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第三章 材料與方法
3-1 實驗材料
3-1-1 青江菜
理想的建模樣本需包容所有待預測樣本的各種差異，方可建立強健之檢量線，
青江菜的一般銷售通路為傳統市場、超市、賣場等，而每個銷售通路商各有不同 的貨源供應，因此存在有極大的差異性。建立硝酸鹽光譜檢量線時，本研究採用 兩種類型之樣本進行。由於第一部分尋找硝酸鹽特徵波長之實驗中，需要測量硝 酸鹽濃度分布極廣的樣本，並無法直接使用市售之青江菜，因此使用的樣本為農 友種苗公司所販售之青江菜種子，自行於台灣大學立體式植物工廠種植之青江菜 (圖 3-1)。種植期間施以台灣大學園藝系羅筱鳳教授實驗室所提供之養液，藉由 調整青江菜生長時之光強度與養液濃度於適當之差異，以獲得具有顯著差異之硝 酸鹽含量樣本，共 177 株。第二部分實際建立檢量線之 200 株樣本則是使用 100 株自行種植具有差異之青江菜樣本與 100 株由頂好自有品牌、綠田農場與妙鷹有 機等單位生產之市售青江菜，目的為建立一條具有差異且可同時包含市售樣本特 徵之檢量線。
圖 3-1 自行於立體式植物工廠種植之青江菜
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3-1-2 青江菜粉
由於水分中於近紅外光處有較強的吸收，因此研究中尋找青江菜硝酸根特徵 波長時，尚需測量去除水分影響之青江菜菜粉光譜資訊。本研究之菜粉樣本是將 青江菜葉片先經化學比色法測得其硝酸根含量後，將其置入烘箱乾燥 12 小時待 其完全乾燥後，再使用磨粉機將乾燥之葉片研磨成粉末，並以每英吋 50 篩孔(50 mesh)過篩而得(圖 3-2)。不同濃度之樣本則是藉額外添加硝酸鈉粉末(Sodium Nitrate, NaNO3) 使其具有六種不同濃度樣本，分別為 3150、5000、10000、20000、
25000 與 30000 ppm，其中 3150 ppm 為未添加硝酸鈉之菜粉樣本濃度。
圖 3-2 自行製備之青江菜粉
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3-2 實驗設備
本研究使用三台不同廠牌之光譜儀進行實驗。其中兩台為不同廠牌之市售小 型光譜儀，另一台則是由 FOSS 公司所生產之 FOSS NIRSystem 6500 實驗室型分 光光度計。於找尋特徵波長的實驗當中，為求最準確之結果，僅以實驗室型光譜 儀作測量，其餘實驗則是以實驗室型儀器作為與小型光譜儀對照之標準。
3-2-1 實驗室型近紅外光分光光度計
本研究中所使用到之分光光度計為 FOSS 公司生產，型號為 FOSS NIRSystem 6500 (以下簡稱 NIRS 6500)之實驗室型分光光度計，其可測量之光譜範圍有兩部 分，波長介於 400~1098 nm，感測器材質為矽(Silicon)；波長介於 1100~2498 nm，
感測器材質為硫化鉛(PbS)，其測量之光譜間距為 2 nm，屬於單片式之感測器，
分光方式屬於前分光型。工作原理為先將光源藉由凹面光柵分離成單色光，再以 分光後的單色光經過樣本反射(reflect)或是透射(transmit)達到光感測器，透過濾 光鏡消除高階繞射階之光譜，並根據樣本與校正白板所接收到之光強度比值計算 出樣本光譜吸收度(absorbance)，並用光譜分析軟體 WinISI 進行分析，便可獲得 其特定成分值之資訊。其中 NIRS 6500 又可根據待測物的特性，分別裝設 Transport 套件以及 Rapid Content Sampler 套件量測。
3-2-1-1 Transport 套件
本研究測量液態樣本與使用比色法時，因需進行液體的透射式測量，因此皆 會採用 Transport 套件作為量測儀器(如圖 3-3)，在進行時須以光穿透率極高之透 明液槽(cuvette)(如圖 3-4)做盛裝。透明液槽之材質會根據不同量測波段而選擇不 同材質，於本儀器可測量之範圍 400-2498 nm 中採用的是玻璃材質液槽。此外根 據待測樣本的吸收度強度可選擇不同厚度之液槽，若是吸收度不夠高即可以增加
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液槽厚度來增加吸收度。本實驗中所需測量之液態樣本為具有強吸收之水溶液，
因此皆採用較薄之 1 mm 厚度液槽。圖 3-5 即為 Transport 套件中可放置 1mm 寬 度液槽之液槽架
圖 3-3 FOSS NIRSystem 6500 Transport 套件
圖 3-4 玻璃材質透明液槽
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圖 3-5 1mm 厚度之液槽架
3-2-1-2 Rapid content sampler 套件
於量測菜葉或是其他體積較大無法放入容器當中之樣本時，需使用反射測量 套件 Rapid content sampler 套件(文後簡稱 RCA)(圖 3-6)，套件中量測窗與光源處 於同一方向，因此待光源反射至樣本後便可將光資訊直接由量測窗內之八個感測 器接收(圖 3-7)。由於葉片較薄，量測時需在葉片上方以鍍金反射鏡覆蓋以確保 完全穿透樣本之光線可反射回感測器中。研究中測量粉狀樣本時則須以石英材質 之圓杯型透明液槽(small ring cup)作為樣本盛裝容器(圖 3-8)。
圖 3-6 FOSS NIRSystem 6500 Rapid content sampler 套件
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圖 3-7 RCA 套件之檢測窗
圖 3-8 菜粉盛裝於圓杯型透明液槽
圖 3-9 實際量測青江菜葉片
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度，但同時也可能會因為進光量較少而造成信噪比的降低。其分光方式不同於傳 統方式，B 廠牌使用數位光源處理芯片(DLP)，以給予數位訊號之方式，將不同 波長之單色光單獨並依序的反射至半徑為 1 mm 之铟鎵砷材質 single chip 光感測 器。此方式減少了可以減少光譜儀所需之體積，亦可降低於分光結束後經過凹面 鏡反射至光感測器時所產生之雜訊，同時也可以藉此調整量測時所擷取的間隔，
而其能檢測範圍為 900 nm 至 1700 nm 之間。於感測器選用上以感測能力較好且 價格較低之 single chip 光感測器取代價格相對高之陣列型感測器，然而感測時間 會因此加長。
表 3-1 光譜量測設備之規格
儀器廠牌 狹縫(μm) 分光方式 感測器 聚光透鏡
Order Sorting
濾光鏡 分光類型
NIRS6500 X 凹面光柵 單片式 有 有 前分光
A 廠牌 未標明 線性濾波鏡 陣列式 有 無 後分光
B 廠牌 25 平面光柵 單片式 有 有 後分光
度，因此在配置硝酸鈉標準溶液時所採用的濃度範圍為 3000、10000、20000 與
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30000 ppm，共四個樣本。其中為了降低量取藥品時所產生的隨機誤差，調配時 皆是先調配出最濃之樣本後再依序稀釋成較低的濃度。
3-3-2 青江菜栽培
在尋找硝酸鹽特徵波段實驗時所使用之青江菜，乃種植於立體式植物工廠，
其栽種方式為水耕。此種植青江菜時須分為兩個階段，第一階段為育苗。將種子 泡水冷藏數小時後取出，以打破種子的休眠機制。其後再將每 2 至 3 顆種子塞入 育苗專用之海棉中，並使其可充分接觸到水分與空氣。待種子發芽後，留下一健 康之菜苗並將其餘之苗剔除，確保菜苗擁有足夠的生長空間，需耗費約為兩週。
第二階段則須待幼苗之根部生長至足夠長度後，將各株移至具有充足空間之生長 層架上。本實驗栽種時分為硝酸鹽含量低中高三組，調配其生長養液時需利用測 量養液中的 EC 值來得知濃度，低中高三組分別給予 0.8 mS/cm、1.6 mS/cm、2.4 mS/cm 之養液濃度。光強度不足會照成植物生長不健全而因此累積過多硝酸鹽於 植株中，因此除養液濃度差異外，三組之光強度亦分別給予明顯之低中高三種區 間，以便區分出三種不同之生長環境。圖 3-10 為研究於台灣大學植物工廠種植 青江菜之情形。
圖 3-10 於台灣大學立體式植物工廠種植青江菜之情形
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為減少種植所耗費之時間，本研究於實際建立檢量線時所使用之青江菜樣本 乃直接購買西螺全民種苗場所販售之青江菜苗，並移植至台灣大學平面式植物工 廠，以土耕法種植而成(圖 3-10)。種植期間將 100 株樣本分為三組，分別施以 0.8 mS/cm、1.6 mS/cm、2.4 mS/cm 之養液濃度，光照強度則是給予前兩組充足之光 源，最後一組施予不充足之光源，期望藉由此環境差異培育出三組具有顯著硝酸 鹽含量差異之青江菜樣本。
圖 3-11 於台灣大學平面式植物工廠種植青江菜之情形
3-3-3 化學比色法
為取得青江菜葉片中之真實硝酸鹽濃度，本研究參考 Cateldo et al. (1975)之 化學比色法作為測定方式。以硝酸鈉當中之硝酸根作為檢測對象，配置濃度為 0、
2、4、6、8、10 mM 共六組標準品，以 Foss NIRS 6500 搭配自動傳送配件測量，
以此建立化學實驗呈色後之硝酸鹽溶液與光譜吸收度之標準關係式。
然而因為比色法可量測的濃度限制僅位於 0-300 ppm 內，因此本研究為使所 有樣本皆能夠使用比色法做量測，研究中測量完青江菜葉片之光譜值後，所有樣
雜訊的穩定度是採用 FOSS NIRSystem 公司所使用的標準量測方式，使儀器重複 量測標準白板 10 次，以計算每一次所擷取到之訊號之間的雜訊大小。其中會計
nm 等間距之光譜數據，此方法也稱為 resampling。
處理完成 resampling 後，尚須消除量測光譜之高頻雜訊及基線飄移現象，因 此本研究使用平滑化與微分兩種數學處理。平滑化可消除光譜之高頻雜訊，平滑
Step-wise 與 Step-up 兩種，Step-wise 模式是利用淨偏相關係數高的波長與偏 F 統計量作為選擇特徵波長的依據，使軟體自動計算出最好的結果，並得知最好的 影響。應用 PLSR 模式的時候，主要在做因子數(number of factors)的決定，越多 的因子數將可以提供越多的資訊，然而當因子數高於某個數量後，將會造成系統
rc： Correlation Coefficient of Calibration，校正組中實際值與預測值之相關 係數。最高值與最低值分別為 1 與 0。
SEC： Standard Error of Calibration，校正組中之標準誤差。代表檢量線對於校 正組當中各樣本的預測值與實際值之平均誤差，與 rc值可共同作為一判 斷指標。此值越小即可代表檢量線的預測結果越理想。
rv： Correlation Coefficient of Validation，驗證組中實際值與預測值之相關係 數。用來判定由校正組所建立之檢量線是否為可使用的指標。最高值與 最低值同樣分別為 1 與 0。
SEV： Standard Error of Validation，驗證組當中之標準誤差。代表檢量線對於 驗證組當中各樣本的預測值與實際值之平均誤差，與 rv值可共同作為依 判斷指標。此值越小即可代表檢量線的預測結果越理想。
RPD： Ratio of Performance to Deviation，以驗證樣本之標準差除以檢量線之標 準誤差。其可代表檢量線計算時之誤差相較於樣本本身之差異性是否明