一、實驗材料
1. 實驗動物
本實驗使用雄性 5 週齡 C57BL/6JNarL 小黑鼠，購買自國家科學委員會實 驗動物繁殖暨研究中心。飼養於中國醫藥大學動物中心，動物飼養條件為自動 空氣調節(換氣率每小時 12 次)、自動光照控制(12 小時白晝、12 小時黑夜)、
室內溫度控制於 22 、相對溼度 55 %。動物給予正常飲水及一般飼料並自由 進食，入室後經飼養 5 週後平均體重達 25 克，以 STZ 誘發為糖尿病小鼠以進 行後續實驗。
2. 實驗特殊飲食
(a) KIRKLAND SIGNATURE 無鹽奶油，作為飽和脂肪奶油(SFA)，購自好市 多股份有限公司
(b) 北海道雪印純植物奶油，作為反式脂肪奶油(TFA)購自立基食品股份有限公 司
(c) 一般飼料：Laboratory animal diet (MF-18)，購自樂斯科生物科技股份有限 公司。
3. 化學試藥
STZ, 98 % 購自美國 Sigma 公司
(7) Bio-rad protein assay (Dye reagent concentrate) 購買自美國 Bio-Rad 公司 (8) Methanol 購自美國 Tedia 公司
(h) Mouse MCP-1 ELISA kit 購買自美國 eBioscience 公司 (i) Mouse TNF-α ELISA kit 購買自美國 eBioscience 公司
5. 儀器設備
(a) 酸檢測定儀 (pH meter)：Mettler toledo，瑞士 (b) 離心機：
(1) Hettich，Micro 22R，德國
(2) Eppendorf，Centrifuge 5810R，德國
(c) 分光光度計 (Spectrophometer)：GBC，Cintra UV-Vis spectrometer，澳洲 (d) 高溫高壓滅菌釜：AS-3560，台灣光杏生物科技有限公司
(e) 免疫分析微盤清洗機 (ELISA washer)：Bio-rad model 1575，美國 (f) 微盤分光光度計 (Microplate spectrometer)：Bio-rad xMark，美國 (g) 均質機：
(1) Glas-co，美國
(2) Bullet blenderTM，美國 (h) 水浴器：BH-230D，台灣 (i) GC：Thermo scientific，美國 (j) 血糖機：TD-4207，台灣 (k) 血糖試紙：Easicheck，台灣
6. 中西式食品脂肪酸組成分析
◎中式食品：
本實驗使用市售月餅、月餅餡料、鹹酥雞、鳳梨酥、燒餅和油條。
食品購買地點：中國醫藥大學附近商家
◎西式食品：
本實驗使用市售奶精、西式喜餅、馬鈴薯薯條、甜甜圈和洋芋片。
食品購買時間：於民國 99 年 8 月至 100 年 4 月 食品購買地點：中國醫藥大學附近商家
二、實驗方法
1. 糖尿病動物誘發模式
根據Kunjathoor等人於1996年誘發C57BL/6J小鼠糖尿病之模式，使用體重 23~24 g 之雄性小鼠，空腹6~8小時後由腹腔注射含有0.1 M檸檬酸緩衝溶液 (pH=4.3)的STZ (劑量45 mg/kg body weight)連續施打五天，注射完後第8天從尾巴 採血，利用血糖機測其空腹血糖濃度，判斷是否成功誘發糖尿病(篩選標準：禁食 後空腹血糖 ≧ 200 mg/dl)。
2. 實驗設計
【表 4-1】實驗分組
組別 誘發模式 隻數 飼料與飲水
normal normal 10 標準飼料及一般飲水
DM DM 12 標準飼料及一般飲水
DM+SFA DM 18 20 %飽和脂肪奶油飼料及一般飲水
DM+TFA DM 18 20 %富含反式脂肪奶油飼料及一般飲水
小鼠入室後給予正常飲水及一般飼料並自由進食，經飼養 5 週後體重不足 25 克的小鼠編入 normal 組，剩餘 48 隻，隨機分成三組，以 STZ 誘發為糖尿病小 鼠後，開始 8 週實驗。實驗期間每天更換新鮮飲食與飲水，並記錄每日攝食量。
每 7 天進行小鼠體重測量，每 14 天測量血糖(尾靜脈血)並記錄血糖變化，八週 後採斷頭犧牲法取血液及組織樣品進行分析。
(a) 特殊飲食製備方法
本實驗小鼠所餵食之飼料為日本 OCYMF18 標準鼠飼料。製備添加 20 % Wt 奶油之飼料，計算好標準飼料的份量，利用攪碎機把飼料攪成粉末狀再分 別加入預先秤好的 20 % Wt 飽和脂肪奶油或反式脂肪奶油，加入熱水將奶油 溶解，經反覆搓揉使奶油與飼料混合均勻，最後切割搓揉做成團狀飼料餵食 小鼠。
(b) 血液、臟器之收集
小鼠斷頭犧牲後，使用不添加抗凝血劑之真空採血管收集血液，靜置於 4 約 10 分鐘後，以 3000 rpm 離心 15 分鐘，將上層之血清與下層之血球分 別取出並貯存。臟器採集心臟、肝臟、脾臟、腎臟，秤重紀錄後並於分析前 置於 -80 冰箱貯存，供日後分析之用。
(c) 臟器均質液處理
(1) 肝臟均質液：將肝臟取 100 mg 放入1.5 ml微量離心管，用小剪刀剪碎後，
加入1 ml之 PBS，pH = 7.2 ~ 7.4，再加入與臟器體積相等量的均質專用均
均質完全後，以2000 rpm 10分鐘離心取其上清液。依據Lowry et al.(1951) 以BSA為標準品，將組織均質液進行蛋白質濃度定量。
(2) 肝臟粗萃脂均質液：將肝臟取200 mg放入均質管(5 cm3)中加入1 ml (氯仿：
甲醇= 2：1)溶液後，馬上置於冰上利用均質機(Glas-Co)進行均質，先均 3 次後將肝臟刮至均質棒下端，再均5次，均質完成後將均質液倒入1.5 ml 微量離心管中暫存放於 -20 冰箱待分析。
(3) 不同樣品(本)所分析的項目如【表4-2】
【表 4-2】不同樣品所分析的項目
樣品 分析項目
中西式食品萃脂質 Food fatty acid composition
血清 Insulin, AST, ALT
肝臟均質液 IL-6, MCP-1 TNF-α
肝臟粗萃脂均質液 TC, TG, Fatty acid composition
3. 中西式食品脂質萃取 (a) 實驗步驟
(1) 取食品 200 mg 放入 1.5 ml 微量離心管，先將食品用小剪刀剪碎後，加 入 0.5 ml (氯仿：甲醇= 2：1)溶液之後，再加入與食品體積相等量的均 質專用均質磨珠，放置於均質機(Bullet blenderTM)均質。均質總時間約 2 分鐘，每均 30 秒即放置於冰上以保持低溫，約 1 分鐘後再放入均質 機中進行均質。
(2) 均質完全後，加入 200 μl 二次水 (3) 離心 2000 rpm，10 分鐘
(4) 取下層均質液(氯仿層)放置於 15 ml 玻璃管，以抽氣缸隔夜抽乾 (5) 加入 1 ml BF3，鎖緊瓶蓋，95 熱水浴 1 小時
(6) 靜置冷卻至室溫，加入 0.5 ml 二次水及 1 ml heptane (7) 離心 2000 rpm，10 分鐘
(8) 取上層液，以抽氣缸隔夜抽乾
(9) 加入100 µl heptane回溶，即為GC待注入樣品
三、分析方法
1、 血清胰島素濃度測定
(a) 原理
本實驗是以 Mouse insulin ELISA 商業套組進行分析，利用ELISA的原理。
具insulin特異性的多株抗體已coating於96孔盤上，將實驗樣品加入孔盤中，
此時樣品的insulin會專一性結合於其抗體上，再加入的peroxidase-conjugated anti-insulin抗體也會與insulin專一性結合並固定於孔盤上，利用緩衝溶液沖洗 掉多餘樣品後，再加入peroxidase的受質3,3,,5,5,-tetramethylbenzidine (TMB)作 為呈色劑，最後加入0.5 M H2SO4 終止反應後，測其OD450nm 之吸光值，依其 不同吸光值代入標準曲線即可換算出insulin濃度。
(b) 實驗步驟
(2) 每個 well 加入 100 μl enzyme conjugate solution，於室溫下經震盪器震 盪(700 - 900 rpm) 2 小時
(3) 使用免疫分析微盤清洗機以 wash buffer 清洗 6 次，洗完後反蓋在衛生 紙上輕拍吸乾
(4) 避光後，加入 200 μl TMB 於各 well 內，於室溫下反應 15 分鐘
(5) 加入 50 μl stop solution (H2SO4)終止其反應，經震盪器震盪 5 秒鐘以確 保混勻
(6) 用 ELISA reader 測定 OD450nm 之吸光值
(c) 標準曲線之製作
以 insulin 標準品濃度 0、0.2、0.5、1.5、3、6.5 μg/l 設為 X 軸，實驗所 測得的標準品 OD450nm吸光值設為 Y 軸，即可得一標準曲線。
(d) 計算方法
此實驗樣品於 OD450nm 測得之吸光值，依據標準曲線以內插法代入一 次方程式(y = ax+b)計算，則可求得樣品 insulin 濃度，單位以 μg/l 表示。
2、 HOMA-IR 計算
HOMA-IR index = insulin (μU/ml) × glucose (mmol/l) / 22.5 單位換算如下：
空腹血糖(mg/dl) × 0.0555 = mmol/l Mouse insulin kit 測得 insulin 單位為 μg/l
故空腹 insulin (μU/ml) = insulin (μg/l) × 174 / 7.175
Gravimetric unit Conversion factor SI unit insulin μg/l 172.1 pmol/l insulin μU/ml 7.175 pmol/l 註：Gravimetric unit × Conversion factor = SI unit
3、 血清 AST 濃度測定
(a) 原理
AST 主要存在肝細胞的細胞質內，當肝細胞受到傷害而破損時，AST 就會釋放出來。本實驗採用商業套組進行分析。AST 的作用為催化 aspartate 上的氨基(-NH2 group)與 α-oxoglutarate 上的酮基(-C-O group)互相交換，產生 oxaloacetate 與 glutamate，因此，AST 過去也被稱作 GOT。而 oxaloacetate 與 NADH+H+透過 MDH 的催化後，會產生產物 malate 及 NAD+，在 OD340nm 之吸光值測定 NAD+在 3 分鐘內的變化，計算得知 AST 之活性。
測 AST 的方法中主要有兩類：colorimetric 和 ultraviolet。本實驗是利 用 colorimetric 方法。
α-oxoglutarate + L-aspartate AST(GOT) L-glutamate + oxaloacetate
oxaloacetate + NADH + H+ MDH
L-malate + NAD+
(b) 實驗步驟
(1) 先取 20 ml R1a reagent (buffer/substrate)加到一瓶 R1b (enzyme/coenzyme/α-oxoglutarate)，使其回溶至液體狀 (2) 在每個 well 中加入 200 μl reagent
(5) 用 ELISA reader 設定 kinetic 測定 OD340nm 之 1、2、3 分鐘吸光值
(c) 計算方法
AST activity (U/l) = 1746 × ΔA340 nm/min
4、 血清 ALT 濃度測定
(a) 原理
ALT 主要存在肝細胞的細胞質內，當肝細胞受到傷害而破損時，ALT 就 會釋放出來。ALT 的作用為催化 alanine 上的氨基(-NH2 group)與 α-oxoglutarate 上的酮基(-C-O group)互相交換，產生 pyruvate 與 glutamate，因此，ALT 過去 也被稱作 GPT。而 pyruvate 與 NADPH+H+透過 LDH 的催化後，會產生產物 lactate 及 NAD+，在 OD340nm之吸光值測定 NAD+在 3 分鐘內的變化，計算得 知 ALT 之活性。
測 ALT 的方法中主要有兩類：colorimetric 和 ultraviolet。本實驗是利 用 colorimetric 方法。
α-oxoglutarate + L-alanine ALT(GPT) L-glutamate + pyruvate
pyruvate + NADH + H+ LDH
L-lactate + NAD+
(b) 實驗步驟
(1) 先取 20 ml R1a reagent (buffer/substrate)加到一瓶 R1b (enzyme/coenzyme/α-oxoglutarate)，使其回溶至液體狀
(2) 在每個 well 中加入 200 μl reagent (3) 在 37 下 incubate 5 分鐘後取出 (4) 並快速取 20 μl 血清樣品到 96 孔盤中
(5) 用 ELISA reader 設定 kinetic 測定 OD340nm 之 1、2、3 分鐘吸光值
(c) 計算方法
ALT activity (U/l) = 1746 × ΔA340 nm/min
5、 肝臟均質液蛋白質濃度測定
(a) 原理
以 Lowry et al.(1951) Bradford protein-binding assay 的方法進行蛋白質 定量，此定量是利用 coomassie brilliant blue G-250 會與蛋白質結合的特性，
在 G-250 與蛋白質結合後，G-250 的顏色會從紅色轉變成藍色，在 595 nm 的波長下可測得其吸光值，故可利用其吸光值計算樣品之蛋白質濃度。此 定量方法的優點為 G-250 與蛋白質結合所需的時間很短(2 分鐘)，且結合 的 G-250 蛋白質複合物可在溶液中維持較長的時間。
(b) 實驗步驟
(1) 配置標準品，濃度配製如【表 4-3】
【表 4-3】蛋白質測定的標準品配製
編號 S0 S1 S2 S3 S4 S5
BSA(µl) 0 10 20 30 40 50
二次水(µl) 100 90 80 70 60 50
濃度(mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 (2) 將肝臟均質液稀釋 40 倍
(3) 分別取標準品及均質液樣品各 10 µ l 依序加入 96 孔盤 (4) 避光後，稀釋 Bio-rad 染劑 (Bio-rad 原液：二次水= 1：4) (5) 加入 200 µ l 的稀釋染劑到各 well 內
(6) 在室溫下使用震盪器反應 5 分鐘後
(7) 使用 ELISA reader 測定其 OD595nm之吸光值
(c) 標準曲線之製作
使用BSA 作為實驗標準品，將標準品原液分別稀釋成為0、0.1、0.2、
0.3、0.4、0.5 mg/ml。標準品和樣品同時以上述方法分析測定後，以標準 品濃度為X軸，所測得其OD595nm 吸光值為Y軸，則可得一標準曲線。
(d) 計算方法
測得實驗樣品於波長OD595nm 下之吸光值後，依據標準曲線以內插法 代回一次方程式(y = ax+b)計算，再乘回稀釋倍數(× 40)，則可求得樣品之 蛋白質濃度。
6、 肝臟粗萃脂均質液中 TG 濃度測定
(b) 原理
本實驗是利用三酸甘油酯經由 LPL 水解成甘油及脂肪酸，甘油藉由 GK 與 ATP 作用產生 ADP 及 G-3-P，G-3-P 再經 GPO 氧化作用產生 H2O2及 DAP，
產物 H2O2再與 4-aminoantipyrine 及 p-chlorophenol 經 peroxidase 氧化產生紅 色 4-(p-benzoquinone-monoimino)-phenazone 的產物，最後於 OD546nm波長下測 定紅色產物的吸光值。
(c) 實驗步驟
取肝臟粗萃脂均質液各取 10 μl 與 10 μl triton X-100 混合，經真空抽乾 後，與 10 μl 標準品，分別加入含有 pipes buffer、p-chlorophenol、LPL、
GK、GPO、4-aminoantipyrine、peroxidase 、 ATP、Mg2+、Na-cholate 及 potassium-hexacyanoferrat (Ⅱ) 之 1 ml 溶液中，混合均勻，於 37 下反應 5 分鐘後，測定 OD546nm之吸光值。
(d) 計算方法
Δabsorbance sample
TG con. (mg/dl) = × Standard con (200 mg/dl).
Δabsorbance standard
7、 肝臟粗萃脂均質液中 TC 濃度測定
本實驗是利用 cholesterol esterase 先將膽固醇酯分解成膽固醇與脂肪酸，
膽固醇再經 cholesterol oxidase 氧化產生 cholestene-3-one 及 H2O2，H2O2與 phenol 及 4-aminoantipyrine 經 peroxidase 作用下產生紅紫色之 quinoneimine 產物，最後於 OD500nm波長下測定紅紫色產物的吸光值。
(b) 實驗步驟
取肝臟粗萃脂均質液各取 10 μl 與 10 μl triton X-100 混合，經真空抽乾 後，與 10 μl 標準品，分別加入含有 pipes buffer、cholesterol oxidase、cholesterol esterase、4-aminoantipyrine、peroxidase 及 phenol 之 1 ml 溶液中，混合均勻，
於 37 下反應 5 分鐘後，測定 OD500nm之吸光值。
(c) 計算方法
Δabsorbance sample
TC con. (mg/dl) = × Standard con (200 mg/dl).
Δabsorbance standard
8、 肝臟粗萃脂均質液中 LDL 濃度測定
(e) 原理
(e) 原理