本論文的重點在利用微晶片偵測討大蒜素(DADS)對於人類大腸腫瘤細胞株 ( Colo 205)之基因表現的影響。也就是經由 MICRO-ARRAY 來篩檢有那些調控 基因可能經由大蒜素的作用而調升表現或或受到抑制，並進一步分析其結果，
來確認大蒜素與人類大腸腫瘤細胞株之基因表現間的關聯，並探討可能的抗癌 機轉。
第一節 材料 一、人類大腸癌細胞
人類大腸癌細胞株（Colo 205），台北榮民總醫院提供這些癌細胞株，培養 於含 10％胎牛血清的 RPMI 1640 培養基，並加入( Penicillin 50ug/ml 及 strepmyin 50mg/ml ) ，置於 37℃5％二氧化碳的細胞培養箱。本實驗採以 Colo 205 細胞株 為材料，有其下列方便好處；1.這人類大腸癌細胞株（Colo 205），是 1975 由一 男性高加索羅患大腸腺細胞癌分離出，細胞株穩定。2.價格不貴( ATCC 的價格 167 美金) 。 3.生物安全指數很好(1 級)。4.易於培養及冷凍運送。5.裸鼠皮下 種植 21 日 即可成長 1,2,28。
二、中藥：大蒜素 DADS 由本院醫研所鍾景光教授提供 三、基因晶片：
本實驗所用的7680點晶片是由 ABC 公司所提供 ABC Human Universo Chip 8K-1，基本的實驗步驟亦參照其方法 4,11,51。
第二節 方法
一、純化及萃取 RNA：
目前我們使用微陣列晶片標準化操作實驗程序，從細胞株萃取純化總量 RNA (含 polyA RNA)。萃取純化 RNA 時，請小心避免 RNase 污染樣品。總量 RNA 可利用傳統的超高速離心，一般 TriZol 萃取與吸附性管柱萃取法分離之。
本次實驗的方法如下：
實際純化步驟(for Rneasy Midi Kit)4,66：
1.本實驗取 5 ×106cells of Colo 205，分別分實驗組 (加)或對照組(不加)大蒜素 2.5Μm，並移入 37℃ 5％CO2 培養箱培養 24 小時，再加入適當量 RLT 緩衝
液到細胞株中,攪拌均勻溶解. 將細胞打下。
2.將樣品置入 QIA shredder 吸附性管柱 ,以 14,000 rpm 離心 2 分。
3.倒除上清液。
4.以 pipet 加入同量 體積的 70% 乙醇到溶解細胞中,重複數次。
5.上含 Rneasy 管加滿到 700μl 以 14,000 rpm.離心 15 秒，倒掉上層液。
6.加 700μl RW1 緩衝液到 Rneasy 吸附性管柱中. 蓋住試管口以 14,000rpm 離心， 倒掉上層液。
7.上述樣品移到 2 ml 收集管中。
8.Pipet 加入 500μl RPE 緩衝液 以 14,000 rpm.離心 15 秒。
9.Pipet 加入另外 500μl RPE 緩衝液 以 14,000 rpm 離 2 分，乾燥。
10. 沖 洗 ， 轉 置 Rneasy column 到 一 2 ml 收 集 管 . 以 pipet 加 入 50 ul Rnase-free 的水， 1 分鐘後以 14,000 rpm.離心一分鐘。
11.重複上述步驟並使 Rnase-free water 減量到 30μl. 且離心 1 min，下層即 RNA，再於 260nm 下測 OD 值。最後將 RNA 交由 ABC 生技公司進行 micro-array 之分析。
二、純化 mRNA：
利用 mRNA 特有之 poly(A) tail，以吸附性管柱來純化 mRNA，本次實驗的 方法如下：又叫 OligotexTM Procedure (Qiagen)。
製備 OBB – 加熱到 37°C 以溶解沉澱物.
Oligotex suspension –加熱到 37°C, 混合並置入 RT.
OEB – 加熱到 70°C
以 Centricon 30 將 total RNA樣品含量少於 500 µg 體積減量到 500 µl體積 未達
假如初始體積 未達500ul,則加入 RNAse-free water使其達500ul
假如初始體積未達 500ul,則 加入 RNAse-free water 使其 達 500ul
2. 加入 500 µl of OBB.
3. 加入 30 µl oligotex 懸浮液.
4. Votex.
5. 70°C 培養 for 3 min.
6. 從溫室箱取下, 至於 RT 10 分
7. 以 14,000 x g， 離心 2 分
8. Resuspend the pellet in 400 µl OW2 by vortexing or pipeting
轉置 the supernatant 到一乾淨試 管
.
9. 轉置到一小的 spin column. 加入 10 µl of Oligotex 懸
浮液
10. 以 14,000 x g 離心 1 min. 再重複步驟 4 一次
11. 轉置 the spin column 到一新的
RNase-free 1.5-ml microcentrifuge tube.
12. 加入 400 µl OW2.
13. 以 14,000 x g 離心 1 min. .
14.. 轉置 the spin column 到一新的 RNase-free 1.5-ml microcentrifuge tube.
15. Pipet 50 µl 熱 OBE, 吸入或吸出 3 or 4 次 來沖洗 resin;
. 以 14,000 x g 離心 1 min
16. Pipet 50 µl 熱 OBE, 吸入或吸出 3 or 4 次 來沖洗 resin; . 以 14,000 x g 離心 1 min
17.將洗提液保存於冰中.
三、cDNA 探針合成及螢光標記：
對於真核 mRNA 新合成的 cDNA 以 Cy3-dCTPor Cy5-dCTP 來標誌。 以總量 RNA(含 polyA RNA)為模版，進行反轉錄標記，將螢光核甘酸標記在 cDNA 上。這 些已標記之 cDNA 將可與晶片上專一之基因雜交而螢光呈色。
1. 1ST 股合成 ( 1 探針)
假如有數個樣品以同樣螢光標誌, prepare a master mix.
Premi×1 Volume MRNA, 1.5-2μg 2μl Spike mRNA(Cy3 or Cy5) 5μl Random 9-mers @ 1μg/μl 2μl DT primer @ 8Μm 2μl
H2O 0μl
全部反應容量 11μl
．準備 premi×1
．輕輕震盪 旋轉沉澱
．70℃培養 10-20 分 (這時可以開始作 Premi×2 ).
．冰 30 秒, 旋轉沉澱,而且試管保持室溫.
Premi×2 Volume
5×Superscript Buffer 4μl
0.1M DTT 2μl
DNTPmix@5mM d(AGT)TP,1mM dCTP 1μl
Rnasin 1μl
Total premix×2 volume 8μl
．加 Premi×2 到反應試管, 以 pipet 吸入吸出混合.
Cy3 OR Cy5 @ 1nmol/μl(1mM) 1μl
．輕輕震盪混合 旋轉沉澱 此步驟不要曝光
Superscript RT (200u) 1μl
．輕輕震盪 旋轉沉澱.
．以保溫箱或溫水浴在 42℃黑暗中培養 1 小時.
．加入 1μl Superscript II and 繼續培養 1 小時.
2.分解 cDNA/mRNA 雜交物中的 mRNA 的半成量
．加 2.0μl 2.5 M NaOH 到每一試管輕輕震盪 旋轉沉澱.
． 37℃黑暗中培養 10-20min.
．加 10μl 2 M MOPS (or HEPES).
3. 純化探針 (Qiagen’s PCR 純化 columns).
．加 160μl of PB (Qiagen, PCR 純化 kit).
．以 0.06A-0.5A 範圍,掃讀 spectrum (210-700nm)．測量每一探針的螢光 pmol 及 g cDNA 合成量.
a.Cy3: abs 550×probe volume (μl)/0.15=pmol Cy3 probe b.Cy5: abs 650×probe volume (μl)/0.25=pmol Cy5 probe c.50-100 pmol 結合探針量已可以接受.
d.μg cDNA:(A260)×(40μg/ml)×(vol in ml)= μg of cDNA 5. 探針乾燥
四、雜交反應：標記 cDNA/探針雜交反應：
此步驟將已螢光標記之 cDNA 探針與晶片之基因探針混合作雜交反應，若 兩探針有互補性，則 cDNA 探針會附著在晶片基因上而其螢光可被定量。
1. 在 -20℃ 拿出雜培養在 42℃ 至少 5 分, 保存在 RT. 在-20℃雜交液中 SDS 會沉澱, 在 42℃培養下又會溶解.
2. 在 11.5μl 水蒸氣壓力鍋 溶解已組合細胞株乾燥探針
3. 以 PCR 將探針加熱到 95℃ 2－5 分來分解標誌 Cy3 及 Cy5 探針 . 4. 立即置入冰中 1 分鐘.
5. 加 1μl of poly (A)80(1mg/ml)(MWG) 以 pipetting 混合.
6. 在 PCR 儀器將探針加熱培養到 70℃ 20 分 離心收集.
7. 加 12.5μl of 4× 雜交緩衝液 (Pharmacia) and 25μl of deionized formamide (Sigma) 到探針.
8. 以含探針溶液 (50μl) 加到先前處理過晶片邊緣.
9. 慢慢滑過 晶片探針心壘.
10. 在 42℃培養在濕鍋 (80－90％) 14－16 小時.
Wash(清洗)雜交的晶片 Wash 1 : 1×SSC/0.2% SDS Wash 2 : 0.1×SSC/0.2% SDS Wash 3 : 0.1×SSC
在雜交後，第２日前：
1. 以溫水浴方式對 Wash 1 and 2 再加熱 (最好 54℃ 過夜).
2. 在清洗中，置放晶片容器在雜交溫箱中以定溫.
經 14－16 小時雜交 ,次日清晨
1. 以溫的 Wash 1浸泡晶片.假如溼度及探針溶液足夠, 覆蓋器滑行要立刻停止 . 在 54℃ 將晶片及含物置在含 Wash 1 溶液晶片載器中.
2. 培養 Washes 1－3 應放在震盪器並以金屬薄片覆蓋以避光.
3. 在 Wash 1(@54℃)培養 10 分.
4. 在 Wash 2 (@54℃) 培養 10 分。以清潔ｗash 2 (@54℃) 重複一次培養 10
分。
5. 在 Wash 3 (@RT) 培養 1 分. 以清潔 Wash 3 (@RT) 重複一次) 培養 1 分.
6. 重複步驟 2 快速浸泡 在 dH2O (@RT).
7. 以異丙醇浸泡晶片 10 次 並以氮氣乾燥以防異丙醇接觸到標籤.
8. 以自動模式掃描晶片.
.
五、晶片掃瞄
經過雜交反應及清洗之晶片將可作影像掃描 六、分析資料
利用不同軟體（GeneSpring and SpotFire）進行經掃瞄後之資料分析4,51,79。
七、Scorecard
本分析為利用已標定在晶片上之標準點、螢光標定控制組與 housekeeping 基因之間對本實驗之品質控制 51,66。
八、本 Microarray 實驗相關資料 1. Sample Handling
Sample type：RNA
Sample labeled：Cy3 (Green) for Reference (DMSO), Cy5 (Red) for Treatment (DADS）
Sample status & treatment：Normal 2. Use of Biochip
Chip Type：ABC Human UniversoChip 8K-1 Chip usage：1pcs（HU1201)
3. Quality Analysis Chip：Passed Image：Passed
Internal QC test：Qualified for analysis
4. Original Sample Status:
Sample type: RNA Organism: Human Tissue: Colon
Strain/Cell line: COLO 205
Disease: Tumor (Non-transmitted)
Genetic variation: Carcinoembryonic antigen Isolation method: Qiagen RNA kit
Treatment: DADS
Customer sample #: Control (DMSO) ABC sample #: 000417
Customer sample #: Exp. (DADS) ABC sample #: 000418
Storage: Dry pellets @ RT Total mass: 000417 = 90 g 000418 = 79 g Volume: 000417 = 90 l
000418 = 90 l
Concentration: 000417 = 1 g/?l 000418 = 0.88 g/?l A260/280: N/A
Gel analysis: 000417 and 000418 = O.K.
(See attached picture and note on page 2, Serial# 0201)
ABC Criteria:
Total mass > 0.1 mg/sample A260/A280 > 1.6
Examination: Total mass < 0.1 mg/sample
5. ABC Sample Status:
Sample #: 000417 000418 Mass 180.18 ug 144.2 1ug Volume: 16.5 ul 16.5 ul Con centration: 10.92 ug/u?l 8.74 ug/ul A260/280 2.364 2.362
A260/230: 1.902 1.884
Storage: DEPC water, frozen DEPC water, frozen Date Examnined: 01/07/2002
6. Total chip used: 1pc Chip number: HU1201 Date processed: 01/09/2002 Remark: Human 8K
RNA usage: ~5g each for quantification and gel analysis.
cDNA labeling: 000417 = 40.40g Cy3 000418 = 60.31g Cy5
Hybridization usage: 000417 = half volume labeled cDNA 000418 = total volume labeled cDNA Hybridization: 15.5 hrs @ 65℃
Scanning: 01/10/2002 Gel analysis: 01/07/02 Lane 1: 000417 = 3g Lane 2: 000418 = 3g
Summary Information of Scan
Scanned by：GenePix 4000B[84946] Analyzed by：GenePix Pro 3.0.5.56
When scanned：2002/1/10 05：03 Image wavelengths：635nm，532nm PMT (V)：830,700
Laser Power (V) ：2.9,3.5 Barcode：HU1201
Comment：Cy3：Reference (DMSO) Cy5：treatment (DADS)
GPS file：HU1201_0110_830_700.GPS GAL file：Hu8Kgall.gal
Temperature (V) ：29.1 Laser On-time：346,346 Ratio Formulation：W1/W2 (635nm/532nm)
第三節、實驗簡要流程及儀器
一 般 實 驗 流 程 Experiment Process4,66, 實 驗 流 程 圖 Experimental Procedures51,66, 及相關儀器設備 ,分別呈現於圖 3.1 - 3.5.