E 蛋白質對於誘發中和性抗體以及保護性免疫反應扮演重要角色(Bray et al., 1989; Kaufman et al., 1987; Men et al., 1991; Roehrig et al., 2001) ，在人體感染登革 病毒後針對病毒抗原所誘發的免疫反應中，E 蛋白質也被證實是主要的免疫原
（immunogen），初次感染 DENV2 即可誘發產生大量（>90%）具交叉反應的抗 E 抗體 (Lai et al., 2008)。先前許多文獻中，對於抗 E 抗體的辨識部位之研究以
是否因alanine 點突變而受影響，結果發現 flavivirus group-reactive 單株抗體（4G2、
FL0231 和 FL0232）所辨識的胺基酸皆位於 E 蛋白質上序列高度保守的 fusion loop 上（圖三），這項結果與實驗室先前以DENV1 PrM/E 質體為骨幹的研究結果具有 一致性（圖四），影響flavivirus group-reactive 單株抗體結合能力的胺基酸點突變 在DENV3 和 DENV1 之間互相符合（DENV1 之點突變 104GA 未分析），在其他 研究也有對於fusion loop 包含 flavivirus group-reactive 之抗體辨識部位的報導，例 如Crill et al 使用 flavivirus group-reactive 之老鼠單株抗體來研究，找到 DENV2 E 蛋白質有影響的胺基酸點突變在104G，106G，107L (Crill and Chang, 2004)；Chiou et al 的研究發現 JEV E 蛋白質之 106G 及 107L 的點突變可以降低交叉反應(Chiou et al., 2008)； Stiasny et al 也報導 TBE 之 fusion loop 為 flavivirus group-reactive 單株 抗體的辨識部位(Stiasny et al., 2006)。
過去的研究指出complex/subcomplex-reactive 單株抗體的抗體辨識位在 domain
III 上，曾經被報導的位置包括 DENV1 的 307K，308L，309E，310K，311E，312V，
387L，389L，391W (Lisova et al., 2007)，DENV2 的 305K，307K，310K，311E，
312I，332P，364P，389L，391W (Crill et al., 2009; Gromowski et al., 2008)，DENV3 的306L，308K，381G，387I，389W（等同 DENV1 之 308L，310K，383G，389I，
391W）(Matsui et al., 2009)，在本研究中有兩個 complex/subcomplex 單株抗體
（DC9-6，DC12-3）之結合能力都受到 312V，389I，391W 點突變的影響，其他 胺基酸點突變包括310K，311E，329E，383G 也會影響 DC9-6 的結合能力（圖五）。
DC12-3 是以 DENV3 為免疫原而引誘產生可以辨識 DENV1，DENV2 和 DENV3 之E 蛋白質的單株抗體，因此實驗室先前也以 DENV1 為骨幹分析 DC12-3，受影 構形（conformation）因而影響 DC9-6 的結合能力。
大部分對於黃病毒的研究結果顯示domain III 包含了 type-specific 的抗體辨識 部位 (Beasley and Barrett, 2002; Crill and Roehrig, 2001; Gromowski and Barrett, 2007; Oliphant et al., 2005; Roehrig et al., 1998; Sukupolvi-Petty et al., 2007)，有趣的 是，本研究使用DENV3 type-specific 單株抗體 DC6-3 進行分析，結果發現 domain III 上這些胺基酸並不影響結合能力，反而 domain I 之胺基酸突變（17G，172E，
290D）才造成結合能力下降（圖六），這三個胺基酸彼此的相對位置相當靠近（＜
30Å），因此可能是抗體所能辨識的區域，這個發現代表一個位於 domain I 的抗體 辨識部位。
初次感染（圖九）和二次感染DENV3（圖十，圖十一）的 DF 病人恢復期血
E 抗體則主要受到 domain II 之 101W，104G，108F 這些位置 alanine 點突
變的影響，其中兩個病例則受到domain I 之 172EA（圖十 E，圖十一 B）的影響，
顯示血清中的抗E 抗體主要辨識部位在 E 蛋白質之 domain II fusion loop 上，這項 結果類似之前對於WNV，TBE 及 DENV2 (Crill et al., 2009; Lai et al., 2008; Oliphant et al., 2007; Stiasny et al., 2006) 的研究結果。 VLPs 建立 capture ELISA system 來做分析，由於 VLPs 在結構及生化特性上與病毒 顆粒相似，很適合作為抗原來研究抗E 抗體的結合能力，並且為了維持 VLPs 結構 上的完整性，本研究不使用傳統的 3-layer ELISA system，而改以 coating 兔子抗 DENV3 抗體取代 coating 病毒抗原蛋白；另一方面，在分析之前我們使用 mixed mAbs 來對每一個 VLPs 作定量（圖十二Ａ），此步驟同時可以確保胺基酸的突變 不影響VLPs 整體的結構。
綜合先前實驗室對於DENV1 和 DENV2 之病人血清中抗 E 抗體之研究以及本 實驗對DENV3 的分析結果，101WA 及 108FA 突變會降低抗 E 抗體結合能力，在 VLPs 上同時將 101W 和 108F 置換成 alanine，或者表現 101WA-106GA-108FA 之 VLPs，從 capture ELISA 分析結果，這兩個突變之 VLPs 相較於 WT 之 VLPs 會降 低DENV3 感染之病人血清（DF89，DF92，DF102，DF90）中抗 E 抗體之結合能 力（圖十二中、圖十三上）；另一方面，305T，384D 被報導是 DENV2 type-specific 抗體辨識部位(Gromowski and Barrett, 2007; Sukupolvi-Petty et al., 2007)，在本研究
中，以 305TA-384DA 之 VLPs 進行分析，則發現不影響血清（DF89，DF92）中 抗E 抗體之結合能力（圖十二右），顯示可以辨認 305T 及 384D 這類 type-specific 抗體辨識部位的抗E 抗體在血清中所佔的比例極少。綜合比較西方墨點法和 capture ELISA 之分析結果，顯示兩個研究方法之結果有相同的趨勢。其中 DF92 與 DF90 之西方墨點法結果雖然顯示 101WA 及 108FA 不影響抗 E 抗體結合能力，而其 capture ELISA 結果卻看到突變之 VLPs 中度影響結合能力，這些結果說明，有一 些抗體辨識部位可能具有協同作用的特性，因此單點突變不足以影響抗體結合。
以上之實驗結果顯示在DENV3 感染之病人血清中主要的抗 E 抗體辨識部位在 fusion loop（101W，108F）上，進一步分析這群抗 E 抗體在所有抗 E 抗體（IgG）
中所佔的比例，初次感染 DENV3 病人血清中的抗 E 抗體約有 70%，二次感染 DENV3 病人血清中的抗 E 抗體約有 20 至 70%不等（平均 45%），而根據 Crill et al 對於感染DENV2 之 DF 病人血清的分析，一次感染 DENV2 病人血清中，可以辨 識fusion loop（106G，107L）的抗 E 抗體平均約 44%（IgG），在二次感染 DENV2 病人血清中則是平均約35%；初次感染 DENV 後針對 fusion loop 所產生的抗 E 抗 體似乎大於二次感染(Crill et al., 2009)，但是由於本研究所分析的血清中只包含一 個一初次感染的病例，未來需要分析更多的感染病例才具有統計上的意義。
在本研究中，我們使用西方墨點法檢視了不同種類的單株抗體在DENV3 之 E
蛋白質上的抗體辨識部位，同時也分析了初次和二次感染DENV3 病人血清中的抗
E 抗體的辨識部位及其所佔的比例，這些對於 cross-reactive 和 type-specific 之抗體 辨識位的瞭解，以及對自然感染DENV3 之下所誘發人體產生的抗 E 抗體特性的瞭 解，可以為日後設計誘導產生交叉保護及中和性抗體的疫苗提供有用的資訊。