doi:10.6342/NTU201603425
國立臺灣大學生物資源暨農學院生物產業機電工程學系 碩士論文
Department of Bio-Industrial Mechatronics Engineering College of Bioresources and Agriculture
National Taiwan University Master Thesis
應用小型攜帶式光譜設備
進行葉菜硝酸鹽含量快速檢測之研究
Study on Portable Mini-Specrometers for Rapid Inspection of Nitrate Concentration in Leafy Vegetable
劉峻銘
Chun-Ming Liu
指導教授：陳世銘 博士 Advisor: Suming Chen, Ph. D.
中華民國 105 年 8 月
August 2016
doi:10.6342/NTU201603425
doi:10.6342/NTU201603425
i
誌 謝
進入到台灣大學轉眼間已過了六個年頭，不知不覺歲月已將懵懂無知的大一 新生轉變為幾經洗鍊的碩二生。當中的許許多多回憶點滴，時而喜悅時而悲傷，
很感謝這一切造就了現在的我，雖然不捨，但我的學生生涯即將畫下句點。
完成了這份碩士論文，首先要感謝的就是我的指導老師陳世銘教授。從大三 開始一直到研究所，很幸運地進入到了陳老師的實驗室當中學習，老師不厭其煩 得教導我們在專業領域上的知識，也在這段期間給予我們很多發揮空間，在我們 遭遇挫折時給予鼓勵以及建議，這一切使我們逐漸成為了一個能夠獨當一面的碩 士班學生。感謝各位口試委員：李允中老師、艾群老師、雷鵬魁老師以及楊宜璋 學長，在口試期間仔細且耐心地修正以及指導了我的論文以及研究成果。萬分感 謝蔡兆胤博士在這四年來的教導與關心，不管是在研究上亦或是我人生中遭遇到 的難題的時候，蔡老師都給予了我極大的幫助以及庇護。
感謝實驗室的助理小蔡學長與詠惠姐，學長永遠給予了我們很多重要的建議，
避免了很多我們可能會犯的錯誤，感謝詠惠姐替我們處理了包辦了大小事。謝謝 實驗室夥伴：童學長、振厚學長、健智、林敏、佑佳、阿 B、吱吱、德鴻、阿禿、
阿錡、少韋、岱蓉、涵竣、劼佑、之寧、文心、亦辰、植翔、鈺盛、思瑜、易晉，
405 是一個大家庭，感謝有你們給我協助以及無盡的陪伴，這裡的每一天因為你 們而總是充滿了歡樂。最後是最好的夥伴楷中與政皓，我們三個真的共同完成了 很多不可能的任務，我想我們之間不用再多說什麼感謝的話，只想告訴你們，沒 有你們我什麼也辦不到，謝謝。
感謝陪我歡笑與我分擔憂愁、永遠在後面支持我的你們，生機系的大家、405 另一邊的夥伴們、八寶、Piya、Vic 以及任何一位幫助過我的人。最後要感謝我 的家人，這段時間少了很多與你們相處的時間，謝謝你們無怨無悔的包容我以及 支持我，你們永遠是我力量的來源。
doi:10.6342/NTU201603425
ii
摘 要
蔬菜為人類日常飲食中不可或缺之食物，然而蔬菜容易因栽種不當而殘留過 多有害健康之硝酸鹽，因此本研究目的為測試以兩台市售小型光譜儀之性能及檢 測能力，評估開發小型光譜檢測設備之可行性，期望建立出可快速檢測蔬菜中硝 酸鹽濃度之方法，並提供開發低價光譜設備之參考。本研究先以 FOSS NIRSystem 之方法對三台光譜儀進行 Photometric Noise 測試，僅實驗室型 RCA 光譜儀之數 據符合 FOSS 原廠建議值，顯見其穩定性均不及 RCA 光譜儀。再以實際測量生 物材料，並以各式數學處理之光譜形狀比較二者與 RCA 量測到之主要波峰位置，
作為初步判斷光譜儀波長偏移情形之依據。整體顯示 A 牌之結果皆較 B 牌優，
然而若將價格加入考量數據，則其 CP 值未必是 A 牌較佳。
於實際建立檢量線之部分乃採用 RCA、A 牌(分為透射、反射配件)與 B 牌 光譜儀，分別測量自行種植之青江菜光譜資訊，藉由化學比色法得知葉片中之硝 酸鹽濃度，並以 PLSR 分析建立檢量線。其中以 RCA 建立之檢量線的 rc值為 0.85 且 rv值為 0.73，SEC 值約為 1000 ppm 為三者中最佳，而 A、B 光譜儀以反射式 測量而得知之檢量線 rc值與 rv值分別為 0.81 與 0.68 以及 0.71 與 0.48，皆屬於具 有測量能力之檢量模型，而結果顯示光譜儀之預測能力與性能測量比較結果相符。
根據不同測量方式的建模結果則證明了透射式可獲取較反射式為多的資訊，所得 之結果較佳。而包含越多光譜資訊範圍的檢量線則可獲得較穩健之結果，濃度範 圍分布較小之檢量線相關係數較小，但誤差也可因此降低。透過比較其基本性能 與檢量線建立之結果，期望可提供未來開發低價光譜設備之參考依據。
關鍵詞：非破壞性檢測、近紅外光、小型光譜儀、青江菜、硝酸鹽檢測
doi:10.6342/NTU201603425
iii
Abstract
Vegetables are necessary food in human’s daily meals. However, due to improper cultivation, there will be excessive nitrate remained in vegetable, which is harmful to human’s health. As a result, the purpose of this study is to evaluate the possibility of
developing a low-priced spectroscopy equipment based on commercial portable mini-spectrometers and establish a method of rapid detection of the concentration of nitrate in vegetables.
In this study, we have tested three spectrometers, including laboratory spectrometer RCA and two mini-spectrometers from company A and company B, for their performance and stability. Spectral signals of biomaterials were measured by using these spectrometers, and the appearances of waveform were regarded as the basis of availability of each spectrometer. The results indicated that the performance of RCA is most stable and followed by company A than company B and only the RCA conforms to the Photometric Instrument Noise inspection from FOSS NIRSystem Inc.
However, the CP value of mini-spectrometer of company A might not be better than that of company B after taking their price into account.
During calibration model developing, we adopted the spectral information of self- cultivated Bok Choy leaves which were measured by RCA, spectrometer A
doi:10.6342/NTU201603425
iv
(transmission and reflection ways), and spectrometer B. The nitrate concentrations of each Bok Choy were obtained by using chemocolorimetry. PLSR analysis was used to build four calibration models. In the calibration model using RCA, the values of rc and rv could achieve 0.85 and 0.73, and the value of SEC were 1104.96 ppm; in the calibration models using spectrometer A and spectrometer B, the values of rc and rv could achieve 0.81 and 0.68 and 0.71 and 0.48, which showed that these models have enough ability in prediction and they also confirmed the results of performance and stability tests. Moreover, the study also compared the results from different measurement conditions, such as detection ways and the nitrate concentration distribution of data. The result shows the reflectance way is more precise and the large distribution of nitrate can help to build the model stable. Base on the results of comparison of performance between different spectrometers and establishment of calibration models, it can provide a reference for the development of low-price spectroscopy equipment in the future.
Keywords: Non-destructive detection, NIR, mini-spectrometers, Bok choy, Nitrate
doi:10.6342/NTU201603425
v
目錄
誌 謝... i
摘 要... ii
Abstract ... iii
圖目錄... vii
表目錄... 1
第一章 前言... 3
1-1 前言 ... 3
1-2 研究目的 ... 4
第二章 文獻探討... 5
2-1 硝酸鹽 ... 5
2-1-1 硝酸鹽 ... 5
2-1-2 硝酸鹽對人體之影響 ... 7
2-1-3 硝酸鹽檢測方法 ... 8
2-1-4 青江菜 ... 9
2-2 光譜檢測技術 ... 10
2-2-1 近紅外光檢測技術 ... 10
2-2-2 小型近紅外光光譜儀 ... 13
2-2-3 多光譜檢測技術 ... 14
2-3 市售小型光譜儀 ... 15
2-3-1 傳統光譜儀 ... 15
2-3-2 光學濾光型光譜儀 ... 16
2-3-3 DLP 波段選別光譜儀 ... 18
第三章 材料與方法... 20
3-1 實驗材料 ... 20
doi:10.6342/NTU201603425
vi
3-1-1 青江菜 ... 20
3-1-2 青江菜粉 ... 21
3-2 實驗設備 ... 22
3-2-1 實驗室型近紅外光分光光度計 ... 22
3-2-2 市售小型光譜儀 ... 26
3-2-3 台灣大學植物工廠 ... 28
3-3 實驗方法 ... 28
3-3-1 標準品配置 ... 28
3-3-2 青江菜栽培 ... 29
3-3-3 化學比色法 ... 30
3-3-4 光譜資訊擷取 ... 31
3-3-5 小型光譜儀基本性能 ... 32
3-3-6 特徵波長尋找 ... 33
3-3-7 光譜資訊分析 ... 34
第四章 結果與討論... 38
4-1 市售小型光譜儀檢測結果 ... 38
4-2 硝酸鹽濃度分析結果 ... 48
4-3 青江菜中檢量線建立結果 ... 51
第五章 結論... 63
參考文獻... 65
附錄... 73
doi:10.6342/NTU201603425
vii
圖目錄
圖 2-1 蔬菜中硝酸鹽含量 ... 10
圖 2-2 常見鍵結之近紅外光吸收頻帶 ... 12
圖 2-3 可於田間行走之多光譜影像檢測系統 ... 14
圖 2-4 光譜儀內部構造圖 ... 16
圖 2-5 各式光學濾光鏡片 ... 16
圖 2-6 鍍膜分光型光譜儀之工作原理 ... 17
圖 2-7 DLP 芯片工作原理 ... 18
圖 3-1 自行於立體式植物工廠種植之青江菜 ... 20
圖 3-2 自行製備之青江菜粉 ... 21
圖 3-3 FOSS NIRSystem 6500 Transport 套件 ... 23
圖 3-4 玻璃材質透明液槽 ... 23
圖 3-5 1mm 厚度之液槽架 ... 24
圖 3-6 FOSS NIRSystem 6500 Rapid content sampler 套件 ... 24
圖 3-7 RCA 套件之檢測窗 ... 25
圖 3-8 菜粉盛裝於圓杯型透明液槽 ... 25
圖 3-9 實際量測青江菜葉片 ... 25
圖 3-9 於台灣大學立體式植物工廠種植青江菜之情形 ... 29
圖 3-10 於台灣大學平面式植物工廠種植青江菜之情形 ... 30
圖 4-1 A 牌量測蘋果之光譜... 43
圖 4-2 B 牌量測蘋果之光譜... 43
圖 4-3 RCA 與 A 牌光譜儀量測蘋果之一次微分光譜訊號 ... 44
圖 4-4 RCA 與 A 牌光譜儀量測蘋果之二次微分光譜訊號 ... 44
圖 4-5 硝酸鹽比色光譜檢量模式 ... 48
doi:10.6342/NTU201603425
viii
圖 4-6 自行種植青江菜樣本之硝酸根濃度 ... 49 圖 4-7 200 株青江菜硝酸鹽含量分布 ... 51
doi:10.6342/NTU201603425
1
表目錄
表 2-1 不同蔬菜中硝酸鹽的含量 ... 6
表 2-2 歐盟修訂蔬菜中硝酸鹽最大限量標準 ... 6
表 3-1 光譜量測設備之規格 ... 27
表 4-1 RCA Photometric Instrument Noise 檢測結果 ... 40
表 4-2 A 牌光譜儀 Photometric Instrument Noise 檢測結果 ... 40
表 4-3 B 牌光譜儀 Photometric Instrument Noise 檢測結果 ... 40
表 4-4 Photometric Instrument Noise 檢測彙整之結果 ... 41
表 4-5 蘋果二次微分光譜 峰值比較 ... 45
表 4-6 青蘋果二次微分光譜 峰值比較 ... 45
表 4-7 葡萄柚二次微分光譜 峰值比較 ... 46
表 4-8 檸檬二次微分光譜 峰值比較 ... 46
表 4-9 奇異果二次微分光譜 峰值比較 ... 46
表 4-10 五種水果檢測結果統計表 ... 47
表 4-11 以 RCA 測量三種對象所得之特徵波長 ... 50
表 4-12 以實驗室型光譜儀 RCA 量測之光譜交互驗證分析之結果 ... 54
表 4-13 以 A 牌光譜儀透射配件量測之光譜交互驗證分析之結果 ... 55
表 4-14 以 A 牌光譜儀反射配件量測之光譜交互驗證分析之結果 ... 56
表 4-15 以 B 牌光譜儀量測之光譜交互驗證分析之結果... 57
表 4-16 實驗室型光譜儀 RCA 量測之光譜 PLSR 分析之結果彙整 ... 58
表 4-17 A 牌光譜儀透射配件量測之光譜 PLSR 分析之結果彙整 ... 59
表 4-18 A 牌光譜儀反射配件量測之光譜 PLSR 分析之結果彙整 ... 59
表 4-19 B 牌光譜儀量測之光譜 PLSR 分析之結果彙整 ... 60
doi:10.6342/NTU201603425
2
表 4-20 以不同硝酸鹽濃度與波長範圍分組之結果 ... 60
表 4-21 以 RCA 量測 I 組之 PLSR 分析結果 ... 61
表 4-22 以 RCA 量測 II 組之 PLSR 分析結果 ... 61
表 4-23 以 RCA 量測 III 組之 PLSR 分析結果 ... 62
表 4-24 以 RCA 量測 IV 組之 PLSR 分析結果 ... 62
doi:10.6342/NTU201603425
3
第一章 前言
1-1 前言
人類每天所需的營養有醣類、脂質、蛋白質、礦物質、維生素和水，缺一不 可，但現在外食人口比例不斷增加，常僅注重醣類、脂質和蛋白質等營養成份，
而忽略了維生素和礦物質的攝取。蔬菜之熱量低、富含纖維素以及維生素 A、維 生素 B 等多樣營養素，也因此蔬菜扮演著人類飲食當中不可或缺的角色。然而 蔬菜常因栽種管理不當，殘留不適合人體大量食用之硝酸鹽NO3−，根據 Correia et al.(2010)的研究指出，硝酸鹽對於人體並沒有直接害處，但當其經由進食過程進
入人體時，很容易還原成帶有毒性的亞硝酸鹽。亞硝酸鹽會降低紅血球攜氧功能 且有致癌性，嚴重影響身體的健康。美國毒性物質及疾病登記署 ( Agency for Toxic Substances and Disease Registry, ATSDR ) 研究指出，若是攝取過量的硝酸 鹽，將有可能會導致高鐵血紅蛋白症(methemoglobinemia)，使患者出現缺氧、心 臟和循環系統衰竭等症狀，嚴重時甚至會影響中樞神經系統。
消費者在挑選蔬菜時，若有硝酸鹽含量的分級指標，這種蔬菜在食用時，消 費者也可獲得更多的保障。然而一般硝酸鹽測量往往需破壞葉菜本身才能獲得資 訊，也因此不易進行全數檢測，需以抽檢或經驗判斷的方式來預測蔬菜的硝酸鹽 含量，消費者並無法得到正確的硝酸鹽含量資訊。
近紅外光光譜技術具有即時與非破壞檢測之優點，因此非常適合用於生物材 料之測量。近年來此技術被廣泛地運用在藥學、食品工業、農產加工業等領域，
無論是定性或定量上都有傑出的應用成果。例如：以高光譜進行茶葉醱酵度的檢 測(羅，2009)、血液中血紅蛋白之含量檢測(Blanco et al., 2000)、辨識藥品組成成 分等(Valyi-Nagy et al., 1997)、使用近紅外光檢測蓮霧的蔗糖含量(林，2002)。林 (2014)的研究中，使用制式儀器以近紅外光檢測葉菜的硝酸鹽含量，其模式之 r2
doi:10.6342/NTU201603425
4
值達到 0.81；而 Chuang et al.(2012)中是以近紅外光檢測蓮霧的蔗糖含量，其模 式之 r2值更高達 0.988。上述兩個研究之結果的相關係數皆屬於高度相關，因此 顯示以近紅外光檢測生物材料可有十分準確的預測能力。然而這些研究皆以實驗 室型光譜儀作為測量儀器，不僅價格高昂亦缺乏機動性，較不利推廣於消費者使 用。近年來光譜儀技術發展快速，許多廠商皆推出小型光譜儀，雖檢測能力稍不 如實驗室型光譜儀，然而卻可充分利用適合攜帶之特性，對於推廣至消費市場有 極大的潛力。
1-2 研究目的
本研究之目的是評估以市售小型光譜儀開發低價光譜檢測設備之可行性。有 別於使用制式儀器的測量，是以小型光譜儀進行實驗，針對不同廠牌小型光譜儀 之性能與構造進行測試比較，並以青江菜為檢測對象，進行小型光譜儀硝酸鹽檢 量模式的建立，同時與實驗型光譜儀量測結果比較，期望能提供開發低價光譜檢 測設備的參考。
doi:10.6342/NTU201603425
5
第二章 文獻探討
2-1 硝酸鹽
本節介紹硝酸鹽、硝酸鹽與人體的關係與攝取後之影響，列舉現有硝酸鹽檢 測方式並說明以青江菜作為研究對象之必要性。
2-1-1 硝酸鹽
胺基酸是人體生命的基本物質，氮則是構成胺基酸的主要元素之一，是生物 所需的必要元素(Crawford, 1995)。雖然大氣當中的氮佔了五分之四，但是氮氣必 須經由固氮作用才能轉變成被動植物吸收的物質。
其中植物生長所需之氮來源主要來自栽培介質或肥料所釋出之NO3−或 NH4+(劉等人，2009)。NO3−為其主要的吸收型態。NO3−被作物吸收後，需先轉 換為NH4+，才能變成胺基酸進入作物的細胞，也就是氮同化作用(Brady and Weil, 2000)。然而若是光照不充足，NO3−被吸收後將不會完全被轉化為胺基酸，而是 以NO3−的型態堆積於植物中，這便是硝酸鹽殘留的主要原因。
栽培作物時不施與氮肥，將會使作物無法長大，但若是施與過量的氮肥或是 日照量不足(Cantliffe, 1973)，會讓蔬果當中胺基酸的合成慢於硝酸鹽的吸收速率，
進而累積大量的硝酸鹽於植物體內造成毒性(Rao and Rains, 1976; Melzer et al., 1989）。在 Manuela Correia et al. (2010)的研究中，針對 34 種不同蔬菜進行硝酸 鹽分析，氮肥及光照強度為影響硝酸鹽濃度的兩大因素，雖為同類蔬菜但其硝酸 鹽含量仍存有極大的差異。一般來說，萵苣、紅蘿蔔、波菜等之硝酸鹽含量會較 其他蔬菜高(Santamaria, 2006)。不同蔬菜之中硝酸鹽含量如表 2-1 所示，以 Portuguese cabbage 為例，僅取 9 株植株，所測到之硝酸鹽含量最低只有 41 ppm，
但最高卻高達 939 ppm，標準差高達 323 ppm。因此我們可看出即便是同一種蔬
doi:10.6342/NTU201603425
6
菜，其硝酸鹽含量亦有非常大的差異。
表 2-1 不同蔬菜中硝酸鹽的含量（ppm）（Correia et al., 2010）
Vegetable N Min Max Mean SD
Portuguese cabbage 9 41 939 547 323
Turnip sprouts 7 54 1447 489 471
Kale(“Couve galega”) 7 41 1319 472 464
Parsley 5 9 2440 891 970
Spinach 2 797 1427 1112
Turnip(root) 2 234 654 444
Letuce 1 1156
Colza(“Couve-nabica”) 1 73
N：樣本個數；SD：標準差
表 2-2 即為歐盟所修訂的蔬菜內硝酸鹽限量標準，藉此表便可了解目前蔬菜 硝酸鹽含量的規範，也可以了解人體所能接受之硝酸鹽攝取量範圍。此外從表格 當中亦可得知硝酸鹽與亞硝酸鹽會同時存在於蔬菜當中，然而因為種類不同，其 含量之比例也會不同，但可看出最主要還是以硝酸鹽之型態存在於蔬菜當中，因 此本研究以量測硝酸鹽為主。
表 2-2 歐盟修訂蔬菜中硝酸鹽最大限量標準(Hord et al.，2009) Vegetable types and varieties Nitrite Nitrate
mg/100g fresh weight mg/100g fresh weight
Root vegetables Carrot 0.002–0.023 92–195
Mustard leaf 0.012–0.064 70–95
Lettuce 0.008–0.215 12.3–267.8
doi:10.6342/NTU201603425
7
Spinach 0–0.073 23.9–387.2
Chinese cabbage 0–0.065 42.9–161.0
Bok choy 0.009-0.242 102.3-309.8
Cabbage 0-0.041 25.9-125.0
Cole 0.364-0.535 76.6-136.5
Wax gourd 0.001-0.006 35.8-68.0
Cucumber 0-0.011 1.2-14.3
Eggplant 0.007-0.049 25.0-42.4
2-1-2 硝酸鹽對人體之影響
人體攝取硝酸鹽的最主要來源有三種，分別為蔬菜、加工肉品和受汙染的地 下水。亞硝酸鹽可與肉品中的肌紅素結合而更安定，常用於香腸和臘肉中作為保 色劑，以維持良好外觀(Manuela Correia et al., 2010)。亞硝酸鹽也可能經由烹調 或其他條件下，結合肉或海鮮當中所含的胺基酸產生降解反應，進而形成具有強 致癌性的亞硝酸胺。
植物中之硝酸鹽為其生長所產生的殘留物質，因此人們對於硝酸鹽攝取將難 以避免，只可確保其含量低於規定之殘留量時，對人體才不會造成傷害，因此本 實驗以測量硝酸鹽含量作為目標，希望可幫助消費者快速檢測硝酸鹽含量，避免 身體攝取過多的硝酸鹽。Manuela Correia et al. (2010)之研究指出攝取硝酸鹽，其 含量若低於每日可接受吸收量(ADI)，便可以安心無虞。依照聯合國食品添加物 專家委員會於 1995 年所評估，硝酸鹽的每日可攝取量為 0 - 3.7 毫克/公斤體重/
日，而亞硝酸鹽的每日可攝取量為 0 - 0.06 毫克/公斤體重/日。
根據 ATSDR（2013）網站所刊登之研究資料指出，攝取過量的硝酸鹽會導 致高鐵血紅蛋白症（methemoglobinemia）。高鐵血紅蛋白是血紅蛋白中原有的亞
doi:10.6342/NTU201603425
8
鐵離子(Fe2+)，會被人體內過多的硝酸鹽與亞硝酸鹽氧化為鐵離子(Fe3+)，會使 原本的血紅蛋白轉變為褐色。量過多時，會使血液喪失攜氧能力，將可能導致病 人缺氧 (Bruning-fann and Kaneene, 1993)，由於血液不能運送氧氣，口唇、指尖 會變成藍色，亦有俗稱此為「藍血病」，嚴重會令腦部缺氧，甚至死亡。嬰兒尤 其為高鐵血紅蛋白症的高危險族群。由於嬰兒的胃酸分泌不足，腸胃系統呈鹼性，
較適宜硝酸鹽還原菌生長，母體攝取之硝酸鹽與亞硝酸鹽，又容易轉移至胎兒體 內。
2-1-3 硝酸鹽檢測方法
硝酸鹽泛指由硝酸根離子所形成之鹽類，硝酸鹽的活性與亞硝酸鹽相較為較 低，因此，在檢測硝酸鹽時，經常會先將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽後再做檢測 (Moorcroft et al., 2001)。硝酸鹽的檢測方法眾多，依據待測物為液態或是氣態各 有分別。依中華民國行政院環保署環境檢驗所提供之水中檢測方法有四：馬錢子 鹼比色法、分光光度計法、鎘還原流動注入分析法與鎘還原法，而氣態中的檢測 法則有三種：2,4 二甲苯酚法、抑制型離子層析法與離子層析法。然而以上標準 方法僅適合應用於水質與空氣的檢測上，與使用於葉菜之量測較無直接關聯。
於菜葉測量方面，根據中華民國衛生福利部所提供給葉菜硝酸鹽檢驗的標準 中列有三種方法，分別是呈色法(分光光度計法)(McMullen et al., 2005)、高效液 相層析法(HPLC)(Chou et al., 2003)與離子層析法(IC)(Ondrej et al., 2010)，三種方 法皆與歐盟公布之標準方法相同。第二及第三項使用上需耗費較長時間，而呈色 法為最準確且為台灣公定分析化學家協會(AOAC)所使用之方法(陳等人，2012)，
因此本研究採用此種方法量測硝酸鹽含量。
此外，近年來有一種測量方法為使用 Merk 試紙進行量測，可檢測土壤和蔬 菜之硝酸鹽含量。其中測驗蔬菜的方式為：將蔬菜打成汁後用試紙直接沾取，再 對照試紙之顏色以判斷硝酸鹽含量。但因為試紙的測量濃度範圍有限制，通常只
doi:10.6342/NTU201603425
9
能測量 500 ppm 濃度以下，因此需加水稀釋才能量測高濃度的樣本，另還需靠肉 眼或專用儀器比色以判斷其含量，前者量測誤差較大，後者則須額外添購專用儀 器。但因其準確率並非很高，因此該量測方法通常只能做現場即時檢測之用，實 驗室還很少使用該方法量測。
在非破壞性檢測方面，潘(2012)利用多光譜影像技術量測蔬菜葉片之硝酸鹽 含量，此方式擁有即時獲取資料之優點，並兼具影像之特點，可以提供光譜以及 空間資訊，該研究所建立之檢測模式，其 r 值可達 0.67，已具檢測能力。林(2014) 使用制式光譜儀量測青江菜葉片並使用 MPLSR 分析其硝酸鹽含量，建立預測模 式之 r 值為 0.78。
2-1-4 青江菜
青江菜(學名：Brassica chinensis Linn)原產於亞洲和歐洲北部地區，又稱江 門白菜、高腳白菜等。屬於十字花科草本植物，全年皆可栽種，葉柄較粗，葉片 較小且圓，形狀像湯匙，俗稱湯匙菜，為台灣人常食用之蔬菜之一(臺灣大百科 全書，2013)。依照葉梗的顏色又分為青梗和白梗兩種，是由小白菜育成的耐熱 品種。青江菜富含維生素 C、鈣質及葉酸，對高血壓、動脈硬化等疾病皆有預防 的功效，亦能維持骨骼的強壯。而豐富的維生素 A 對於眼睛的保養有著極佳的 幫助，對於保養皮膚也很有效。
所有蔬菜當中，以葉菜類的硝酸鹽殘留為眾多品種之冠，而葉菜類之中，十 字花科蔬菜又佔前幾名(羅等人，2012)(圖 2-1)。青江菜更為十字花科中硝酸鹽含 量偏高之蔬菜，其硝酸鹽含量位居前五名(林，2006；羅等人，2012)。因此，對 於青江菜之硝酸鹽含量進行檢測與把關顯得更為重要。
本研究選用青江菜作為實驗樣本，因其為台灣常見之蔬菜，卻如前所述，有 較高之硝酸鹽殘留，為迫切需量測硝酸鹽含量之葉菜種類。
doi:10.6342/NTU201603425
10
圖 2-1 蔬菜中硝酸鹽含量(羅等人，2012)
2-2 光譜檢測技術
光譜檢測為一種非破壞性、快速且準確之檢測技術，因其具非破壞性之優點，
常用於檢測生物材料。本節介紹有關近紅外光光譜檢測技術，以及其延伸應用。
2-2-1 近紅外光檢測技術
近紅外光介於可見光與紅外線之間，波長範圍為 780 nm 至 2500 nm (Blanco, 2002)。用於定量分析時，乃是根據比爾定律(Beer’s Law)，如式 2-1 至式 2-3 所 示，其中𝐼0、𝐼𝑟、𝐼𝑡、R 與 T 分別為入射光、反射光、透射光、反射率以及透射 率，而 A 則是根據測量的方法不同所得的反射或是透射之吸收度，其中式 2-3 代表的是透射之吸收度。因此透過計算光通過待測物質後，被待測物分子鍵結吸 收光之多寡，便可辨別其中待測物之濃度。因其具有非破壞性之優點，近年來常 用於生物材料的檢測，如檢測蔬菜中成分的含量(廖，2008)、蔬果內之糖度高低 (林，2002)、生物含水率(Vomhof and Thomas, 1970)、水果糖酸度(陳等人， 2008)、
維他命 C(Blanco et al., 1997)、幾丁質(蔡， 2004)等研究。
doi:10.6342/NTU201603425
11
R = 𝐼𝐼𝑟
0 (式 2-1)
T = 𝐼𝐼𝑡
0 (式 2-2)
A = log1𝑇 (式 2-3)
用於定性分析時，則是利用不同分子鍵結有其特定吸收光譜範圍的特性，判 別待測物之物質種類，例如 O-H 鍵、C-H 鍵等鍵結都會有其特定的吸收光譜範 圍(圖 2-2)。相關研究如中藥成分檢測及分類(黃等人，2004)、肉品檢測(Cozzolino and Murray, 2002)等，其中王(2010)使用近紅外光光譜檢測茶葉兒茶素，搭配多 重線性回歸(MLR)以及修正型最小平方回歸兩種方法，得到之相關係數數值皆可 達 0.95 以上。
此外根據分子由基態躍升至不同的激發態的能階差異，可藉由觀察吸收能量 的不同分為基礎吸收與泛音吸收(林，2002)。鍵結之基礎吸收多處於中、遠紅外 光區域，並不為本研究可量測之範圍，因此必須藉由測量位於近紅外光波段之泛 音吸收與其衍伸出的組合頻帶(combination bands)之結果，來判別待測物之種類。
於本研究之研究對象硝酸鹽而言，其中所擁有的硝酸根離子便是本研究希望檢測 之對象，根據 Ehsani et al. (1999)之研究，硝酸根因吸收光而產生之基礎震動主 要有四種，分別是位於 9524 nm 處之對稱拉伸(symmetric stretch)、12034 nm 處 之出平面彎曲(out-of-plane bending)、7194 nm 處之反對稱拉伸(antisymmetric stretch)與 13889 nm 處之入平面彎曲(in-plane bending)。而根據計算其不同的泛音 吸收與組合頻帶，與 Upadhyaya et al. (2010)之文獻指出之位置相吻合，因此得知 硝酸根於近紅外光區域的強吸收波段位於 1800 至 2300 nm 之間。
doi:10.6342/NTU201603425
12
圖 2-2 常見鍵結之近紅外光吸收頻帶 （FOSS NIRSystems Inc, 2005）
doi:10.6342/NTU201603425
13
2-2-2 小型近紅外光光譜儀
近紅外光檢測技術十分準確並且具有快速與非破壞性等許多優點，然而實驗 室型設備由於體積較大不易搬運，無法運用於機動性高之場合，其應用層面常被 限制。體積小的光譜儀，便有助於將光譜技術推展到更多的應用。然而即便體積 小的光譜儀具有高的機動性，但在實際應用上仍有許多層面的問題需予考慮，例 如價格、重量、電源供應、準確度與人機介面等(dos Santos et al., 2013)，也因此 運用小型光譜儀開發檢測設備勢必存有其困難度。目前市面上已有許多小型光譜 儀的販售，但其價格及性能皆未適合被應用於成份檢測設備的開發。
市售小型光譜儀之性能主要之指標有：信噪比(Signal to Noise Ratio, SNR)、
動態範圍(Dynamic range, DR)、穩定度與積分時間等。其中信噪比又稱信號雜訊 比，即為信號對雜訊之比例，用於比較所需訊號的程度與背景雜訊之程度，可做 為表示儀器量測能力優劣之參考依據(Pauluzzi and Beaulieu, 2000)。其中，又分為 SNRMax與 SNRAvg，前者是自各波長所計算出的 SNR 之最大值，後者是將所有雜 訊平均後以最大之訊號除之，兩種計算方法各自不同但皆有人採用，二者皆具參 考價值。動態範圍之指標可顯示光譜儀感光能力之範圍，範圍越大即表示可接收 到的資訊強度越強(Barnes, 1985)，以硬體最大的測量與硬體暗電流所產生之雜訊 相比而得。解析度則是指光譜儀中將光線解析後可檢測到之最小單位，其大小取 決於光柵的分光能力、狹縫寬度、系統的光學像差等其他參數。穩定度之指標可 表示儀器在經過長時間的使用過後，測量到的光譜資訊出現的雜訊大小與其基線 飄移程度大小。積分時間即為曝光時間，當檢測之光強度很弱時，可以加長期曝 光時間來放大檢測訊號，雖然也可以使用調高放大倍率之方法獲得較強之檢測訊 號，然而調高放大倍率亦可能將雜訊一併放大。
doi:10.6342/NTU201603425
14
2-2-3 多光譜檢測技術
不同於全波段之光譜檢測，多光譜檢測技術可藉由部分較具代表性之特徵波 長來達到預測之效果。因其所需使用之波長較少，所耗費之成本可降低，亦較適 用於及時之現場檢測，固有許多運用多光譜技術於植物生理與田間之檢測。如：
Cogdill et al. (2004) 利用多光譜與彩色影像進行耕地中磷元素之定量評估。Noh et al. (2005) 將多光譜影像檢測系統，加裝於可於田間行走之機器(圖 2-3)，使用
550、660 與 800nm 之波長檢測玉米之吸收度，對其葉綠素含量做迴歸分析，其 決定係數 r2值皆大於 0.72。於 Borhan et al. (2004) 之研究中以 CCD 數位攝影機 搭配多光譜系統，擷取馬鈴薯葉片於光波長 550, 710, 810nm 之下之影像，以線 性回歸方法找出光譜資訊與硝酸鹽和葉綠素含量之關係，其 r2值達到 0.78，雖然 研究樣本稍嫌不足，但仍顯示以多光譜系統檢測植物中硝酸鹽之可能性。
圖 2-3 可於田間行走之多光譜影像檢測系統 (Cogdill et al., 2004)
doi:10.6342/NTU201603425
15
2-3 市售小型光譜儀
2-3-1 傳統光譜儀
傳統光譜儀以分光方式區分可分為前分光型與後分光型，前者是將光源先以 光譜儀分光後再照射至樣本進行量測，而後分光型則是先將光源照射樣本後，其 量測之光線再以光譜儀分光，本節以較常應用於線上檢測之後分光型光譜儀作為 討論對象。
使用外接光源以反射或透射方式照射過樣本後之光通常會先經由光纖做傳 遞，並在進入光譜儀前以聚光透鏡將光線聚焦至狹縫(collimator slit)中(如圖 2-4 橘色所示)。狹縫之寬度可將光線解析，較小的狹縫即可獲得較高之解析度，然 而光線通過之能力也會同時減弱，反之若狹縫較寬則可犧牲解析能力並提高其檢 測光強度。經解析的光再經過準值凹面鏡便可將平行光線照射於平面光柵表面上。
平面光柵為一表面刻有等寬且等間隔刻痕之元件(如圖 2-4 中紅色位置)，光線會 因散射和干涉而分解為一系列波長之單色光，再經凹面鏡將分光後各波長之平行 光聚焦於感測器之焦平面上，藉此便可獲取各波長之光譜資訊。由於經光柵所分 離出的光線具有高繞射階之雜訊及條狀成像面之關係，有些較高級之光譜儀會額 外加裝濾光鏡(前者)及聚光透鏡(後者)(如圖 2-4 綠色處)去過濾雜訊及加強光強度 信號。
doi:10.6342/NTU201603425
16
圖 2-4 光譜儀內部構造圖(Ocean Optic Inc, 2014)
2-3-2 光學濾光型光譜儀
光學濾波器為可使特定波長通過之濾光鏡片，而線性可變濾光鏡片(linear variable filter, LVF)(圖 2-5)則是使用鍍膜技術將微米大小之微粒塗層鍍於分光元 件上，使其產生厚度差異，成為一單方向之楔型元件，使光源照射至元件時便可 以藉此楔型元件將光線分解為一系列波長之單色光，大多分為紫外光(UVA)、可 見光(VIS)與近紅外光(NIR)區域之濾光鏡片。市面上常常應用於光學顯微鏡、生 物醫學雷射系統、流式細胞儀、光學相干斷層攝影技術等等。
圖 2-5 各式光學濾光鏡片(Delta Optical Thin Film A/S, 2016)
doi:10.6342/NTU201603425
17
光學濾波型光譜儀則是使用 LVF 作為分光方式之光譜儀，有別於傳統光柵 光譜儀，採用 LVF 作為分光方式之光譜儀。可直接使光源照射至元件而分解為 單色光(如圖 2-6)，便可以使用陣列型光感測器做光譜之接收，由於以此方式分 光之光譜儀只須將光線照射至濾光片上便得以分光，因此相較於平面光柵式光譜 儀，不僅不須加裝凹面鏡於光譜儀內部進行光線的準直與聚焦處理，於體積的縮 減上也有著顯著的差異。
圖 2-6 鍍膜分光型光譜儀之工作原理(Echung Electronic Technology, 2016)
doi:10.6342/NTU201603425
18
2-3-3 DLP 波段選別光譜儀
數位光源處理技術 Digital Light Processing (DLP)芯片為一包含數位微型反 射鏡元件 Digital Micromirror Device (DMD)之可編程高速數位光開關，可接受電 子訊號代表之資料字元，並產生光學輸出。其由許多微小之反射鏡構成，當接受 到數位訊號時，其數位開關便會使反射鏡旋轉至+12 度，若是沒有接受到訊號，
數位開關便會使微反射鏡旋轉至-12 度，使 ON 狀態之反射鏡顯得非常明亮而 OFF 狀態則反之。如圖 2-7 所示，根據下方之 DMD 所獲得之訊號，可使光源分 別反射至需投影之目標亦或是導向別處使光源被吸收。
圖 2-7 DLP 芯片工作原理 (德州儀器。2016)
doi:10.6342/NTU201603425
19
目前 DLP 廣泛的被應用於投影機與顯示器當中，其與目前常見之 LCD 投影 機的差別在於 LCD 需使用紅藍綠三種顏色之液晶板，在使光源通過屏幕上像素 點對應的成像單元才得以成像。而 DLP 投影機則是以三顆 DMD 分別使經由三 菱鏡分光過後之紅綠藍三色光導向適當之位置並達到成像效果。其中 DLP 投影 機的最大優點是為可以實現更小的體積以及重量，並且可以達到較高之對比值，
使畫面更為清晰，目前幾乎所有重量小於 3.5 磅的投影機皆為採用 DLP 技術而 製成。
將 DLP 技術運用於光譜儀當中便可將 DMD 作為光源選別元件使用，可有 效地選擇經由適當分光過後之光線進入至感測器當中，僅使特定光線進入感測器，
能有效降低光資訊之雜訊並提升光譜儀之辨識能力與準確度。於光感測器的選擇 上便不須選擇單價較高的陣列型感測器，可使用面積較大之單晶片感測器做代替，
於感測能力上可大幅提升並同時降低光譜儀成本。
doi:10.6342/NTU201603425
20
第三章 材料與方法
3-1 實驗材料
3-1-1 青江菜
理想的建模樣本需包容所有待預測樣本的各種差異，方可建立強健之檢量線，
青江菜的一般銷售通路為傳統市場、超市、賣場等，而每個銷售通路商各有不同 的貨源供應，因此存在有極大的差異性。建立硝酸鹽光譜檢量線時，本研究採用 兩種類型之樣本進行。由於第一部分尋找硝酸鹽特徵波長之實驗中，需要測量硝 酸鹽濃度分布極廣的樣本，並無法直接使用市售之青江菜，因此使用的樣本為農 友種苗公司所販售之青江菜種子，自行於台灣大學立體式植物工廠種植之青江菜 (圖 3-1)。種植期間施以台灣大學園藝系羅筱鳳教授實驗室所提供之養液，藉由 調整青江菜生長時之光強度與養液濃度於適當之差異，以獲得具有顯著差異之硝 酸鹽含量樣本，共 177 株。第二部分實際建立檢量線之 200 株樣本則是使用 100 株自行種植具有差異之青江菜樣本與 100 株由頂好自有品牌、綠田農場與妙鷹有 機等單位生產之市售青江菜，目的為建立一條具有差異且可同時包含市售樣本特 徵之檢量線。
圖 3-1 自行於立體式植物工廠種植之青江菜
doi:10.6342/NTU201603425
21
3-1-2 青江菜粉
由於水分中於近紅外光處有較強的吸收，因此研究中尋找青江菜硝酸根特徵 波長時，尚需測量去除水分影響之青江菜菜粉光譜資訊。本研究之菜粉樣本是將 青江菜葉片先經化學比色法測得其硝酸根含量後，將其置入烘箱乾燥 12 小時待 其完全乾燥後，再使用磨粉機將乾燥之葉片研磨成粉末，並以每英吋 50 篩孔(50 mesh)過篩而得(圖 3-2)。不同濃度之樣本則是藉額外添加硝酸鈉粉末(Sodium Nitrate, NaNO3) 使其具有六種不同濃度樣本，分別為 3150、5000、10000、20000、
25000 與 30000 ppm，其中 3150 ppm 為未添加硝酸鈉之菜粉樣本濃度。
圖 3-2 自行製備之青江菜粉
doi:10.6342/NTU201603425
22
3-2 實驗設備
本研究使用三台不同廠牌之光譜儀進行實驗。其中兩台為不同廠牌之市售小 型光譜儀，另一台則是由 FOSS 公司所生產之 FOSS NIRSystem 6500 實驗室型分 光光度計。於找尋特徵波長的實驗當中，為求最準確之結果，僅以實驗室型光譜 儀作測量，其餘實驗則是以實驗室型儀器作為與小型光譜儀對照之標準。
3-2-1 實驗室型近紅外光分光光度計
本研究中所使用到之分光光度計為 FOSS 公司生產，型號為 FOSS NIRSystem 6500 (以下簡稱 NIRS 6500)之實驗室型分光光度計，其可測量之光譜範圍有兩部 分，波長介於 400~1098 nm，感測器材質為矽(Silicon)；波長介於 1100~2498 nm，
感測器材質為硫化鉛(PbS)，其測量之光譜間距為 2 nm，屬於單片式之感測器，
分光方式屬於前分光型。工作原理為先將光源藉由凹面光柵分離成單色光，再以 分光後的單色光經過樣本反射(reflect)或是透射(transmit)達到光感測器，透過濾 光鏡消除高階繞射階之光譜，並根據樣本與校正白板所接收到之光強度比值計算 出樣本光譜吸收度(absorbance)，並用光譜分析軟體 WinISI 進行分析，便可獲得 其特定成分值之資訊。其中 NIRS 6500 又可根據待測物的特性，分別裝設 Transport 套件以及 Rapid Content Sampler 套件量測。
3-2-1-1 Transport 套件
本研究測量液態樣本與使用比色法時，因需進行液體的透射式測量，因此皆 會採用 Transport 套件作為量測儀器(如圖 3-3)，在進行時須以光穿透率極高之透 明液槽(cuvette)(如圖 3-4)做盛裝。透明液槽之材質會根據不同量測波段而選擇不 同材質，於本儀器可測量之範圍 400-2498 nm 中採用的是玻璃材質液槽。此外根 據待測樣本的吸收度強度可選擇不同厚度之液槽，若是吸收度不夠高即可以增加
doi:10.6342/NTU201603425
23
液槽厚度來增加吸收度。本實驗中所需測量之液態樣本為具有強吸收之水溶液，
因此皆採用較薄之 1 mm 厚度液槽。圖 3-5 即為 Transport 套件中可放置 1mm 寬 度液槽之液槽架
圖 3-3 FOSS NIRSystem 6500 Transport 套件
圖 3-4 玻璃材質透明液槽
doi:10.6342/NTU201603425
24
圖 3-5 1mm 厚度之液槽架
3-2-1-2 Rapid content sampler 套件
於量測菜葉或是其他體積較大無法放入容器當中之樣本時，需使用反射測量 套件 Rapid content sampler 套件(文後簡稱 RCA)(圖 3-6)，套件中量測窗與光源處 於同一方向，因此待光源反射至樣本後便可將光資訊直接由量測窗內之八個感測 器接收(圖 3-7)。由於葉片較薄，量測時需在葉片上方以鍍金反射鏡覆蓋以確保 完全穿透樣本之光線可反射回感測器中。研究中測量粉狀樣本時則須以石英材質 之圓杯型透明液槽(small ring cup)作為樣本盛裝容器(圖 3-8)。
圖 3-6 FOSS NIRSystem 6500 Rapid content sampler 套件
doi:10.6342/NTU201603425
25
圖 3-7 RCA 套件之檢測窗
圖 3-8 菜粉盛裝於圓杯型透明液槽
圖 3-9 實際量測青江菜葉片
doi:10.6342/NTU201603425
26
3-2-2 市售小型光譜儀
本研究採用兩種廠牌之市售小型光譜儀，不同於實驗室型分光光度計，其分 光方式皆屬於後分光型。兩廠牌光譜儀之分光設備分別是鍍膜分光型 (文後簡稱 A 牌)與平面光柵分光型 (文後簡稱 B 牌)。本研究使用之三種光譜量測設備的規 格整理如表 3-1 所示，其中之 NIRS6500 雖有狹縫元件但因原廠資料未說明而未 列出。
3-2-2-1 A 廠牌光譜儀
A 牌光譜儀之感測器選用陣列式之多通道檢測器，光源為內建於光譜儀中之 兩顆鹵素燈泡。光線照射至樣本後便會反射通過經由鍍膜處理過之檢測窗，其目 的在於可確保使所有光波長都得以通過不被阻擋。其後再以光譜儀當中之線性可 變濾波鏡(LVF)將光線分為一連續之單色光，以銦鎵砷材質陣列型光感測器接收 讀取資訊，因此此種儀器的量測時間非常短，每一次測量僅需 1 秒以內，對於即 時性的測量十分有利。當中並沒有加裝可過濾高階繞射階之雜訊，因此可量測範 圍並不如實驗室型光譜儀分布廣，其能檢測範圍僅有 900 nm 至 1700 nm 之間，
而其因分光技術限制，解析度約為 6.25 nm。除可以內建光源做反射式之測量外，
此光譜儀附有透射套件，使其亦可使用外接光源，使光源以透射的方式穿過待測 物，再與反射式相同之擷取方式使光譜儀加以擷取光資訊，因此本研究於量測光 譜時同時會量測反射與透射之光譜資訊。
3-2-2-2 B 廠牌光譜儀
B 牌光譜儀相似於傳統光譜儀，以聚光透鏡將光源收集通過狹縫後以準值凹 面鏡將平行光線照射於平面光柵上後，便會因散射和干涉而分解為一系列波長之 單色光。於狹縫的選用上，其使用了寬度為 25 μm 之狹縫，可提升量測時之解析
doi:10.6342/NTU201603425
27
度，但同時也可能會因為進光量較少而造成信噪比的降低。其分光方式不同於傳 統方式，B 廠牌使用數位光源處理芯片(DLP)，以給予數位訊號之方式，將不同 波長之單色光單獨並依序的反射至半徑為 1 mm 之铟鎵砷材質 single chip 光感測 器。此方式減少了可以減少光譜儀所需之體積，亦可降低於分光結束後經過凹面 鏡反射至光感測器時所產生之雜訊，同時也可以藉此調整量測時所擷取的間隔，
而其能檢測範圍為 900 nm 至 1700 nm 之間。於感測器選用上以感測能力較好且 價格較低之 single chip 光感測器取代價格相對高之陣列型感測器，然而感測時間 會因此加長。
表 3-1 光譜量測設備之規格
儀器廠牌 狹縫(μm) 分光方式 感測器 聚光透鏡
Order Sorting
濾光鏡 分光類型
NIRS6500 X 凹面光柵 單片式 有 有 前分光
A 廠牌 未標明 線性濾波鏡 陣列式 有 無 後分光
B 廠牌 25 平面光柵 單片式 有 有 後分光
doi:10.6342/NTU201603425
28
3-2-3 台灣大學植物工廠
本研究依照實驗樣本需求的不同，分別使用台灣大學平面式植物工廠與立體 式植物工廠兩種不同的栽培環境做為樣本的種植環境。平面式植物工廠屬於半人 工光源型的植物工廠，平時可以使用太陽作為光照來源，當夜晚或是天候不佳時 則可使用人工光源達到補光之作用。種植時可以採用土耕以及水耕兩種種植方式，
使用水耕時可藉由台灣大學陳世銘教授實驗室所開發的養液恆定系統使養液當 中的 EC 值濃度與酸鹼值維持恆定；使用土耕時則須以人工澆水的方式種植，然 而其優勢在於可直接購買育苗場所販售之菜苗進行種植，對於縮短種植時間有著 顯著的幫助。
立體式植物工廠則是屬於人工光源型植物工廠，係以人工光源取代陽光，因 此可以完全控制光源所提供給植株之光週期與光強度，種植之層架也可不受陽光 限制而重疊，以增加產量。於其內設有控制生長溫度、濕度與二氧化碳濃度等參 數之感測器，可利用其中之設備將此些條件做控制，除避免不必要之干擾外亦可 徹底調控植物的生長環境，使植物不受外界影響，以利於栽培出較無因生長環境 而產生差異之樣本。
3-3 實驗方法
3-3-1 標準品配置
本研究使用純度為 99%之硝酸鈉(Sodium Nitrate, NaNO3)作為配置標準品之 材料，溶劑則是使用逆滲透濾水機過濾後之純水。尋找特徵波長時，需有分布範 圍較大之標準品才可建立有較高可信度之成果，然而尚需考慮實際合理範圍之濃 度，因此在配置硝酸鈉標準溶液時所採用的濃度範圍為 3000、10000、20000 與
doi:10.6342/NTU201603425
29
30000 ppm，共四個樣本。其中為了降低量取藥品時所產生的隨機誤差，調配時 皆是先調配出最濃之樣本後再依序稀釋成較低的濃度。
3-3-2 青江菜栽培
在尋找硝酸鹽特徵波段實驗時所使用之青江菜，乃種植於立體式植物工廠，
其栽種方式為水耕。此種植青江菜時須分為兩個階段，第一階段為育苗。將種子 泡水冷藏數小時後取出，以打破種子的休眠機制。其後再將每 2 至 3 顆種子塞入 育苗專用之海棉中，並使其可充分接觸到水分與空氣。待種子發芽後，留下一健 康之菜苗並將其餘之苗剔除，確保菜苗擁有足夠的生長空間，需耗費約為兩週。
第二階段則須待幼苗之根部生長至足夠長度後，將各株移至具有充足空間之生長 層架上。本實驗栽種時分為硝酸鹽含量低中高三組，調配其生長養液時需利用測 量養液中的 EC 值來得知濃度，低中高三組分別給予 0.8 mS/cm、1.6 mS/cm、2.4 mS/cm 之養液濃度。光強度不足會照成植物生長不健全而因此累積過多硝酸鹽於 植株中，因此除養液濃度差異外，三組之光強度亦分別給予明顯之低中高三種區 間，以便區分出三種不同之生長環境。圖 3-10 為研究於台灣大學植物工廠種植 青江菜之情形。
圖 3-10 於台灣大學立體式植物工廠種植青江菜之情形
doi:10.6342/NTU201603425
30
為減少種植所耗費之時間，本研究於實際建立檢量線時所使用之青江菜樣本 乃直接購買西螺全民種苗場所販售之青江菜苗，並移植至台灣大學平面式植物工 廠，以土耕法種植而成(圖 3-10)。種植期間將 100 株樣本分為三組，分別施以 0.8 mS/cm、1.6 mS/cm、2.4 mS/cm 之養液濃度，光照強度則是給予前兩組充足之光 源，最後一組施予不充足之光源，期望藉由此環境差異培育出三組具有顯著硝酸 鹽含量差異之青江菜樣本。
圖 3-11 於台灣大學平面式植物工廠種植青江菜之情形
3-3-3 化學比色法
為取得青江菜葉片中之真實硝酸鹽濃度，本研究參考 Cateldo et al. (1975)之 化學比色法作為測定方式。以硝酸鈉當中之硝酸根作為檢測對象，配置濃度為 0、
2、4、6、8、10 mM 共六組標準品，以 Foss NIRS 6500 搭配自動傳送配件測量，
以此建立化學實驗呈色後之硝酸鹽溶液與光譜吸收度之標準關係式。
然而因為比色法可量測的濃度限制僅位於 0-300 ppm 內，因此本研究為使所 有樣本皆能夠使用比色法做量測，研究中測量完青江菜葉片之光譜值後，所有樣
doi:10.6342/NTU201603425
31
本皆會打碎並以 Merck 硝酸鹽試紙先行測量其約略之硝酸鹽含量，並依照此結 果加水稀釋，使硝酸鹽值調整至比色法可量測之範圍後，再使用與測量標準品相 同之化學處理程序，待其呈色後，藉由測得其呈色程度便可帶入標準關係式，得 知樣本之真實硝酸鹽含量。
3-3-4 光譜資訊擷取
擷取光譜資訊可分為制式光譜儀與小型光譜儀兩個部分。使用 NIRS 6500 儀器時，需先開機 1 小時使鹵素光源及電路板達到暖機狀況，在暖機後必先進行 校正後才可量測，以確保光源與儀器的穩定。以透射方式量測液態樣本時，需搭 配原廠 Transport 套件，測量以光路徑 1 mm 之玻璃液槽盛裝的待測物之透射吸 收光譜，擷取資料採 32 次之平均值；測量葉片樣本時需搭配 RCA 套件以反射方 式做測量，測量時須將葉片平放於檢測窗口，其上方覆以具有全反射功能之鍍金 反射鏡，防止光線若穿透過葉片時光資訊漏失之情形，隨後蓋上儀器外蓋使內部 成為一不受干擾之暗室後即可擷取資訊，擷取之資料亦為 32 次之平均值。
其二為使用 A、B 兩種廠牌之小型光譜儀測量。A 廠牌於測量時分為反射式 與透射式兩種測量，兩者皆須以 USB 接頭連接電腦操作，本研究兩種方法皆有 進行，並比較兩者之檢測效果。以反射式測量葉片時，需使用反射式探頭配件，
目的為使光源與待測物之間保持固定的距離，使量測之訊號為最高。其採用光源 為兩顆內建之鹵素燈泡，測量前須先量測暗電流與標準反射白板以進行校正。以 透射式測量葉片時，須將軟體中測量模式改為透射式，使光譜儀內之光源關閉，
並將光譜儀之探頭替換為具有光源之透射式探頭配件。反射與透射式的所有量測 值皆為 32 次測量之平均值。
B 廠牌之光譜儀測量時以 USB 連接電腦並搭配軟體進行測量，軟體亦可進 行量測參數修改，如：量測時間及量測次數等。參數設定完畢後可使用內建電池 作為電源進行去除 USB 連線之單機量測，量測時以藍芽技術將數據傳輸至攜帶
doi:10.6342/NTU201603425
32
裝置(如手機)。使用前光譜儀會自行控制線性可變濾波鏡使其全數 DMD 皆轉為 OFF 模式進而測量儀器之暗電流，而白板校正則是可以選擇使用原廠之內定數據 與使用自行量測之白板數據，利用暗電流及白板數據便可完成光譜儀之校正，即 可進行測量。此光譜儀僅可測量反射之光譜訊號，量測時須將葉片放置於檢測窗 上並按下量測按鍵，內建之光源便會照射至樣本並擷取其光譜資訊，其量測值與 其他兩種光譜儀設定相同，皆為 32 次之平均值。
3-3-5 小型光譜儀基本性能
本研究期望比較的性能有信噪比(SNR)、動態範圍(DR)、資料間隔數、量測 時間、雜訊穩定度與波形比較。然而由於 A、B 兩牌光譜儀因為制式之儀器，並 無法自行改變量測時內部之設定，無法自由控制光源與感測器，因此於本研究中 暫不討論。
研究於實際測量光譜時皆採用光譜儀之建議資料間隔數，A、B 牌分別為 6.25 nm 與 10.53nm，儀器之解析度越小代表其可分辨光資訊的能力越強，然而對於 有使用狹縫之儀器，於文獻 Norris(1998)中提及，狹縫寬度大之光譜儀量測吸收 光譜，雖會降低其解析度，然而卻可增加光強度而降低雜訊的影響，可有效提升 信噪比，因此解析度並不盡然為越精細越好。量測時間則為每次量測(掃描 32 次 之平均)時所需的時間，A、B 兩台個別為 1 秒與 3 秒，皆屬十分快速。而研究中 雜訊的穩定度是採用 FOSS NIRSystem 公司所使用的標準量測方式，使儀器重複 量測標準白板 10 次，以計算每一次所擷取到之訊號之間的雜訊大小。其中會計 算其 P-P 值(Peak to peak noise)、吸收度極值與其波長所處位置、Bias 值與每次 訊號之 RMS 值，以此判斷光譜儀本身所產生的雜訊多寡。其中 PP 值為每次測 量的訊號最大值與最小值間的差異；Bias 值則是將每次所測量到的光譜資訊平均 後計算其與基準線之差異；RMS 值則是將光譜訊號對於基準線做方均根計算所 獲得之數值。根據 FOSS 公司之標準，光譜儀之各參數值位於不同波段時之限制
doi:10.6342/NTU201603425
33
標準並不相同，因此比對時須特別確認測量範圍。於波長的準確度測試中，本研 究以實驗室型光譜儀作為基準，分別比較 A、B 兩台光譜儀之波長位置偏移而 得。
3-3-6 特徵波長尋找
本研究用於尋找近紅外光光譜區之硝酸根特徵波長所採用之方法，係根據 NIRS System Inc.所提供之資料並加以調整。其步驟分為下列 5 大項：
(1)辨識吸收波段 (2)確認吸收波段
(3)由相關性判斷吸收波段 (4)由散佈圖找出離群樣本 (5)模式驗證。
決定對象物吸收波段時，須先依序辨識其原料、標準品以及合成物之光譜值，藉 由逐漸疊加吸收訊號之方式，來判斷其特徵吸收波段所在位置。此外分析時會採 用二次微分處理以降低儀器所產生之基線漂移情形，並同時加強光譜特徵與突顯 吸收波段之位置。決定吸收波段後會以少量可代表成份各種濃度範圍之樣本作為 檢測對象，確認第一步驟所獲得之吸收波段是否具代表性。第三步驟會以光譜吸 收度與成分值作相關性分析，藉此結果判斷成分濃度與吸收度存有相關聯之區域，
若相關性曲線之值接近±1.0，寬度也需大於 5 nm 者，即可代表此波段存在光譜 分析之最佳波段。建立預測模式後會使用散佈圖描述濃度量測值與計算值之關係，
目的為確定光譜吸收度與成分濃度值之線性關係，亦可於可接受範圍內剔除離群 樣本以及異常源所在。最後會使用一組未參與建模之樣本，帶入模式並預測其濃 度值，藉兩者之誤差值判斷此模式之預測能力。
doi:10.6342/NTU201603425
34
3-3-7 光譜資訊分析
本研究使用 FOSS NIRSystem 公司之光譜分析軟體 WinISI (1.02a 版本)進行 光譜分析。將經過比色法分析後的硝酸鹽值做為化學標準值，將光譜儀所測得之 光譜資訊以數學前處理過後，再使用多重線性回歸以及最小平方回歸做定量分析，
建立青江菜硝酸鹽含量之光譜檢量線。
3-3-6-1 數學前處理
由於光柵分光之光譜儀很難做到等間隔或固定間隔之光譜數據量測，同一廠 牌之光譜儀甚至會出現光譜數據之間隔不一致的狀況，若以此種未經間隔標準化 之光譜數據建立之檢量線，只能應用於量測光譜數據之同一台光譜儀上，無法提 供給其他光譜儀使用。為消除此情形本研究採用 Cubic Spline 數值方法將光譜數 據針對間隔之點數進行標準化，將所有光譜儀之光譜數據以數學內插法轉換成 2 nm 等間距之光譜數據，此方法也稱為 resampling。
處理完成 resampling 後，尚須消除量測光譜之高頻雜訊及基線飄移現象，因 此本研究使用平滑化與微分兩種數學處理。平滑化可消除光譜之高頻雜訊，平滑 化點數越多，能消除的雜訊越大，但過度處理則會使隱藏其間之訊號也一併被除 去。微分則可消除光譜的基線飄移並放大其信號。微分間隔越大，信號放大也越 多，但雜訊同時也會放大，通常會先進行平滑化再進行微分處理。數學處理方法 通常會以四個數字做為表示，其中的第一個數字代表微分數（0 代表 0 次微分；
1 代表 1 次…），第二個數字則是表示微分時所取的間隔數，第三個數字表示平 滑化所取之點數，第四個則是表示二次平滑化點數。
doi:10.6342/NTU201603425
35
3-3-6-2 多重線性回歸(MLR)
MLR 為一常見的多變數分析方法，藉由利用光譜中多個波長的吸收度，以 線性回歸的方式建立檢量線以預測化學分析所得之成分濃度值。一般回歸公式如 式 3-1：
C = 𝑘
0+ ∑
𝑛𝑖=1𝑘
𝑖𝑋
𝜆𝑖 (式 3-1) C 為待測成份含量之預測值；k0、ki為迴歸係數；Xλi則是在波長λi時的光譜 值，此光譜值可以是原始光譜值、一次微分光譜或者是二次微分光譜。希望藉由 嘗試不同次數之微分及不同點數之平滑化的數學處理，達到我們想要的目標，也 就是讓其中波段的相關性達到更高，雖然可能會損失部分的資訊，但我們可透過 數據衡量其利弊。藉由微分之方式我們亦能消除使用原始光譜時可能出現的基線 飄移現象，故理論上其預測結果應會較原始光譜之結果好。其中分析模式分為 Step-wise 與 Step-up 兩種，Step-wise 模式是利用淨偏相關係數高的波長與偏 F 統計量作為選擇特徵波長的依據，使軟體自動計算出最好的結果，並得知最好的 波長組合，然而有時可能會因為將雜訊納入訓練而產生過適化(over-fitting)之情 況；step-up 模式為在選擇最佳波長時，可藉由待測物之物理性質加入人為之判 斷，以減少過適化之產生。3-3-6-3 部分最小平方回歸(PLSR)
部分最小平方回歸(PLSR)為一廣泛運用於化學與工程領域之計量學標準工 具(Wold et al., 2001)。PLSR 之運算是使用某段波長範圍之所有吸收度以抽取其 特徵並與濃度關聯進行分析。這些特徵為原始吸收光譜的線性轉換，可以代表原 始吸收光譜之吸收度，並可減低原始吸收光譜之多重共線性、雜訊及無關因子的 影響。應用 PLSR 模式的時候，主要在做因子數(number of factors)的決定，越多 的因子數將可以提供越多的資訊，然而當因子數高於某個數量後，將會造成系統
doi:10.6342/NTU201603425
36
的過適化，因此在找尋最佳光譜前處理及最佳光譜波段選擇時，本研究採用交互 驗證(cross-validation)的方法進行分析，以避免模式過度擬合。
3-3-6-4 檢量線建立
以任何統計方法建立檢量線時，皆須將所有已知化學值之樣本分為校正組與 驗證組。其中用以建立檢量線之校正組須包含所有樣本當中之最大值與最小值，
且數量需要大於驗證組的兩倍。驗證組則是用來驗證檢量線能力使用，其樣本不 能參與訓練(即校正建模)，以避免為了追求較好的預測能力而使得數據因為過度 訓練而產生過適化的結果。
其中常見的回歸分析指標有 rc、SEC、rv、SEV、RPD 值等，可藉由這些指 標判斷檢量線好壞，其公式與定義如式 3-2 至式 3-4。
rc： Correlation Coefficient of Calibration，校正組中實際值與預測值之相關 係數。最高值與最低值分別為 1 與 0。
SEC： Standard Error of Calibration，校正組中之標準誤差。代表檢量線對於校 正組當中各樣本的預測值與實際值之平均誤差，與 rc值可共同作為一判 斷指標。此值越小即可代表檢量線的預測結果越理想。
rv： Correlation Coefficient of Validation，驗證組中實際值與預測值之相關係 數。用來判定由校正組所建立之檢量線是否為可使用的指標。最高值與 最低值同樣分別為 1 與 0。
SEV： Standard Error of Validation，驗證組當中之標準誤差。代表檢量線對於 驗證組當中各樣本的預測值與實際值之平均誤差，與 rv值可共同作為依 判斷指標。此值越小即可代表檢量線的預測結果越理想。
RPD： Ratio of Performance to Deviation，以驗證樣本之標準差除以檢量線之標 準誤差。其可代表檢量線計算時之誤差相較於樣本本身之差異性是否明
doi:10.6342/NTU201603425
37
顯，RPD 值越大代表預測結果所產生的誤差影響就越小。
SEC = √𝑛−11 ∑𝑛𝑖=1(𝑌𝑖 − 𝑌𝑐𝑖)2 (式 3-2) SEV = √𝑛−11 ∑𝑛𝑖=1(𝑌𝑖 − 𝑌𝑣𝑖)2 (式 3-3)
RPD =𝑆𝐸𝑉𝑆𝐷 (式 3-4)
其中 n 為樣本個數，Y 為標準之成分值，Yc為校正組樣本之結果，Yv為驗證組 樣本之結果，SD 為驗證樣本之標準差。
doi:10.6342/NTU201603425
38
第四章 結果與討論
4-1 市售小型光譜儀檢測結果
4-1-1 小型光譜儀性能比較
A 牌光譜儀採用陣列型光感測器，於測量其暗電流時，陣列中每一個光感測 之感光元件皆會測得一暗電流資訊，因此可採用 RMS 之方式算出其暗電流雜訊，
以其感測器之最大測量量除之便可得其動態範圍。然而相異於 A 牌光譜儀，B 牌光譜儀則是使用了單晶片之光感測器，因此在測量暗電流時 B 牌光譜儀其僅 會出現一個暗電流之訊號，並無法以相同基準計算其動態範圍。此外又因 B 牌 光譜儀並無法如傳統光譜儀單獨控制其內部之光源與感測器，且其內部有自動調 整訊號放大倍率之功能，無法順利測量信噪比。信噪比與動態範圍雖為常用於測 量電子儀器之參考，然而於此因上述原因並無法順利將此二項目進行比較。
根據 FOSS NIRSystem 用於儀器的 Photometric Noise 的檢測方法，本節使用 三台光譜儀分別測量 10 次白板之光譜資訊，其中由於 RCA 可量測之波段較廣，
因此其內部測試時會將波長分為四個區段做測試，分別為 400-700 nm、700-1100 nm、1100-1700 nm 與 1700-2500 nm。因此於比較時選擇以最接近 A、B 兩牌量 測範圍(950-1650 nm)之區段 1100-1700 nm 做為比較依據，表 4-1、表 4-2 與表 4-3 分別為實驗室儀器 RCA、A 牌光譜儀與 B 牌光譜儀之檢測結果。
初步先由三者極值出現的波長位置可以觀察到 B 牌有明顯的差異存在，其 中極大值的波長位置甚至發生了由 950 nm 左右跳至 1600 nm 左右之狀況，而其 最大值與最小值發生的位置也非常接近，表示其訊號的跳動應該較為嚴重。而 RCA 與 A 牌之極值所在位置較為固定，其中又以 A 牌最為一致，然而其原因應 為其採用鍍膜分光方式，並不需要任何機械作動所致，RCA 因為量測時尚須旋
doi:10.6342/NTU201603425
39
轉其內部之光柵，推測會因此造成些許的數據變動。
表 4-4 為統計三種儀器檢測而得之結果，由檢測結果發現三者之量測結果皆 以 RCA 為最佳，其次為 A 牌，最後為 B 牌。其中 Foss 公司於此段波長(1100-1700 nm)所規範的 P-P 值、Bias 值與 RMS 值之建議值分別為 0.00015、0.0001 與 0.00002 nm 以內，三台之中僅有 RCA 符合其規範，然而 A、B 牌之光譜儀皆屬於非實驗 室型之手持式儀器，因此此規範之數據可作為比較之用。
由三台之 P-P 值可看出 A 牌的雜訊抖動幅度約為 RCA 之 10 倍左右，而 B 牌則約為 50 倍，對於此結果可看出 A、B 兩牌於量測時所出現之雜訊規模較大，
於預測能力將會有一定的影響。而從 Bias 之數值可發現 A 牌所測得之平均偏移 量僅大於標準值之 3 倍，相較於 B 牌之結果較為理想，其中 A、B 牌間約有 50 倍之差距，推測 B 牌於量測時基線漂移的情形應會較為嚴重。量測訊號的 RMS 值亦有如 Bias 之相同情形，B 牌之數值皆較高於 RCA 與 A 牌光譜儀，其最高有 達到 0.016 nm，訊號抖動的程度較大，量測時之雜訊問題應較為嚴重。
此外，綜觀連續測量 10 次之數值可以觀察到 B 牌之 P-P 值、Bias 值與 RMS 值幾乎皆具有隨著測量次數的增加而變大之趨勢，此項發生之原因推測為儀器內 部熱的堆積所造成。由於光源的照射與儀器內部的原件所產生的熱會有堆積的情 形，因此會使得雜訊逐漸增大。然而 RCA 因為為實驗室儀器之關係，需經過溫 機使溫度穩定後才可量測，雖有熱堆積的狀況發生，但因其溫度已達穩定的緣故，
此種隨著測量次數的增加而變大之趨勢並不明顯。而 A 牌之光譜儀較沒有出現 此現象之緣故推測為其測量時間短，約僅有 1 秒，因此從表 4-2 較無法觀察到此 現象，但若是持續測量一段時間，內部的光源勢必會產生熱堆積之情形。
