：結果

3.1 老鼠單株抗體位於 DENV3 E 蛋白質之抗體辨識部位：

為了瞭解抗E 抗體位於登革病毒 E 蛋白質之抗體辨識部位，先前實驗室以表

現 DENV1 PrM/E 蛋白質之質體為骨幹，選擇位於 E 蛋白質表面的胺基酸

(Mazumder et al., 2007)，以定點突變法將其分別置換成 alanine 來做抗體辨識部位

的研究，根據初步分析之結果，觀察到28 個胺基酸可能為抗體辨識部位的胺基酸，

在本實驗中以表現DENV3 PrM/E 蛋白質之質體為骨幹，也利用定點突變法將這些 胺基酸分別置換成alanine。

圖一顯示這28 胺基酸所涵蓋範圍，包含 domain I（17G、37N、167Q、169S、

172E、174V、176P、1773、290D）、domain II fusion loop（101W、104G、106G、

107L、108F）以及 domain III（301M、303L、305T、307V、310K、311E、312V、

329E、364P、383G、384D、385K、389I、391W）。將這些 alanine 單點突變之質 體轉染至293T 細胞，48 小時之後收集 cell lysates，為了將每一個 alanine 單點突變 E 蛋白質之濃度調整至一致，首先利用 mixed mAbs (包含 flavivirus group-reactive、

DENV complex-reactive 及 DENV3 type-specific 三種單株抗體的混合物) 稀釋 1000

倍作為一級抗體，進行西方墨點分析法，利用影像分析軟體 UVP 定量 E band

intensity，確認各個 E mutant/wt E 值約為 1.0（圖二）再進行下一步的分析。

之後我們使用不同種類的老鼠單株抗體當作一級抗體，進行SDS-10% PAGE 以及西方墨點法來分析，定量 E band intensity，並且計算 Recognition Index

（[ Intensity of mutant E/wt E] mAb/[intensity of mutant E/ wt E]mixed mAbs）(Lai et al., 2008; Thali et al., 1992)，以 cut-off 值小於 0.3 定義此 alanine 單點突變 E 蛋白質可 以影響單株抗體的結合能力。

圖三顯示alanine 單點突變的 E 蛋白質對於 flavivirus group-reactive 單株抗體結 合能力的影響。在101W、104G、106G、107L 及 108F 的 alanine 點突變皆會影響

4G2 對 E 蛋白質的結合能力；101W、104G、107L 及 108F 的 alanine 點突變會影 響FL0231 的結合能力，而 FL0232 則是受到 101W 和 108F alanine 點突變的影響。

這些結果顯示，flavivirus group-reactive 單株抗體大部分都是辨識在黃病毒 E 蛋白 質上，一段序列高度保守的fusion loop 位置。

圖五顯示alanine 單點突變之 E 蛋白質對於 complex/subcomplex-reactiv 單株抗 體（DC7-3、DC9-6、DC12-3）結合能力的影響。domain III 之 312V、389I 和 391W 的alanine 點突變會影響 DC12-3 的結合能力，DC9-6 受影響的位置主要位於 domain III（307V、310K、311E、312V、383G、389I、391W）以及 domain I（172E），

而這些位置的alanine 點突變並不影響 DC7-3 的結合能力。

圖六顯示 alanine 單點突變之 E 蛋白質對於 DENV3 type-specific 單株抗體 DC6-3 結合能力的影響。domain I（17G、172E、290D）胺基酸的 alanine 點突變

會降低此單株抗體對E 蛋白質的結合能力。

DF95-2008、DF98-2008）受到 101W 位置 alanine 點突變的影響，而 104G 和 172E 這兩個位置的alanine 點突變分別會影響 DF90-2008 和 DF71-2008 血清抗 E 抗體的 結合能力（圖十）。另外一些病人血清的抗E 抗體則受到比較多位置的 alanine 點

突變的影響，DF102-2008 可辨識 101W 和 104G；DF87-2008 可辨識 101W、104G 和108F；DF92-2008 可辨識 101W、104G 以及 domain I 的 172E；DF104-2008 的 抗E 抗體則不受影響（圖十一）。

綜合分析初次感染及二次感染DENV3 之病人血清，發現血清中主要抗 E 抗體 辨識部位在E 蛋白質之 domain II fusion loop（101W、104G、108F）上。

3.3 利用 VLPs 建立 capture ELISA system 研究 DENV3 E 蛋白質之抗

Stiasny et al., 2006)，因此，在本實驗我們建立改以 coating 兔子抗 DENV3 抗體的 capture ELISA system 進行抗體辨識部位的分析。

將alanine 點突變之質體轉染至 293T 細胞，48 小時後收集上清液進行超高速 離心分離出VLPs，接著先以 capture ELSA 定量，在 coating 兔子抗 DENV3 抗體 的 96-well plate ， 加 入 序 列 稀 釋 之 VLPs ， 以 mixed mAbs ( 包 含 flavivirus group-reactive、DENV complex-reactive 及 DENV3 type-specific 三種單株抗體的混 合物) 稀釋 3200 倍作為一級抗體，根據 O.D.450-650 讀值選擇結果約為 1.0（圖十

二Ａ）之下，各 VLPs 所對應的稀釋倍數當做下一步分析的稀釋倍數。接著固定

VLPs 之稀釋倍數，以各病人血清當作一級抗體做序列稀釋進行 capture ELISA，分 別以O.D.450-650 讀值及 log (1/dilution factor)為 XY 軸畫出相對曲線圖。圖十二 B 及圖十三Ａ顯示，相對DENV3 wild type VLPs，fusion loop 之 101WA108FA 或

101WA106GA108FA 之突變 VLPs 降低病人血清（DF89-2008、DF92-2008、

DF102-2008、DF90-2008）中抗 E 抗體的結合能力（圖十二Ｂ中排、圖十三 A 上 排）；domain III（305TA384DA）之突變 VLPs 則不影響 DF89-2008 和 DF92-2008

病人血清中的抗E 抗體的結合能力（圖十二Ｂ右排）。 級抗體，並且序列稀釋進行capture ELISA，以 O.D.450-650 讀值之平均值加 3 個 標準差（mean + 3 S.D.）當作 cut-off（0.128），接著計算在此 cut-off 值之下，各 組VLPs 所對應的終點稀釋倍數（endpoint titer），再以公式抗 E 抗體比例（%）=

(1- mutant VLPs 終點稀釋倍數/wt VLPs 終點稀釋倍數）*100 %，可以分別計算出 血清中辨識101W108F 以及 101W106G108G 之抗 E 抗體的比例。

圖十二C 顯示 DF89-2008 血清中辨識 101W108F 以及 101W106G108G 的抗 E 抗體分別佔有 73%和 70%；DF92-2008 則分別是 49%和 41%；圖十三 B 顯示 DF102-2008 血清中辨識 101W108F 以及 101W106G108G 的抗 E 抗體有 70%以上；

DF71-2008 則分別是 21%和 22%；DF90-2008 分別是 32%和 26%。

綜合以上之分析結果，感染DENV3 之病人血清中，大約有 20~70%的抗 E 抗 體，其抗體辨識位在fusion loop 上。