本研究所使用之 18 隻 ICR 母鼠均購自樂斯科生物科技股份公司
（Bio LASCO Taiwan Co.Ltd.），周齡 8-12 周，體重 20-30 公克之間。
飼養於每日12 小時人工光照(早上 8 點至晚上 8 點)，空調溫度 25±2 oC 之環境，並給予充足飼料及飲用水。所有研究過程皆符合動物實驗倫理 委員會之規範。
貳、實驗動物分組
18 隻 ICR 母鼠隨機分為三組，包括：
一、控制組（Con：Control group）
注射生理食鹽水（normal saline），無接受電針治療。
二、鹿角膠組（Car：Carrageenan）
注射鹿角膠，無接受電針治療。
三、電針組（Acu：Electroacupuncture）
注射鹿角膠後，接受電針治療。
每組各有 6 隻小鼠。在注射 carrageenan 之前，先行記錄小鼠各項行 為反應測試的數值，包括機械力、輻射熱及冷熱板等，當作本研究的基 礎值（base line）。
參、發炎疼痛模式
在1-2 % isoflurane 氣體麻醉下（VIP 3000，Midmark，USA），將 20 µl 生理食鹽水 (pH 7.4，buffered with 20 mM HEPES)加入 3%
carrageenan (lambda carrageenan，type IV；Sigma)，注射在小鼠右後掌以 誘發發炎疼痛模式。
肆、電針治療
電針治療在 2 % isoflurane 氣體麻醉下進行，針具為 0.5 寸針（32G，
宇光），連接多功能電刺激器(型號：Trio 300，Ito，Japan)，針刺穴位 為雙側足三里，針刺身度2-5 mm，刺激頻率為 2 Hz，刺激強度為 1 mA，
波型為連續性方波，刺激時間持續15 分鐘，可見小鼠後肢的肌肉有微 小的顫動。
電針治療組的小鼠自注射 carrageenan 的隔天（第 1 天）開始電針治 療，一共連續第 4 天，每天皆接受電針治療 1 次，於第 4 天電針後將小 鼠犧牲。
伍、行為觀察
在注射 carrageenan 之前及第四天電針後的 0.5-2 小時內，觀察各組 小鼠的行為表現。行為觀察皆在安靜的室溫環境中進行，且皆在小鼠處 於平和的狀態下給予刺激試驗，若小鼠在睡覺或理毛的狀態中則不給予 刺激試驗。
我們藉由以下行為試驗評估小鼠機械性及溫度性痛覺敏感的變化。
一、 機械力試驗
採用針刺回縮反應(von Frey test)。將小鼠置於鐵製網架上，以小型 透明壓克力盒侷限小鼠行動，等小鼠鎮靜後，以電子式的von Frey filaments（型號：North Coast Medical）的尖端戳刺其右後足掌，儀器可 自動偵測小鼠因機械力致痛而抬起右後足（即縮足反應）的機械性壓力 值，每隻小鼠每天測試5 次，每次間隔 30 秒，取 5 次測試所得的平均 值，藉以評估小鼠機械性痛覺敏感的閾值。
二、 輻射熱試驗
採用 Hargreaves’ test。將小鼠侷限至於無墊料之小型壓克力觀察盒 中，下方為控制溫度 32 oC 之加熱透明玻璃，給予至少 30 分鐘適應環境 後，以可移動式之穩定輻射熱源裝置(輻射熱源強度 30 %，型號：IITC Life Sciences，Series 8，Model 390 G)，照射小鼠右後足掌，輻射熱源裝 置可顯示並記錄小鼠經多少秒數後因感覺疼痛而抬足的時間，每隻小鼠 每天測驗5 次，每次照射不超過 20 秒，兩次照射間隔至少 5 分鐘，防 止造成組織損傷，5 次測試所得的平均值及為當日之潛伏期（latency），
藉此瞭解小鼠對輻射熱的痛覺敏感閾值。
三、 冷熱板試驗
將小鼠侷限至於無墊料之小型壓克力觀察盒中，下方為控制溫度之 金屬面板（型號：Panlab，HARVARD，APPARATUS），透過金屬面 板個別施與恆溫的冷刺激（4 oC）或熱刺激（50 oC），紀錄 5 分鐘內第 一次舔足的時間、縮足反應（withdrawal）的次數、跳離板面（jumping）
的次數，冷板測試加計因冷而站起顫慄（rearing）的次數。每隻小鼠每 天於冷熱板各測試1 次。藉此瞭解小鼠對溫度性痛覺敏感的閾值及程度。
陸、動物犧牲
自注射 carrageenan 後的第 4 天行為觀察結束後，以過量麻醉劑水化 氯醛（chloral hydrate，400mg/kg）注射小鼠腹腔，待小鼠麻醉昏迷後，
以仰臥姿勢開啟腹腔曝露出心臟，從左心室插入灌流針頭，另在右心房 剪一切口，以生理食鹽水灌流將體內血液沖洗乾淨。
控制組、鹿角膠組及電針組三個組別中皆有 6 隻小鼠，隨機分配其 中3 隻作免疫螢光染色法，另外 3 隻作西方墨點分析法。
柒、免疫螢光染色法(Immunohistochemistry）
小鼠犧牲後用生理食鹽水將體內血液灌流沖淨，再用 4 %多聚甲醛
（paraformaldehyde）從心臟灌流將身體細胞固定，取下同側腰椎第 3、
4、5 節（L3、4、5）的背根神經節，放入 4 %多聚甲醛（paraformaldehyde）
固定一天，再置入30 % 蔗糖（sucrose）中約 12 小時，以產生抗凍作用
（cryoprotection），再將已離心沉降的背根神經節組織放入至包埋劑
（O.C.T. Compound）中包埋，並快速冷凍至-20 oC，在低溫恆溫中，使 用冷凍切片機將組織切成15 微米厚（15 μm）的組織切片。在室溫環境 下，組織切片置於磷酸鹽緩衝液（PBS：phosphate buffer saline，containing 3 % BSA，0.1 % Triton X-100 and 0.02 % sodium azide）中 blocking，於 室溫靜置120 分鐘後，加入一級抗體 against Nav 1.7 (1：1000，Alomone)、
Nav 1.8 (1：1000，Alomone)及 Nav 1.9 (1：1000，Alomone)，放在 4 °C 的環境中隔夜(約 16-24 小時)，接著除去一級抗體並用 PBS 清洗後，將 組織切片放在玻片上，再加入螢光標記的二級抗體6 mM Alexa Flour 594 goat anti-rabbit (Molecular Probes，Carlsbad，CA，USA) 2 小時後，除去 二級抗體並用PBS 清洗，將組織蓋上玻片，用螢光顯微鏡觀察。
捌、西方墨點分析法（Western blot analysis）
小鼠犧牲後用生理食鹽水將體內血液灌流沖淨，取下同側腰椎第 3、4、5 節（L3、4、5）的背根神經節，將取下的組織加入均質液（lysis buffer：containing 20 mmol/L imidazole-HCl (pH 6.8)，100 mmol/L KCl，
2 mmol/L MgCl2，20 mmol/L EGTA (pH 7.0)，300 mmol/L sucrose，1 mmol/L NaF，1 mmol/L sodium vanadate，1 mmol/L sodium molybdate，
0.2% Triton X-100 and proteinase inhibitor cocktail），在 4 oC 的環境中利 用振盪機將組織均質化1 分鐘。以 13000 轉、10 分鐘高速離心後所得的 上清液即為組織蛋白質萃取液。在每份樣品中取蛋白質萃取液30 μg，
以8 %十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠體電泳（SDS-Tris glycine gel electrophoresis），將電泳完成之膠取下，浸泡於 transfer buffer (tris，
glycine，SDS，20 % methol)中，再放入 transfer 裝置（mini trans-blot electrophoretic transfer cell，BIO-RAD）將分離出的不同分子量蛋白質轉
印（transfer）至 PVDF membrane 上，200 mA、120 分鐘。轉印完成後 取出membrane，再利用含 5 %脫脂奶粉(non-fat milk power)的 TBST buffer (10 mmol/L Tris [pH 7.5]，100 mmol/L NaCl，0.1 % Tween 20) blocking 60 分鐘，再加入各亞型的鈉離子通道一級抗體於 4℃隔夜反 應。反應完成後先以TBST 沖洗三次，每次 10 分鐘，再加入二級抗體 Peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody (1：5000)於室溫下作用 2 小時 反應，最後以冷光偵測試劑（ECL-Plus kit，T-Pro biotechnology）及冷 光螢光分析儀（LAS 3000，Fujifilm，Japan）顯影，再以 Image J v1.45i 軟體進行分析。
玖、統計分析
實驗結果以 SPSS v17.0 軟體進行分析，數值以平均值±標準差（mean
± standard error）表示，當 p 值小於 0.05 時具有統計上的顯著差異。
控制組、發炎組、電針組及偽電針組的實驗數據則以 ANOVA 分析，
事後檢定（post hoc）採 Tukey's test，比較三組之間的療效差異。