2.1 質體的構築
2.1.1. 模板質體來源pCB-D3，此重組質體由實驗室胡賢屏博士所建構 (Hu et al., 2007)，包含 DENV3 C101-114作為訊號胜肽，能夠表現完整的DENV3 PrM 蛋白質以及 DENV3 E 蛋白質，本研究所構築之點突變質體皆以此重組質體當作骨架。
2.1.2. 登革病毒 E 蛋白質之定點突變質體建構（site-directed mutagenesis）
選定欲突變的胺基酸位置，設計一條正向引子（primer），使用此引子以pCB-D3 作為模版進行聚合酵素鏈鎖反應（polymerase chain reaction，PCR），PCR 反應條 件及溫度條件如下：
單一PCR 反應條件：
100 ng/μl DNA 1 μl
10x PFU buffer 2.5 μl
5 μM primer 2 μl
10 mM dNTP 0.5 μl
2.5 U/μl Turbo PFU
（Sstratagene，La Jolla，CA） 0.5 μl
100% DMSO 1.25 μl
Nuclease-free water
( Promega，Madison，WI) 17.25 μl
total 25 μl
溫度條件：
待反應結束後，在產物中加入1 μl Dpn I 限制酶酵素，37℃ 作用隔夜，使模 版被切割清除，之後取10 μl 產物轉形（transformation）至 DH5α中表現質體 DNA。
在所得之質體DNA 上，選擇適當的限制酶酵素，切割出包含有點突變位置的 DNA
片段（約300 b.p.~1000 b.p.），利用接合作用（ligation）連結到被相同的限制酶酵
素所切割的pCB-D3 載體上，以確保除了所選定之突變胺基酸以外的序列正確性。
2.1.3. 引子
本實驗所使用之引子皆以 QuikChange® Primer Design Program 設計，為 Invitrogen Life Science 所合成，詳見表一。
2.1.4. 定序分析
本實驗所構築之質體序列分析由台大醫院醫學研究部第二共同研究室以核酸 自動定序儀（ABI 3730 genetic analyzer）定序。
2.2 菌種
2.2.1. 菌株使用大腸桿菌 E. coli DH5α，以 LB 培養基溶液（DifcoTM，Sparks，MD）培 養於37℃。
2.2.2. 製備勝任細胞（competent cells） mM KOAc，10 mM CaCl2，50 mM MnCl2，100 mM RbCl，15% Glycerol，pH5.8）
緩慢地將細菌混合均勻，在冰上靜置2～3 小時，之後以 3000 rpm，4℃離心 10 分 鐘，倒去上清液，以TFB2 溶液（10 mM MOPS，75 mM CaCl2，10 mM RbCl，15%
Glycerol，pH 6.5）緩慢地將細菌混合均勻，在冰上靜置 10 分鐘，分裝到 1.5 ml 微量離心管中，儲存於-80℃冰箱。 Plasmid MiniPrep Purification Kit（GeneMark Technology，Taipei，Taiwan）純化小 量質體DNA。
2.5 製備大量質體
挑取單一菌落培養於4 ml 含適當抗生素的 LB 培養液，37℃培養隔夜，加入 到400 ml LB 培養液，繼續培養約 16~18 小時，以 6000 rpm，4℃離心 30 分鐘，
利用QIAGEN tip-500 Kit（Qiagene，Valencia，CA）純化質體 DNA，純化出的質 體利用分光光度計測量吸光值並計算出濃度，配製成1 μg/μl 之濃度保存在-20℃以 備用。
2.6 細胞培養
293T 細胞（human embryonic kidney cell line，SV40 Large T transformed）培養 於含10% 胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS；Biological Industries，Kibbutz Beit Haemek，Israel），1% Penicillin / Streptomycin（GIBCOTM Invitrogen，Grand Island，
NY），2% HEPES（GIBCOTM Invitrogen，Grand Island，NY）之 DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/High glucose；Hyclone，Logan，Utah）培養液。細胞置 於37℃，5% CO2培養箱內，約2 天繼代培養一次。
2.7 細胞轉染試驗（transfection）
利用磷酸鈣( calcium phosphate) 將重組質體 DNA 轉染至細胞內。進行轉染作 用前一天將適量細胞種植於6 孔盤或直徑 10-cm 細胞培養皿，於轉染作用前 4 小 時置換新的培養液( 6-well 加 2 ml，10-cm dish 加 8 ml)，使細胞處於相同酸鹼度 的環境。
轉染前配製轉染混合物，各物質混合之比例如下：
6-well 10-cm dish Nuclease-free water ( Promega，Madison，WI) 88 μl 260 μl
DNA （1 μg/μl） 2 μl 10 μl Protease Inhibitor；Roche，Mannheim，Germany）將細胞溶解，以 13000 rpm，4
℃ 離心 30 分鐘，保留上清液，儲存於-80℃，以進行下一步分析。
0.2 M Tris pH7.0，20% glycerol，0.4% bromophenol blue），混合均勻後，95℃加 熱2 分鐘，取 4 μl 進行蛋白質電泳，將膠片組合於電泳槽，使用電泳緩衝液液（25
mM Tris，250 mM Glycine，0.1% SDS）以 80 V~120 V 進行電泳。跑完膠後，使 用轉印緩衝液（25 mM Tris，250 mM Glycine，20% Methanol），以固定電流250 mA，
1 小時，將膠體上的蛋白質轉印到硝化纖維紙（HybondTM-C Extra，GE-Amersham，
Buckinghamshire，UK）上，轉印結束後以 amido black 溶液（0.1% amido black，
10% methanol，2% acetic acid）染色，之後以 blocking buffer （4% non-fat milk in 1x washing buffer）室溫處理 1 小時，加入一級抗體，4℃ 反應至隔夜，以 washing buffer
（10 mM Tris-HCl pH7.4，0.9% NaCl，0.2% Tween 20）清洗 3 次，每次 10 分鐘，
加入二級抗體，室溫反應1 小時，再以 washing buffer 清洗 3 次，最後使用 ECL
（PerkinElmer life science，Boston，MA）呈色，以 X 光片感光顯影。
2.9 影像分析軟體
UVP Vision Works LS software（UVP，Upland，CA）。
2.10 超 高 速 離 心 分 離 重 組 次 病 毒 顆 粒 （ sucrose cushion ultracentrifugation）
質體DNA 轉染至細胞約 2 天後，收集三個 10-cm dish 之培養液約 30 ml 至 50 ml centrifuge tube，以 2500 rpm，4℃離心 20 分鐘，取上清液以 0.22 μm filter
（Millipore，Billerica，MA）過濾至高速離心管（Beckman Coulter，Fullerton，CA），
從管底緩慢加入3.5 ml 之 20% sucrose，以精秤平衡各高速離心管重量，須精確至 0.001g，以 SW-28 rotor（Beckman Coulter，Fullerton，CA）19000 rpm，4℃離心 5 小時，之後倒去上清液，將高速離心管倒放在擦手紙上，去除多餘液體，再以拭 鏡紙沿管壁但不碰觸到底部擦拭乾淨，以45 μl 的 1X PBS（Dulbecco’s phosphate buffered saline,，GIBCOTM Invitrogen，Grand Island，NY）回溶，保存於-80℃。
2.11 抗原捕捉酵素連結免疫分析法（Ag-capture ELISA）
以coating buffer（15 mM Na2CO3，35 mM NaHCO3，pH 9.5）稀釋兔子抗 DENV3 血清（由美國 CDC 張光正博士提供)，取 50 μl 稀釋抗體加至 96 孔平底盤
（Nunc-Immuno™ 96 MicroWell™ Plates，Nunc，Roskilde，Denmark），於 4℃靜 置隔夜，使抗體吸附在底部，之後倒掉抗體溶液，於擦手紙上將殘餘的液體盡量 拍乾，加入400 μl StartBlock blocking buffer（Thermo，Rockford，Il.）室溫處理 1 小時，倒掉blocking buffer，將殘餘的液體拍乾，加入 50 μl 重組次病毒顆粒（virus like particles，VLPs）稀釋液（以 blocking buffer 稀釋），於 37℃作用 2 小時後，
倒掉溶液，以washing buffer（10 mM Tris-HCl pH7.4，0.9% NaCl，05% Tween-20）
清洗4 次，將殘餘的液體盡量拍乾，加入一級抗體，37℃作用 1 小時後，以 washing buffer 清洗 4 次，拍乾殘餘液體，加入二級抗體於 37℃作用 1 小時，以 washing buffer 清洗6 次，拍乾殘餘液體，加入 100 μl TMB（KPL，Gaithersburg，MD）溶液呈 色10~15 分鐘，加入 100 μl 2N H2SO4終止反應，以Microplate Reader（Bio-Tek Instruments，Inc.， Winooski，VA）測量 O.D.450 及 O.D.650。
2.12 病人血清
實驗中所使用之病人血清由高雄醫學大學附設醫院熱帶醫學中心蔡季君主任 提供，包含10 個 DF 病人血清，這些病人之發病日在 2006 年，血清採集於 2008
年，其中1 個是初次感染案例，9 個為二次感染案例。
2.13、單株抗體
1. FL0231：能夠辨認四型登革病毒 E 蛋白質，購自 Chance Biotechnology（Taipei,，
Taiwan)。
2. FL0232：能夠辨認四型登革病毒 E 蛋白質，購自 Chance Biotechnology（Taipei，
Taiwan)。
3. 4G2：融合瘤細胞株（hybridoma cell line）4G2 產生的單株抗體（IgG2a）能夠 辨認四型登革病毒的E 蛋白質（Gentry et al., 1982），由免疫所伍安怡老師實驗室 所提供。
4. DC9-6、DC12-3、DC7-3：能夠辨認二型以上登革病毒的 E 蛋白質，由中研院細 胞與個體生物研究所吳漢忠老師實驗室所提供。
5. DC6-3：能夠辨認 DENV3 的 E 蛋白質，由中研院細胞與個體生物研究所吳漢忠 老師實驗室所提供；