本 研 究 以 中 國 醫 藥 大 學 附 設 醫 院 的 臨 床 病 人 為 研 究 主 體 ， 檢 體 收 集 自 附 設 醫 院 檢 驗 醫 學 部 細 菌 組之 臨 床 病 患 經 K.
pneumoniae 培 養 鑑 定 呈 現 陽 性 之 痰 液 、 血 液 、 稠 膿 及 患 部 沖 洗 液 檢 體 共 485 例，加以繁殖保存，提供菌株的分析與使用。
包 含 居 住 在 台 灣 的 糖 尿 、 非 糖 尿 病 人 ， 患 有 肺 炎 、 肝 膿 瘍 、 眼 內 炎 等 院 內 、 社 區 感 染 炎 症 之 疾 患 ； 確 定 臨 床 檢 體 的 來 源 、 臨 床 診 斷 與 感 染 來 源 、 病 人 臨 床 表 徵 及 數 據 ， 將 其 全 部 收 集 與 整 理 ， 並 進 一 步 的 統 計 分 析 與 K. pneumoniae 感 染 菌 種 資 料 庫 的 關 係 。 所 有 菌 株 於 疾 病 管 制 局 第 三 分 局 進 行 分 析 工 作 ， 使 用 標 準 操 作 流 程 進 行 菌 株 之 脈 衝 式 電 泳 分 型
(PFGE)， 並 將 所 得 之 PFGE 圖 譜 標 準 化 以 軟 體 分 析 後 ， 貯 存 成 圖 譜 資 料 庫 ， 建 立 DNA 圖 譜 資 料 庫 與 圖 譜 比 對 ， 再 進 行 該 資 料 庫 與 菌 株 之 流 病 資 料 結 合 ， 分 析 菌 株 型 別 與 疾 病 的 關 係，達成 K. pneumoniae 感 染 的 流 行 病 學 圖 譜 資 料 庫 之 建 立 ， 鑑 識 與 臺 灣 K. pneumoniae 致 病 機 轉 有 關 的 基 因 型 態 ， 提 供 K. pneumoniae 預 防 及 臨 床 治 療 不 同 的 方 向 。 再 以 黏 性 試 驗 ( String Test )檢 測 菌 落 黏 性 之 實 驗 方 法 ， 對 照 於 臨 床 資 料 及 PFGE 圖 譜 ， 將 所 得 資 料 做 統 計 分 析 評 估 實 驗 數 據 結 果 。 以
下 將 逐 項 介 紹 實 驗 材 料 與 方 法 ：
壹 、 臨 床 檢 體 的 採 檢 與 接 種
一 、 採 取 檢 體 時 間 ：
1. 配 合 病 情 發 展 ， 於 最 適 當 時 間 採 取 。
2. 收 集 後 檢 體 需 儘 速 送 檢 ， 否 則 污 染 菌 會 繁 殖 過 度 ， 掩 蓋 過 病 原 菌 。
二 、 檢 體 接 種 方 法 ：
病 原 菌 的 分 離 需 選 擇 合 適 的 培 養 基 ， 再 依 照 檢 測 目 的 及 培 養 基 種 類 而 選 擇 接 種 的 方 式 ， 且 必 須 注 意 在 安 全 操 作 台 (laminar flow)的 無 菌 操 作 技 術 。
劃 線 法 (streak method )： 此 法 為 微 生 物 檢 驗 室 最 常 用 之 接 種 法 ， 係 取 少 量 菌 落 生 長 物 接 種 於 固 體 培 養 基 之 表 面 ， 輕 輕 劃 線 ， 劃 線 方 式 不 一 ， 視 其 目 的 而 定 。
1.四 區 劃 線 法 (four-phase streaking method)：
a.持 接 種 環 將 圈 環 燒 紅 ， 冷 卻 後 再 接 觸 檢 體 或 菌 種 。 b.將 培 養 基 平 板 蓋 打 開 ， 將 接 種 環 塗 於 平 板 的 1/4 區 域 ，
將 接 種 環 在 火 焰 燒 紅 ， 冷 卻 後 接 觸 第 一 劃 線 區 邊 緣 ， 再
塗 劃 平 板 的 另 外 1/4 區 域 (第 二 劃 線 區 )， 以 同 樣 方 式 進 行 第 三 區 、 第 四 區 之 塗 劃 。
c.塗 劃 完 畢 後 ， 平 板 合 蓋 ， 標 示 清 楚 ， 再 倒 置 (蓋 下 底 上 ) 於 培 養 箱 培 養 。
d.上 述 操 作 均 在 安 全 操 作 台 進 行 ， 接 種 完 畢 後 ， 接 種 環 必 須 再 燒 紅 一 次 ， 作 為 滅 菌 。
2. 標 準 圈 環 直 接 劃 線 法 (calibrated loop-direct streak method)：
將 檢 體 輕 輕 搖 盪 均 勻 ， 再 以 0.00l mL 定 量 接 種 環 採 取 檢 體 ， 以垂 直 方 向 持 拿 接 種 環 ， 使 接 種 環 完 全 浸 入 檢 體 但 不 可 碰 到 環 以 上 的 部 份 ， 首 先 在 培 養 基 劃 一 條 線 ， 再 密 密 塗 劃 。 如 尿 液 檢 體 。
三 、 檢 體 培 養 條 件 ：
接 種 後 菌 盤 或 菌 瓶，一 般 均 為 嗜 氧 培 養（ 35℃，5％ CO
2
） 在 溫 箱 (incubator)內 ； 厭 氧 培 養 基 ， 則 須 置 於 厭 氧 箱 培 養 ， 隔 夜 培 養 後 觀 察 菌 落 生 長 情 形 及 型 態 、 氣 味 等 （ Manual of Clinical Microbiology 7t h
. 1999； Diagnostic Microbiology 5t h
. 1997）。貳 、 需 氧 細 菌 類 培 養 (Aerobic bacteria culture)
細 菌 對 各 物 理 因 素 ， 如 溫 度 ， 酸 鹼 度 ， 濕 度 ， 滲 透 壓 ， 氧 氣 ， 光 線 都 有 不 同 的 需 求 ， 唯 有 在 合 適 條 件 下 ， 才 能 維 持 生 長 ； 而 需 氧 菌 則 要 有 游 離 的 氧 氣 存 在 才 能 生 長 。
一 、 測 試 方 法 與 原 理 ：
利 用 各 類 培 養 基 能 夠 提 供 細 菌 生 長 所 需 的 養 分 ， 並 呈 現 其 不 同 之 菌 落 型 態 與 數 量 ， 作 為 各 類 檢 體 判 讀 之 依 據 。
1、 判 讀 時 間 ：
a、 初 步 判 讀 時 間 ： 18 – 24 小 時 b、 陰 性 結 果 判 讀 時 間 ： 48 小 時 2、 判 讀 標 準 ：
a、 尿 液 培 養 判 讀 是 計 算 培 養 基 上 面 的 菌 落 數 ， 若 採 用 校 正 過 的 0.001mL 拋 棄 式 接 種 環 (inoculation loop)-菌 落 計 數 接 種 法 ， 則 將 菌 落 數 乘 以 1000 即 為 每 mL 尿 中 的 細 菌 總 數 ， 例 如 BAP 上 有 100 個 菌 落 ， 即 代 表 100000
CFU/mL。以 革 蘭 氏 染 色 結 果 及 觀 察 菌 之 型 態 並 計 數 菌 落 後 ， 以 實 驗 室 標 準 作 業 流 程 步 驟 決 定 發 報 告 形 式 及 如 何 作 進 一 步 之 細 菌 鑑 定 及 藥 物 敏 感 試 驗 。
b、 糞 便 、 傷 口 及 其 他 膿 液 或 體 液 培 養 判 讀 是 依 各 種 培 養 基 上 的 疑 似 致 病 菌 之 菌 落 顏 色 ， 進 行 鑑 定 及 藥 物 敏 感 試 驗 ， 當 醫 師 特 別 要 求 鑑 定 菌 種 或 有 食 物 中 毒 個 案 時 ， 需 針 對 特 殊 或 指 定 的 菌 種 進 行 鑑 定 及 藥 物 敏 感 試 驗 。 若 培 養 18 – 24 小 時 後 培 養 基 沒 長 任 何 菌 落 時 ， 而
thioglycollate broth 呈 混 濁 狀 ， 則 需 取 培 養 管 內 之 菌 液 劃 在 新 的 BAP/EMB agar 上 ， 若 為 耳 鼻 喉 科 、 婦 產 科 、 泌 尿 科 、 眼 科 的 檢 體 需 加 種 chocolate agar， 置 於 35℃ ， 5-10% CO2 溫 箱 中 培 養 18-24 小 時 。 若 次 培 養 之 培 養 基 長 出 之 菌 落 為 污 染 菌 時 ， 視 同 陰 性 報 告 。 若 次 培 養 之 培 養 基 有 長 致 病 菌 ， 則 進 行 鑑 定 及 藥 物 敏 感 試 驗 。
c、 痰 液 培 養 判 讀 需 先 以 Gram`s stain 觀 察 bacterial score，
bacterial score 有 下 列 2 種 情 形 之 一 時 ， 決 定 是 否 達 到 判 讀 標 準 以 繼 續 進行鑑定及藥物敏感試驗：
（ 1）一 bacteria > 25/ HPF (3+)，bacteria 被 phagocytosis 。
（ 2） 檢 體 來 源 自 小 兒 且 菌 落 為 單 一 菌 種 的 ， 單 一 bacteria 且 neutrophil 為 3+時（ Manual of Clinical Microbiology 7
th
. 1999；Diagnostic Microbiology 5th
. 1997）。? 、 需 氧 革 蘭 氏 陰 性 桿 菌 的 鑑 定 (GNB Identification)
一般微生物實驗室為了鑑定方便而將革蘭氏陰性桿菌分為五 大類：
a、 腸桿菌科菌種(Enterobacteriaceae)：包括 E.coli、Klebsiella pneumoniae 等
b、 氧化? 陽性葡萄糖發酵性革蘭氏陰性桿菌(GFB)：包括 Areomonas 及 Vibrio 等
c、 葡萄糖非發酵性革蘭氏陰性桿菌(GNF)：包括 Pseudomonas、
Acinetobacter、Moraxella 等
d、 挑剔性革蘭氏陰性桿菌：包括 Haemophilus 等
e、 不常見之革蘭氏陰性桿菌：包括 Campylobacter、Helicobacter Pylori 等
一 、 測 試 方 法 與 原 理 ：
利 用 不 同 的 生 化 反 應 測 試 方 法， API 腸 內 菌 20E 鑑 定 套 組 （ API 20E）， 來 鑑 定 出 需 氧 革 蘭 氏 陰 性 桿 菌 中 不 同 菌 屬 。
二 、 測 試 結果判定：
a、 在 API 20E strip 的 各 個 試 驗 孔 中 ， 含 有 不 同 的 化 學 物 質 及 培 養 基 ， 由 接 種 細 菌 之 後 ， 細 菌 在 其 中 生 長 所 造 成 的
生 化 反 應 的 顏 色 變 化 ， 對 照 API 20E 顏 色 反 應 判 讀 表 來 判 定 細 菌 的 種 類 。
b、 可在 API Lab Plus 查菌軟體中查得菌名及鑑定結果，也可使用 Mini API 儀器查詢
c、 查菌所得之結果需考慮檢體的來源、菌落的形態、病人的病況 的 情 形， 才能得出最正確之結果（ Castillo et al., 1984；
Appelbaum et al., 1980；Brooks et al., 1974）。
肆 、 細 菌 藥 物 敏 感 性 試 驗 （ Sensitivity test for bacteria）
本 篇 藥 物 敏 感 性 試 驗 ， 主 要 以 瓊 脂 紙 錠 擴 散 試 驗 (disc agar diffusion test)， 又 稱 Bauer-Kirby 試 驗 或 紙 錠 試 驗 方 法 ， 主 要 應 用 於 大 部 份 的 需 氧 菌 藥 物 敏 感 性 試 驗 。
一 、 測 試 方 法 及 原 理 ：
瓊 脂 紙 錠 擴 散 試 驗 是 利 用 抗 生 素 紙 錠 擴 散 的 原 理 所 得 到 抑 制 環 的 大 小 ， 可 判 斷 病 原 菌 對 該 藥 物 之 感 受 性 型 式 (抵 抗 性 、 中 間 性 和 感 受 性 )。
二 、 測 試 結 果 判 定 ：
革 蘭 氏 陰 性 腸 內 菌 (Enterobacterioceae)之 抑 制 環 直 徑 大 小 的 判 讀 標 準 及 相 當 的 最 低 抑 制 濃 度 (MIC)分 界 點 如 下 表 ：
抑制環直徑(mm) 相當的 MIC 分
【 Davise Laro. Medically Important Fungi, Third edition.；
Fundamentals of Diagnositic Mycology Fisher Cook；
Principles and Practice of Clinical Mycology Kibbler,
Mackenzie Odds(Editors ).； NCCLS, M100-S12 Vol.22 No.1
】
伍 、 菌 株 之 保 存
一 、 方 法 及 原 理 ：
因 細 菌 上 莢 膜 組 成 成 份 的 結 構 不 同 會 有 不 同 的 黏 性 表 現 ， 藉 以 觀 察 莢 膜 的 屬 性 。
於 試 驗 前 一 天 ， 將 保 存 之 冷 凍 菌 株 以 無 菌 竹 棒 挑 起 少 量 菌 液 置 於 BAP agar plate 上 ， 持 接 種 環 做 三 區 劃 線 後 在 37℃
培 養 隔 夜 約 16 ~ 18 小 時 ， 以 接 種 之 圈 環 挑 起 每 一 菌 盤 內 至 少 三 個 單 一 菌 落 並 紀 錄 其 挑 起 菌 絲 之 高 度 。
二 、 結 果 判 讀 ：
以 挑 起 之 菌 絲 高 度 大 於 1 公 分 以 上 稱 之 為 高 黏 液 性 菌 株
（ hypermucoviscosity） 結 果 為 陽 性 ， 小 於 1 公 分 則 稱 之 為 低 黏 液 性 菌 株 （ hypomucoviscosity） 結 果 為 陰 性 。
柒 、 脈 衝 式 電 泳 分 型 (PFGE)
PFGE 為 分 析 菌 株 之 脈 衝 式 電 泳 分 型 [ Pulsed field gel
electrophoresis (PFGE) ]方 法 ， 可 分 析 菌 種 之 DNA， 再 以 Bio Numerics analysis 電 腦 軟 體 程 式 分 析 基 因 圖 像 ， 建 立 K.
pneumoniae 的 DNA 圖 譜 資 料 庫 將 圖 譜 標 準 化 以 照 像 貯 存 ， 經 由 軟 體 分 析 後 貯 存 成 圖 譜 資 料 庫
提 供 K. pneumoniae 菌 種 與 流 行 病 學 的 圖 譜 比 對 ， 做 為 致 病 基
因 的 研 究 菌 株 在 基 因 庫 中 心 永 久 保 存 ， 以 利 其 他 研 究 者 取 得 菌 株 進 行 研 究 。
八 、
一 、 原 理 及 方 法 ： 一 種
利 用 規 律 週 期 性 電 場 方 向 交 替 變 換 ， 使 不 同 大 小 分 子 量 的 巨 大 DNA 片 段 能 在 瓊 膠 中 逐 漸 分 離 依 序 排 列 之 分 子 生 物 技 術 。
1.試 驗 前 一 天 ， 將 保 存 之 冷 凍 菌 株 以 無 菌 竹 棒 挑 起 少 量 菌 液 置 於 LB agar plate 上 ， 持 接 種 環 劃 線 後 在 37℃ 培 養 隔 夜 約 18 ~ 20 小 時 。
2.以 棉 棒 取 適 量 菌 落 至 含 3ml CSB (cell suspension buffer)的 2054 Falcon 試 管 中 混 合 均 勻 ， 經 濁 度 器 測 試 濁 度 為 約 0.50，
取 400 μ l 的 菌 液 和 400 μ l 的 1% agarose 混 合 均 勻 。 3.於 鑄 模 中 製 成 DNA 薄 片 （ plug） 並 以 proteinase K 消 化
（ digestion） 之 。
4. 以 半 自 動 化 恆 溫 定 量 清 洗 裝 置 (plug washing machine)之 清 洗 流 程，經 無 菌 二 次 水 及 TE 緩 衝 溶 液 多 次 清 洗 DNA 薄 膠 塊。
5.
清 洗 完 畢 後 取 出 膠 塊 放 入 含 TE Buffer 1000µl 之 1.5ml eppendoff tube 中 ， 置 於 4℃ 冰 箱 保 存 直 到 使 用 為 止 5.
6. 以 定 量 切 割 台 切 取 固 定 大 小 之 DNA 薄 片 並 以 限 制 酵 素 Xba I 消 化 DNA 薄 片 。
7. 將上述限制酵素切割好之條狀薄片加入電泳凝膠，待其凝固後再 放置於電泳槽中以預設之脈衝電場條件作用 19 小時，使 DNA 片段 於電泳凝膠內行進。
8. 完成電泳後取出凝膠放入 EtBr 染液中染色，再以二次水褪染，最 後置於紫外線燈平臺以照相系統擷取影像並存檔，即可取得各菌株之 DNA 圖譜進行分析（Gautom, 1997）。
二 、 圖 譜 資 料 庫 電 腦 分 析 （ Bio Numerics analysis）
1. 電 腦 軟 體 分 析 原 理 ：
使 用 之 參 考 系 統 （ reference system） 包 含 外 部 參 考
（ external reference）和標準的（ standard ）；以 整 片 電 泳 凝 膠 上 15 個 位 置 均 是 同 一 已 知 菌 株 標 誌 的 電 泳 圖 譜 當 成 電 腦 軟 體 分 析 中 的 外 部 參 考 值（ external reference）其 主 要 為 定 義 影 像 上 每 一 個 band 的 相 對 位 置；為 了 得 到 一 個 公 正 的 相 對 關 係 , 需 要 自 行 作 數 學 上 的 統 計 分 析 (不 同 的 條 件 就 有 不 同 的 相 對 關 係 )。 standard 是 一 個 band 的 影 像 可 作 為 視 覺 上 的 參 考 標 準；而內部參考值（ internal reference） 為 定 義 影 像 上 每 一 個 band 的 絕 對 位 置 ； 透 過 與 外 部 參 考 值 相 互 比 對 ， 可 以 得 知 該 位 置 附 近 影 像 的 位 移 狀 況 。
2. 電 腦 軟 體 分 析 方 法 ：
將 485 株 臨 床 分 離 出 的 K. pneumoniae 菌 株 ， 以 脈 衝 式 電 泳 所 取 得 的 各 菌 株 之 DNA 圖 譜 資 料 庫 ， 利 用 上 述 的 電 腦 軟 體 分 析 原 理 以 美 國 CDC 標 準 菌 株 H9812 DNA 圖 譜 當 成 外 部 參 考 值（ external reference）， 及 以 每 片 電 泳 凝 膠 上 第 1、5、
10、15 的 位 置 上 之 H9812 DNA 圖 譜 當 成 內 部 參 考 值（ internal reference）， 進 行 臨 床 分 離 的 K. pneumoniae 菌 株 間 之 DNA
10、15 的 位 置 上 之 H9812 DNA 圖 譜 當 成 內 部 參 考 值（ internal reference）， 進 行 臨 床 分 離 的 K. pneumoniae 菌 株 間 之 DNA