i o n A （A s s a y S o l u t i o n）
10 X TNE（pH 7.4） 10 ml Working dye （H33258 Stock Solution） 10μl
無菌水 90 ml 總體積 100 ml
2 . D N A S t o c k S o l u t i o n （1 0 0 μg / m l ）
10 x TNE（pH 7.4） 100μl 小牛胸腺核酸溶液（calf thymus DNA，DNA 濃度：1mg/ml） 100μl 無菌水 800μl 總體積 1 ml
3 . W o r k i n g d y e （H 3 3 2 5 8 S r o c k S o l u t i o n ）
Hoechst 33258 10 mg 無菌水 10 ml 總體積 10 ml
4 . 1 0 x T N E （p H 7 . 4 ）
蒸餾水 約 800 ml 濃度 Tris-base（MW=121.14） 12.11 g （100 mM）
EDTA Na2.2H2O（MW=372.2） 3.72 g （10 mM）
NaCl（MW=58.44） 116.89 g （ 2 M）
用濃鹽酸（conc.HCl）調 pH 至 7.4
加蒸餾水使總體積達到 1000 ml（裝罐置 4℃冰箱中）
5. 小牛胸腺核酸溶液（Calf thymus DNA Solution）（濃度為 1mg/ml）
Calf thymus DNA standard 250μg （Pharmacia Biotech 之 Sigma 產品）
TE 或無菌水 250μl
總體積 250μl
D N A 濃度計算方法：
讀值（ng/ml）x1000x 稀釋倍數（若有稀釋時）= μg/ml = ng/μl
七、聚合 連鎖反應（P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n , P C R）
分析時根據 S k r o c h 和 Niehuis（9 1 ）、Witter（9 2 ）等所發表之方法，並採
用 Idaho Technology 公司之#1605 型 Air Thermo-Cycler 機器進行PCR 反 應。
20μl 之 PCR 反應液含 50 mM Tris（pH 8.3），0.25mg/ml BSA，0.5%
Ficoll 400，1.0 mM tertrazine，3.0 mM MgCl2 ，5 n mole dNTPS ，0.8 unit Super Taq 聚合 （HT Biotechnology LTD）， 20ng 之植物 DNA（作 為板模