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中國醫藥學院中西醫結合研究所 碩士論文

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Academic year: 2021

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(1)

中國醫藥學院中西醫結合研究所 碩士論文

編號:GIICWM-91-9003

指 導 教 授:高尚德 教 授

共同指導教授:陳光偉 副教授兼所長 :林昭庚 教 授

:張永賢 教 授 :鍾景光 教 授

論文題目

大蒜成份 DADS 對大腸癌細胞株基因表現之微陣列分析

A Study of Microarray Analysis of Gene Expression of Colo-205 by DADS

研究生:林慶鐘

中華民國九十二年五月十四日

(2)

目 錄

目 錄 ---I 圖 目 錄---II 表 目 錄---IV 致 辭 ---V 中文摘要 ---VI

第一章 前言 ---1

第二章 文獻探討 ---6

第三章 材料與方法---17

第四章 結果 ---29

第五章 討論 ---36

第六章 結論 ---42

圖表---45

參考文獻 ---71

英文摘要 ---79

作者個人資歷簡表 ---80

(3)

圖 目 錄

圖 1 臺灣地區主要死亡原因 (89/90 年之比較)---45

圖 2 89/90 年臺灣地區主要癌症死亡百分比之比較---45

圖 3.1 基因微陣列晶片分析流程---46

圖 3.2、實驗流程圖---46

圖 3.3、Array System (微陣列儀器組) ---47

圖 3.4、Array Spotter (微陣列探針) ---47

圖 3.5、Automatic Slide Processor (自動化晶片處理器)---48

圖 3.6、Array Scanner (微陣列掃描儀) ---48

圖 4 大蒜素實驗組/對照組(DADS/DMSO) 的基因點狀散布圖---49

圖 5 大蒜素實驗組/對照組(DADS/DMSO) 的基因點狀散布圖---49

圖 6 實驗組/對照組(DADS/DMSO) 的基因點狀立體散布圖 ---50

圖 7 實驗組/對照組(DADS/DMSO) 的高表現基因點狀立體散布圖----50

圖 8 實驗組/對照組 經標準化取對數值的基因柱狀頻率圖 ---51

圖 9 實驗/對照組 經標準化取對數值的上調基因柱狀頻率圖---51

圖 10 實驗/對照組 經標準化取對數值的下調基因柱狀頻率圖---52

圖 11 實驗組/對照組(DADS/DMSO) 的基因點狀平面散布圖---52

圖 12 實驗組/對照組(DADS/DMSO) 高表現基因點狀平面散布圖---53

圖 13 實驗組/對照組(DADS/DMSO) 標示良好的高表現基因點狀平面散布圖-53 圖 14 基因晶片 32 小方塊每一基因點以 Cy5,Cy3 處理之數值落點---54

圖 15 基因晶片 32 小方塊每一基因點以 Cy5,Cy3 處理之數值落點---55

圖 16 大蒜素 DADS 與 DMSO 的晶片雜合後以波長 635nm 掃描呈色圖---56

圖 17 大蒜素 DADS 與 DMSO 的晶片雜合後以波長 532nm 掃描呈色圖---57

圖 18 大蒜素 DADS 與 DMSO 雜合後 Ratio[635nm/532nm] 的晶片呈色圖 58 圖 19 大蒜素 DADS 與 DMSO 雜合後 Ratio[635nm/532nm] 的晶片呈色圖 59. 圖 20 大蒜素 DADS 與 DMSO 雜合後 Ratio[635nm/532nm] 的晶片呈色圖 59 圖 21-1 細胞凋亡(Apoptosis)相關基因及路徑(Pathway) ---60

(4)

圖 21-2 細胞凋亡(Apoptosis)相關基因及路徑(Pathway) ---60

圖 22 細胞週期調控在 G1/S 的狀態---61

圖 23-1 P53 , apoptosis, cell-cycle arrest---62

圖 23-2 HIV 以 CCR5 活化 Fas,促使 T CELL 凋亡路徑圖---62

圖 24 CHUK 基因經由 DR3 and DR4/5 致死因子蛋白? 結合後誘發細胞凋亡之路 徑---62

圖 25 凋亡基因 DAP-1 上調 DAP-1 蛋白及啟動細胞凋亡之機轉圖---63

圖 26 抗凋亡基因 DENN 下調 MCL1 及 MADD 蛋白後啟動細胞凋亡之機轉--63

圖 27 藥物作用於癌細胞,啟動凋亡基因及抗凋亡基因相互拮抗以殺癌細胞之 機轉圖---64

(5)

表 目 錄

表 1 未標準化 Up regulated gene (Treatment/Reference)---65

表 2 未標準化 Down regulated gene (Treatment/Reference)---65

表 3 未標準化高表現基因的 ratio 值及功能---66

表 4-1 標準化的高表現基因的 ratio 值及功能---68

表 4-2 標準化的高表現基因的 ratio 值及功能 (續表 4-1)---69

表 5 532 nm, 635nm, 635nm/532nm 及 Vital Statistics.---70

(6)

致 謝

首先感謝高所長尚德教授多年來的鼓勵和教導,在艱辛的學習過程 中才得以找到正確的方向並持續不懈。更要感謝本所陳所長光偉教授對於 我的研究,於公於私,都充分的支持與指導,使我本次的研究得以順利完 成。同時也要感謝張永賢副院長教授及本所謝長奇、陳芳周博士及中央研 究院徐松錕博士不吝撥出時間充分指導及協助,才得以對於基因晶片統計 數據作進一步分析。也特別要感謝鍾教授景光對於基因晶片製作指導。

在中國醫醫藥學院附設醫院之中西醫合作醫療中心及署立豐原醫院中 醫科主任從事中醫工作近十多年來,每感中醫的科學化的研究及中西醫結 合的迫切性。也感謝有此機會再加入中西醫結合研究所的領域,這二年來 並蒙林董事昭庚教授、謝慶良副院長的關心與指導,在此誌由衷的感謝。

另外要感謝衛生署立豐原醫院徐院長永年體諒與不時的鼓勵,讓我在繁忙 的醫療工作之餘,能至中西醫結合研究所繼續研讀。另外在全文寫作期間,

也感謝姪兒林育薪、陳建智幫助,才得以完成各項統計圖表的製作。

最後要感謝的是父母元明及岳父李從老中醫師及妻美華體諒支持及兒 維邦、佑昇的鼓勵。

中西醫整合的研究方向及工作是日新月異,永無止境,希望在未來人 生,繼續奉獻自己綿薄之力,在中西醫結合的領域中探索,以便為中醫的 科學化及中西醫結合工作做進一步的貢獻。

(7)

中 文 摘 要

本論文的重點在利用微晶片偵測大蒜素 DADS 處理人類大腸腫瘤細胞株 Colo 205 之基因表現的影響,並以生物資訊含 GenePix 軟體來篩檢分析那些調控基因 可能經由大蒜素的作用而活化上升或受到抑制,以確認大蒜素與人類大腸腫瘤 細胞株之基因表現間的關聯,並探討可能的抗癌機轉。結果顯示經 DADS 處理後,

大部份的基因表現並不活躍(non-signaficiant), 少部份基因才有高表現 (Ratio of median 大於 2 或小於 0.5),且其統計數值分二種:

一、未經標準化統計時:(1)共有 366 個基因被活化上調(up-regulation) : 表 現 量 最 大 的 基 因 是 transgelin ; 其 他 包 括 Homo sapiens U5 snRNP-specific protein、116Kd(U5-116KD) mRNA、Myosin VI 等;(2)1169 個基因被抑制下調(down-regulation)。其中最受抑制基因的是;Aquaporin 6, kidney specific;其他包括 Ribosomal protein S17;等。

二、標準化組,(1)共有 540 個基因被活化向上調控表現。其中表現量較大 的基因分別是: ME1;AARS;GGCX;RPP2;UBA2;CHUK 等。(2)518 個基因被下 調抑制調控。其中最受抑制的基因是 PPPR1A。

研究初步發現 DADS 對於 Colo205 癌化細胞株的抑制,有很多細胞分裂機轉 及基因參與調控。有一部份是透過 Apoptosis 的作用,而且是經由活化 Apoptosis 的 基 因 及 抑 制 抗 Apoptosis 的 共 同 參 與 作 用 來 促 成 Colo 205 細 胞 株 的 Apoptosis,達到抑制毒殺癌細胞。表現上調的基因(>2.0)有 DAP-1(2.25),

TRIP9(2.07)。下調基因有 Bf1-1(0.42)、BCL2-related(0.39)、Daxx(0.38)、

DENN(0.32)。即大蒜素 DADS 會活化 Apoptosis 的基因(DAP-1)及抑制抗 Apoptosis 的基因(BCL2 及 DENN),而共同造成 Colo 205 癌化細胞株的死亡。

DADS 也會抑制 Colo 205 細胞株 Oncogene 基因的表現,其基因 ratio 值分 別為 Aplysia ras-related homolog 12(0.29);rho G 因(0.24)。即 DADS 會 抑制 G 蛋白訊號傳遞達到抑癌的作用。

目前的研究表明,DADS 可能通過調控癌相關基因表達以及通過阻抑癌細胞 周期進程等途徑來抑制大腸細胞株 Colo 205 癌細胞增殖,誘導癌細胞分化及凋 亡,達到大蒜能治癌的研究目的。其它基因 CCR5、RAGB(GTP-binding)、PPP1R1A、

TNF superfamily member 12 的調控表現亦一併於文中討論。

(8)

Abstract

cDNA microarray was applied to detect the effectiveness and genes expression of human cancer cells Colo 205 which were treated by garlic extraction DADS . The results were also analyzed by Genepix software to explore up and down regulated genes of Colo 205’s cells .The results showed that mostly genes were non-significant;

only partly of genes had high expression (up; ratio of medians> 2.0 ; down <0.5). The

ratio of medians were analyzed in two statistics’ methods:

1. Non-Normalization: (1) There were 366 genes for activated (up) regulation;

the highest was transgelin; the others including Homo sapiens U5 snRNP-specific protein, 116Kd (U5-116KD) mRNA;Myosin VI etc, (2) 1169 genes were for down regulation (inhibited). The highest inhibited genes were Aqraporin 6,Kidney specific;

the others genes including Ribosomal protein S17;etc.

2. Normalization; (1)There were 540 genes for up regulation. The highest expression genes were ME1; AARS; GGCX;RPP2;VBA2;CHUK. (2) 518 genes were for down regulation. The highest down genes was PPPR1A.

Our study had revealed that there were many genes and mechanisms involved in Colo 205’s genes regulated expression by DADS. The apoptosis genes coordinated anti-apoptosis genes together to regulate Colo 205 cells ’ apoptosis expression. The up regulated genes (>2.0) were DAP-1(2.25), TRIP9(2.07). The down regulation genes were Bf1-1 (0.42)、BCL2-related(0.39)、Daxx (0.38)、DENN(0.32). The DADS had up regulated apoptosis genes (DAP-1) and inhibited (down) anti-apoptosis at same time to inhibited Colo 205 cells’ growth.

DADS also inhibited Colo 205’s Oncogene expression. The ratios of these genes were Aplysia ras-related homolog 12 (0.29); rho G (0.24). The transmitted of G-protein message was inhibited by DADS.

Our study showed that DADS had regulated gene expression to control Colo 205 cells’ growth. Garlic can be a useful cancer therapy agent in our study. The other genes; including CCR5、RAGB(GTP-binding)、PPP1R1A、TNF superfamily member 12 regulated expression genes ; were also studied in our article.

(9)

第一章 前言

一、惡性腫瘤(稱為癌症)

癌症是當今世界上威脅人類最嚴重的疾病。臺灣近十餘年來,癌症一直是 十大死亡原因的第一位,據行政院衛生署於民國八十九及九十年的統計,在國 人十大死亡原因中,惡性腫瘤居第一位,以台灣九十年的人口總死亡數 124,841 中,因惡性腫瘤而死亡的人數達 31,544(25.6%),高居台灣居民所有死亡原因的 第一位。其中因各式惡性腫瘤(癌症)而死亡人數總數量排列中;直腸及結腸癌 高居男女十大癌症死亡原因之第三位,九十年死亡人數達 3,457(10.4%)9,25。由 八十九及九十年的統計圖表圖 1 及圖 2 中,顯現這二年台灣人口的死亡原因及 排名,並無顯著的變化,癌症仍是佔台灣居民十大死亡原因的第一位;而直腸 及結腸癌則居十大癌症死亡原因之第三位。在美國直腸及結腸癌則居其十大癌 症死亡原因之第四位26。由此可見惡性腫瘤,乃至於大腸腫瘤的防治,是國內外 中西醫界一個值得探討重要的主題 1,2,9,41。如何預防及治療癌症是許多生命科學 相關領域工作者致力探討發展的方向。近年來國內外雖投入甚多的人力物力,

但對癌症的治療仍然還找不出理想的方法,治療效果仍然不彰 29二、大腸癌

大腸癌可分家族遺傳性及非家族遺傳性。家族遺傳性大腸癌,係導因於一 種遺傳物質 DNA 配對錯誤,修補基因發生突變或缺損所造成,使得 DNA 在複製 過程當中一旦發生配對錯誤卻無法適時加以修補則產生癌變。而大部分大腸癌 並沒有家族病史,也不具有遺傳性。其大腸癌的發生過程常常是漸進式的,而 且包含了許多基因的問題,常常由正常的大腸粘膜上皮細胞變為分化不良,再 變為腺瘤,再變為大腸癌 1,26,29,34。具牽涉到的基因變化包括 APC (Adenomatous polyposis coli)基因、DCC(Deleted in colon cancer)基因、DNA 去甲基化 (hypomethylation)、以及 P53 基因29,55,85。這些發生變化的基因有許多是〝抑癌 基因〞例如 APC、DCC、及 P53 均屬抑癌基因。眾所週知的 P53 基因在細胞內主 要負責兩大作,第一是當 DNA 受到損害時會使這個細胞停留在細胞週期的 G1

(10)

期,不再繼續往下進行 DNA 的合成與複製,以便進行修補。如果 DNA 受損太過 嚴重,則 P53 會啟動讓該細胞進行〝凋亡〞(apoptosis)的訊號,使該細胞死亡,

以免產生異常的子細胞而形成癌症。如果 P53 出現突變或是有缺失,則上述不 正常的子代細胞可能會一直不斷產生,最後發生癌變 7,10,29,76

有報告指出中藥能調節和免疫系統並殺死癌細胞,如雷公藤的有效成分 Triptolide(雷公藤內脂醇)及太平洋紫杉樹皮中 Poolitaxe(紫杉醇),多能 夠抑制過分活躍的免疫系統,阻止感染,殺死癌細胞。其有效成分與其 DNA 目 標相結合,能夠阻止啟動一種與 DNA 相結合的蛋白質 NF-KL﹔這種蛋白質是一 種非常重要的分子,一旦被啟動,就能夠啟動其他有免疫重要性的基因,從而 加劇免疫反應,這種藥物殺死癌細胞的途徑與 P53 基因無關,能殺死對化療藥 物有抗藥性的癌細 15,60

三、大蒜

大蒜(Alliam sativum),長久已來被作為食物和醫用目的,己經被證實有 抗生素的作用,殺黴菌的敦用,抗溶血作用,和抗壞血病的作用 1,13,22。最近有 些報告指出大蒜某些成份有能作為抗癌細胞的特性,大蒜預防腫瘤,其他研究 者也己經報告大蒜有效防止或治療某些特殊慢性疾病,例如心肌的疾病、高血 壓,和癌症等 1,12,16。大蒜主要的生物活性物質是含硫化合物。現代藥物化學研 究証明大蒜內含硫成分多達三十餘種 ,其中主要的含硫化合物有二烯丙基一硫 化物 diallyl sulfide (DAS)、二烯丙基二硫化物 diallyl disulfide (DADS)、

二烯丙基三硫化物(DATS)等) 等,對大腸癌細胞有抑制作用 1,12,23。陳光偉博士 報告1指出大蒜的有效成份 DAS,DADS 能顯著的抑制人類大腸癌細胞中和細胞溶 解的 Cytosol 的 NAT 的活性。可抑制人類的腫癌細胞。不? 濃度 DAS、DADS 對 大腸癌培養,其結果為當 DAS、DADS、濃度愈高時其對大腸癌培養細胞的抑制率 愈高。在對細胞週期方面的影響,DAS 和 DADS 可以把大腸癌細胞的分化聚積在 G0-G1,期而減少在 G2-M 及 S 期,使之分化良好 1

世界癌症研究基金會發布大蒜對治療、直腸癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌皮 膚癌等有顯著療效的公報後,全球掀起一股“大蒜熱”•以各種大蒜為主原料 制成的食品甚為暢銷。德國一家醫藥公司還率先研製出大蒜液、大蒜膠囊用于 臨床心血管症及癌症,深受醫生和病人的青睞,藥品供不應求 1,15,23

(11)

四、DNA 晶片

DNA 晶片的原理是將數千或數萬點(spot)單股的 DNA 又稱探針(probe),以高 密度的方點製在拇指般大的晶片上(玻璃片或是尼龍薄膜)。DNA 探針主要有兩種 來源: 核甘酸 oligonucleotide 和已經存在於基因庫中的互補核甘酸 cDNA. (1) 寡核甘酸晶片主要是利用 DNA 的 A、T、C、G 四種鹼基,用類似築摩天高樓的方 式, 一個個不同的組合, 築上約 20~25 個(層)寡核甘酸.(2)互補核甘酸 cDNA 的 晶片主要是利用從病人的檢體或是其他的生物體抽取出的已知的互補核甘酸, 將這些互補核甘酸點在晶片上 4,11

簡單而言,基因晶片(Gene chip),又稱 DNA 晶片(DNA chip)或 cDNA 微矩 陣(cDNA Microarray),其技術是將大量之基因探針(cDNA、Oligonucleotide) , 按照特定的排列方式固定在載體上形成 DNA 微陣,然後將特殊標記處理後之檢 體 RNA(cDNA)與基因晶片上之基因探針進行雜交配對(Hybridization),以雷射 掃描後,透過基因密碼互補比對之雜交訊號來判讀基因表現強度,最後藉由電 腦及分析軟體,可同時獲得、分析成千上萬個基因資訊,判讀其各個基因表現 的強度。基因晶片由於具有高統計輸出量、操作容易、分析信賴度及精確性高、

使用檢體樣品少、應用範圍廣可獲得整體性(平行化)的實驗數據等優越特性。

已被公認為 21 世紀最強大的基因分析工具之一11,51-56。以傳統實驗室為例,一天 只能測定十幾個 DNA 片段,相當於 4000 個鹼基對;如果以人類基因定序團隊所 使用的 PE3700DNA 序列分析儀來比較,一天可測得的速度為 2000 個 DNA 序列,

相當於 70 萬個鹼基對。生物晶片有多快?「它 15 分鐘內就可以完成 1.6 萬個 鹼基對,如果以 96 個生物晶片平行檢測,就相當於每天可分析 1.47 億個鹼基 對 4,11,40-44

生物晶片的種類有五種,分別是:1.Microarray (cDNA or oligonucleotide) 2.DNA Chip (in situ synthesis) 3.Protein/Antibody Chip 4.Tissue Chip 5.Lab-on-a-chip。本實驗生物晶片是採 cDNA Microarray51,83

本實驗使用 Microarry 其優點至少有下列五點;1.大量樣本 2.同時分析 大量基因 3.自動化分析 4.分析差異表現基因 5.剖繪基因表現輪廓。至於 晶片檢測方法有:1. Fluorescent detection (螢光偵測) 2 .Colorimetric detection (免疫酵素呈色法)3. Radio-isotopic detection (放射線偵測)。

本實驗則以螢光偵測法偵測 36,51,66

(12)

五、本實驗目的

本實驗是企圖以基因晶片微陣列來檢測分析篩選抗腫瘤中藥藥物,並探討 其基因調控表現及其可能作用機轉。由於微陣列基因晶片驗評估方法的好處是 多靶向、多基因作用,而且短時間可評估高速且大量基因作用表現 6,8。目前文 獻指出很多中草藥具有抗腫瘤(抗癌)作用,而中草藥治癌也有很多評估方法

1-10,但也較少有作者用到微陣列基因晶片來評估中藥的抗癌性。以一般實驗方 法是費時曠日,而且甚耗人力物力,以微陣列基因晶片 Microarray 方法恰可彌 補以前評估作業平台, 耗時耗力的不便,可同時快速完成進行多目標基因的篩 選。

我們期望發現大蒜的成份 DADS 切實有抗癌作用,其在微陣列基因晶片的作 用表現上,經雜交混合,並經螢光掃瞄,基因晶片每一點的顏色反應有其特殊 定義;被活化的抗癌基囚會呈現橘色反應,並經 microarry 統計數值分析,期 望有較高的數值。對於促癌基因(Oncogne)則希望被抑制,在基因晶片呈現黃 色,在 microarry 統計數值分析,有較低的數 51,67,77

總而言之,本實驗目的旨在以一微陣列基因晶片方法來探討大蒜成份 DADS 對大腸腫瘤細胞株 Colo 205 的抗癌效果及其可能基因表現,作一初步評估,並 探討其抗癌作用及可能使癌細胞凋亡的機轉,以便作為日後其他中草藥抗癌的 作用的參考。

我們期待以目前的方法及初步結果,可以作為日後篩選各類抗癌中草葯在 治療人類腫瘤的效果及基因表現評估方式,可以預見這種方法是大量簡便且快 速的,此中西醫結合的研究方式,期盼對人類抗癌研就領域帶來新的境界。

(13)

第二章

文獻探討

第一節 大蒜探討

大蒜(Aliums sattvum L)為百合科多年生草本藥用植物,辛性溫 ,歸脾、

胃、肺經 3。在中國和世界各地作為民間用藥及食物用品已有數千年的歷史。大 蒜為西漢張騫出使西域時帶回中國,歷史上「 西域」簡稱為胡,故大蒜又名胡 蒜,。大蒜的適應性很強 ,目前中國大陸的大蒜產量高居世界第一位 12

《本草綱目》記載﹕大蒜“其氣熏烈,能通五臟、達諸竅、去寒濕、避邪惡、

消腫、化癥積肉食 3。”

《本草選錄、名醫別錄》:“散腫瘡,風邪,殺毒氣 10。”

《中醫大辭典》此書綜述歷代典籍整理,將大蒜的藥用價值概括為“行滯 氣,暖脾胃,消疳積,解毒,殺蟲,以治飲食積滯,脘腹冷痛,水腫脹滿,痢 疾,瘧疾,百日咳,癰疽腫毒,白禿瘡癬,蛇蟲咬傷 3,10

中醫常以大蒜用於驅蟲、散癰腫、除風濕、通氣血及健脾胃 12。其中古時文獻 中所提到的大蒜可以「消腫、化癥積肉食」「散癰腫」,可能就是現今所指的大 蒜可治癌症腫塊。

一、 大蒜的化學成分

大蒜所含化學成分十分複雜大蒜含有人體所必需 17 種氨基酸等豐富蛋白 質、多種糖類、多種維生素、脂肪、無機鹽及含硫化合物等各種成分。大蒜並 含有揮發油、多種礦物質及微量元素 12。大蒜油為大蒜的主要活性部份 ,油中含 硫化合物多達三十種 ,其中主要的含硫化合物有;二烯丙基一硫化物(DAS)、二 烯丙基二硫化物(DADS)、二烯丙基三硫化物(DATS)等。其中,二烯丙基三硫又 名大蒜素。又大蒜中少量元素的硒、鍺、等稀有元素具有有抗凝血、降血壓、

解毒、抗癌、抗氧化、抗老化以及有調節機體內免疫調節的重要作用 11,15,22二、 大蒜的現今藥理作用

大蒜具有良好的抗菌、抗癌、防癌和免疫調節發作用 1,12

(14)

1.抗菌作用

在實驗室,大蒜素對多種致病細菌如葡萄球菌、肺炎的雙球菌、鏈球菌、

及痢疾大腸桿菌、霍亂弧菌等細菌的成長,有明顯的抑制和毒殺作用 1,12,15

2.抗真菌作用

大蒜對多種致病真菌包括白色念珠菌等;皆有抑制和毒殺作用 15

3.對免疫系統的影響

大蒜會影響腫瘤宿主的免疫系統,大蒜油可使腫瘤細胞內中性白血球、

巨噬細胞和淋巴細胞數量增加 ,對癌細胞有直接細胞毒殺傷作用。大蒜油和 大蒜素可提高腫瘤組織內的cAMP水平,抑制腫瘤組織的生長 15,324.心腦血管

大蒜主要通過抑制抗血小板聚集,增加纖維蛋白溶解? 的活性,降血脂 與防治動脈粥樣硬化等作用,來防止患者有關心腦血管疾病的產生,達到大 蒜可以清人體血管的作用 68

5.抗腫瘤作用

依世界地流行病學調查研究結果,食用大蒜的人群組,胃癌發生率比對 照人群組有顯著低下。這是由於大蒜阻斷致癌物質亞硝胺的形成 ,也防止消 化道癌變的可能。也就是大蒜中所含的硫基化合物,與亞硝酸鹽比較有競爭 性地結合在一起 ,從而阻斷亞硝胺化學的合成,減少癌症的產生。食用大 蒜,會抑制胃內硝酸鹽還原菌的生長 ,從而使胃液中的細菌作用而產生的亞 硝酸鹽減少 ,大蒜可使致癌物的前體不能活化 ,亞硝酸鹽是強致癌物亞硝 胺的前體 ,大蒜及大蒜素可抑制胃液中硝酸鹽還原菌的生長,從而降低胃液 中亞硝酸鹽的含量 ,阻斷亞硝胺的合成 ,達到對胃癌的預防和治療作用

13,68

大蒜素對 MNNG (Nmethyl N’nitronitroso guanidine ) 誘發大鼠腺、

胃癌及癌前病變有顯著逆轉與抑制作用;大蒜素可明顯抑制甲基硝基亞硝基 鳥糞嘌呤等化學致癌劑誘發的結腸癌的發生率, 並提高機體細胞免疫功能

(15)

13,68

。其中因大蒜內含大蒜素 ,可將其成分蒜氨酸 (Allin)轉變為蒜辣素 (allicin) ,蒜辣素含“ -S-S-”基團 ,能抑制許多含佛基的? ,可將

“ -SH”基氧化成“ -S -S -” ,從而抑制癌細胞分裂 31

根據本所所長陳光偉博士應用細胞形態學、末端轉移酵素標記技術、放 射免疫及流式細胞術 (FACS),觀察大腸癌 Colo 205 細胞的形態變化的 研 究,大蒜的 DAS 和 DADS 的成份確實可以減少人類大腸癌細胞株 NAT 的活性,

防止癌症的產生。即 DAS,DADS 可抑制人類的腫癌細胞,而且其抑制效果亦 隨著其硫含量增加而加強 1。大蒜成份 DAS 和 DADS 對大腸癌細胞株,在對細 胞週期方面的影響,可以把大腸癌細胞的分化聚積在 G0-G1 期,而減少在 G2-M 及 S 期,使之分化良 1

本所黃氏研究生利用微晶片偵測探討薑黃素 Curcumin 對於人類大腸腫 瘤細胞 Colo 205)之基因表現的影響。發現薑黃素對於人類大腸腫瘤細胞 株的乙醯轉移酵素,DNA-AF-ADDUCT 及 NAT1 基因(NAT-mRNA)的表現有抑 制作用 2

大蒜具有之直接增強巨噬細胞的抗腫瘤活性的作用 ,使腫瘤內中性粒 細胞、巨噬細胞和淋巴細胞增多 ,從而對癌細胞具有直接殺傷作用。大蒜還 經由加強細胞抗腫瘤的免疫調節機制 ,阻礙癌細胞 DNA、 RNA 合成及抑制核 轉錄? 的活性 ,達到抑制毒殺癌症細胞效果,阻止腫瘤細胞的形成 15,31,68

大蒜中的有效成分如烯丙基硫化物、硒等 ,能消除溶液中的NO2 -,防止 致癌物的形成與活化 ,保護宿主正常細胞不發生癌變 31

大蒜能通過提高細胞核銅及核內外硒和鉬含量 ,降低細胞核內外鋅的濃 度 ,達到阻斷和治療口腔癌前病變 14,21

動物實驗證明大蒜有抑制肝細胞癌生長的活性 ;大蒜提取液能顯著減少肝 癌細胞 (742 0 )的生長 ;並可提高腫瘤組織內的cAMP的含量 ,而cAMP 是抑制腫瘤細胞生長的信號。因此大蒜素有明顯抑制腫瘤細胞生長 17,31,68

大蒜有效成份可阻滯腫瘤細胞從G1 期進入到S期 ,使細胞堆積在G1 期 , 大蒜及其提取可使不同的腫瘤細胞阻滯於 G1 、G2 / M 期不等,進而抑制 細胞增殖。大蒜成份可以使腫瘤細胞在發生的啟動階段”和“促進階段”即被 抑制 ,達到防止正常細胞產生癌病變 12,15,68

為探討大蒜素誘導人胃癌 BGC-823 細胞凋亡及其機制。實驗將大蒜素作用

(16)

於體外培養的人胃癌 BGC-823 細胞實驗,應用細胞形態學、末端轉移酵素標記 技術、放射免疫及流式細胞術 (FACS),觀察胃癌 BGC-823 細胞的形態變化 。並 應用逆轉錄聚合? 鏈反應 (PCR)方 法 及 檢測癌胚抗原 (CEA) 、 環磷酸鋂 (cAMP)、激鋂 C(PKC)的含量及細胞增殖指數(PI)、凋亡率、凋亡峰、凋亡相關 基因 Fas, Bcl-2, Bax 表達水平的改變 13,18,20

研究結果提示 ,大蒜素可通過第二信號系統cAMP、PKC 途徑 ,引起細胞凋 亡始動基因 fas 及凋亡促進基因 bax 表達增加 ,及促使抗凋亡基因 bcl-2 的表 達受到抑制 ,因而提高胃癌細胞的凋亡率 , 進而誘導胃癌細胞凋亡 。及大蒜 素會以降低胃癌細胞 PKC 含量、及提高cAMP 水平 ,達到抑制胃癌細胞的生長 , 甚至使其凋亡,達到抗癌作用 35,37

大蒜素可顯著抑制卵巢癌細胞株(HO 8910)的生長 ,且有明顯的時間及劑量 效應。大劑量的大蒜素對 HO 8910 細胞株呈直接殺傷作用 ,而小劑量則誘導細 胞凋亡。

大蒜素其有效成分 DADS ,可以促進抑癌基因 p53 和 p21 的表達,進而抑制 腫瘤細胞的增生 20,26,35

用油煙凝聚物和大蒜油分別或同時處理肺癌細胞(V79) ,利用免疫細胞化 學方法檢測V79 細胞中 p53、p21 ras 蛋白的表達情況。結果發現大蒜油明 顯抑制突變型 p53 和p21 ras 蛋白的表達。油煙凝聚物有導致細胞癌變作用 , 大蒜油可防護油煙凝聚物的癌變作用。推測可能主要是大蒜油阻斷了多環芳烴 的作用 24

野生型p53 基因能維持細胞的正常生長,抑制癌細胞增生並誘導其凋亡 , 而突變的p53 基因不具有抑制癌細胞生長和凋亡的功能 ,反而會促使癌細胞增 生和癌化的作用 24,26,29

基因治療 ,免疫治療 ,生物治療等現代醫學技術與傳統化療相結合而引發 的多種綜合治療策略組合給腫瘤患者帶來了曙光。

第二節 微陣列實驗的步驟與相關程式

1、何謂基因微陣列、DNA 晶片、基因晶片或生物晶片

(17)

以製程及承載基因之材料而言,可分為陣列方式及晶片方式兩種。陣列方 式是將經聚合脢鏈鎖反應增殖之片段或合成之寡核甘酸,以精密儀器佈放至尼 龍薄膜或玻璃載玻片上,即微陣列 (microarray) 或稱基因微陣列 4,51。 2、基因晶片(Gene chip),又稱 DNA 晶片(DNA chip)或稱 cDNA 微矩陣(cDNA

Microarray)

其 方 法 是 在 載 體 上 , 將 大 量 已 知 基 因 序 列 之 基 因 探 針 (cDNA 、 Oligonucleotide) ,依照特定的排列方式,固定在載體上形成一 DNA 微陣列,

然後將此基因晶片上之基因探針與特殊標記處理後之檢體 RNA(/DNA)進行雜交 配對(Hybridization),在將此因雜交之基因密碼互補結果,來比對之雜交訊號 以判讀基因表現強度。最後藉由電腦及分析軟體,成千上萬個基因資訊可同時 快數由基因晶片獲得。基因晶片分析由於具有操作容易、分析信賴度及精確性 高、高通量(High Throughput)、使用檢體樣品少、應用範圍廣,並可獲得整體 性(平行化)的實驗數據等優越特性 ,已被公認為 21 世紀最強大的基因分析工

具之一 27,50,69

3、DNA Array (即 DNA Chips, 生物晶片)

是將數以千計的基因佈滿在玻璃片或矽化物上。科學家再選取要測試的樣 品使其與玻片上的基因雜交,再以高解析度的螢光影像儀偵測晶片雜合後各個 基因表現程度的差異。由於玻片式的生物晶片的基因分佈密度高且種類多樣 化,已成為科學家進行基礎研究的一項利器 56

4、cDNA microarray: 由 P. Brown 等人所發展 51

是以經由聚合脢聯鎖反應且純化之基因片段以微陣列方式配合化學方法,

將 DNA 固定於載玻片上。以兩種核酸探針分別標示上不同波長的螢光分子與載 玻片上的基因進行雜交反應。經過雷射光的激發及掃瞄後,放射出來的兩種波 長的螢光可同時被收集並數位化,以便評估基因表現程度4,51,54。 微陣列主要分 成兩大類,分別是: 1.寡核? 酸(oligonucleotide)陣列與 2.互補 DNA(cDNA) 微 陣列。

1.寡核? 酸又大致分為兩種 : (a). 一種是利用光罩的技術,直接在支援 物上的不同位置合成不同的探針,例如 Affymetrix公司是合成大約 18 個核? 酸的 寡核? 酸片段為探針。因為短的寡核? 酸不易吸附在支援物上。(b).另一種形

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式的寡核? 酸陣列是合成大約 70 個核? 酸或更長的寡核? 酸片段,直接點在支 援物上。例如 Compugen公司的產品 4,51,66

2.至於 cDNA 陣列,多是以 IMAGE 所提供的 cDNA 殖株(clone)中所插入的 cDNA 片段為探針。這種方法因為製作簡單,所以使用的相當普遍。例如 Clone Tech 公司或國內的 ABC 公司就提供這方面的微陣列 4,11

第一小節 Probe design (探針的設計):

因為在理想上一個 UniGene ? 應該對應到一個基因,若能取出各 UniGene ? 的代表性序列做為探針,則可在陣列上點上不同的基因,一次測量多種不同基因 的表現。一旦決定用哪一個序列作代表性序列,即可找到它對應的 DNA 殖株,然 後經銷商購買所選定的殖株。購得後可做 PCR 反應,夾出 cDNA 部份,再點到支援 物上。目前定序主要是以 gene 資料庫做為參考資料 4,51,58,66

若直接向 IMAGE 購買殖株,而未定序驗證其正確性,則有些探針可能並非當 初所想的那個基因,因此 IMAGE 的錯誤率很高,有一個報導認為約有 25%的錯誤率

51,66

。現在有一些所謂經定序驗證的 cDNA 殖株,可將錯誤率降到百分之一以下。

第二小節 實驗資源:

做基因體研究時使用的材料多為菌株或 DNA,例如你所研究的基因若與序 列資料庫中的某段 EST 相似,則需要購買含這個 EST 序列的菌株。若以其名 字去查 Biosupplynet 等尋找實驗器材的網站是沒用的,此時必須連到特定的網 站才能很快找到想要的資訊。在國際上有一個 IMAGE (Integrated Molecular Analysis of Genomes and their Expression) 研究群,他們將 cDNA 基因庫 整理到多孔培養盤中,有系統地決定基因庫中各殖株的 EST 序列,並將 DNA 密 集地點在轉漬膜上。實驗者可由這些膜與探針的雜交結果,來比較不同的基因 在不同的細胞或不同時間的表現量。找到有變化的訊號後,可根據訊號在膜上 之座標,購買相對應的菌株做序列分析,節省自己做選殖所需的人力與物力。

(19)

在德國的(Resource Centre / Primary Database) 是一個歐洲的實驗資源中 心,它除了是 IMAGE 殖株的經銷機構外,更有系統地將 cosmid, BAC, YAC, PI, plasmid, PAC 等基因庫整理在多孔培養盤中。使用者可用購買轉漬膜做研究,

也可購買不同殖株的混合物 (pools) 來做聚合脢連鎖反應,尋找值得深入研究

的殖株 51-52,62

美國的 (American Type Culture Collection) 是收集各種實驗資源的重 鎮。它除了是 IMAGE 殖株在美國的三大經銷機構之一,它也是其他菌種、細胞、

病毒,甚至 DNA 的保存中心。它也受其他機構委託,管理融合瘤細胞株。在國內 的「菌種保存與研究中心」雖然收集的數目少於 ATCC 許多,但在品質上卻做的 很好,因此最近受國家衛生院委託,建立細胞庫。此外,在決定基因功能時,經 常需要純系的鼠類實驗動物做轉殖鼠,這以美國的傑克森實驗室收集的最齊全。

不但有各種品系的鼠類,更有適合做為「模型動物」的轉殖鼠,可直接買來測試 藥物對某種疾病的效果 51,71,73

第三小節 DNA labelling (cDNA 的標幟):

cDNA 陣列會隨著所使用的載體的不同,它所用的偵檢方法也不同。因此 cDNA 陣列雖然有較容易取得價位低的優點,但它也有許多問題有待解決。如果 是用尼龍膜作載體,可用放射線強度或是顏色的深淺表示細胞中 mRNA 的濃度。

如果是用玻璃片作載體,則比較常用螢光強度表示基因表現量。這三種方法中,

放射性標幟不但較危險,而且一次只能放一種樣品,不易校正不同陣列間的差 異。以呈色法所能測量的濃度範圍最小,可是它價廉而且安全。螢光法價格較 貴,可是這是目前使用最廣的方法 51,66

第四小節 Hybridization (微陣列的雜交):

為了減少不同微陣列間或不同實驗間的差異所造成的影響,有人利用整個 微陣列各點的中值(median)來做標準化(正規)(normalization),以減少差

51,66

(20)

另一種作法是利用競爭性(competitive)雜交,使每片微陣列都有一個共 同的比較標準。為使雜交有定量之效果,在微陣列上的 DNA 濃度遠高於 mRNA 或 cDNA 的濃度,所以這是一種假一級(pseudo first order)反應,雜交的速率 正比於溶液中 mRNA 或 cDNA 的濃度。因為微陣列上的探針大量過量,即使在雜 交時同時加入控制組與實驗組的 mRNA 或 cDNA,雜交的速率仍與 mRNA 或 cDNA 的 濃度成正比。

若能分別用兩種不同顏色的螢光染料標示控制組與實驗組的與 cDNA 探針,

則可在同一片微陣列上同時觀察兩種控制組與實驗組的量。對不同實驗組而 言,若都與控制組比較,則不同片的微陣列將有一個共同的比較標準。這種方 法是將每個實驗組都用「實驗 控制」的比例表示,再比較不同實驗組間的比 例差異,就可比較求出不同基因的表現量差異 4,65,74

在使用放射性偵測基因表現時,因為控制組與不同的實驗組都要使用一片 微陣列雜交。定量後的絕對直若直接比較,其實會有些問題,首先在製造時,

不同的微陣列間可能有差異。因此,所測得的差異究竟是來自於微陣列的品質 差異,還是實驗的影響,必須重覆多次實驗才能有結論。其次,在重覆同樣的 實驗時,可能因為細胞的狀況不同,在基因表現上稍有不同,導致同一實驗組 在不同的實驗中有不同得絕對值,在分析上會很混淆 51,66

第五小節 cDNA 探針的交互雜交問題:

以美國國家老化研究所(National Institute on Aging)提供的小鼠 cDNA 組為例,在一萬五千多個基因中有許多基因在做 Blast 分析時會找到相似序列。

這表示表現出來的基因可能會和微陣列上的多個點產生雜交。在定性的角度來 看,這可協助使用者觀察實驗的再現性,因為在不同的實驗組中,屬於同一基 因的點應有同樣的趨勢。由定量的角度來看,訊號強度加起來即可。訊號強度 是否可相加,其實還要考慮是否有屬於同一基因族的基因會參與競爭。若有兩 種表現的基因會與探針產生交互辨識的狀況,而兩種基因在不同實驗組間表現 的趨勢又不相同,則會產生許多定量上的困擾。在某些情形下,可能會使一個 原來基因表現有顯著變化的基因誤被判定為沒有顯著的變化,由此可見選擇探 針的重要性。

(21)

屬於同一基因族的基因所表現出的 RNA 或其 cDNA 的交互雜交現象,其實與 進行雜交的條件有關。根據經驗,兩種 DNA 間若有百分之一的差異會使 TM值降 攝氏 1.7 度,而溫度差 5 度左右就可讓一種 DNA 有 50%雜交,而另一種 DNA 幾乎 不雜交。因為 DNA 的融化曲線(melting curve)相當對稱,差 10 度左右就可讓 一種 DNA 有 100%雜交,而另一種幾乎不雜交。換言之,兩種基因間序列差 6%左 右,就可以利用溫度差異區別兩種不同的 DNA。不過在實驗上的雜交溫度一般定 在 TM減 25 度左右,也就是 65~68 度。這一方面是為了讓不同 TM的 DNA 都有機會 進行雜交,另一方面是為了讓雜交的速度加快。可是這個溫度也同時讓序列差 異約 20%的基因會產生交互雜交的現象。因此,以目前作微陣列雜交的實驗條 件,必須要考慮同一基因族中的交互雜交問題 77

第六小節 微陣列訊號強度的意義:

在細胞中,mRNA 是經由細胞核中的基因轉錄、修飾(processing)與輸送等 過程送到細胞質的,它在細胞質中會逐漸降解(degrade)而變為核甘酸。如果 進入細胞質與 mRNA 降解的速率相同,則 mRNA 的濃度就會維持在穩定狀態

(steady state)而不改變。

細胞中表現成千上萬種不同的 mRNA,基因表現的時間可能不同,降解的速 率也不會完全一樣,因此,有一些基因可能在逼近穩定狀態,另一些基因在離 開穩定狀態。微陣列只能測到 mRNA 得濃度,這是轉錄與降解綜合的結果,而不 是直接測得轉錄的量。雖然微陣列的使用者希望測量轉錄反應的變化,但實際 上也可能會看到因降解速率改變所造成的基因表現變化。如果想用共同表現

(co-expression)的特性,來研究基因上游序列對基因表現的影響,則必須注 意到產生顯著表現差異的基因,不全是調控轉錄反應的結果 4,66

第七小節 數據分析

DNA 的核? 酸序列經由複雜的過程決定蛋白質形成,每一個基因可引導不同 蛋白質的產生。由於蛋白質調節或完成大部分生理功能,因此生物體的特性最

(22)

終是由 DNA 中核? 酸序列來決定。生命體的多樣性肇因於他們基因組的變化,

變易源自於每股 DNA 中基因序列的不同及基因表現的差異,正常基因序列的改 變可能肇因於環境或其他的因素,例如基因複製時產生的錯誤,這些改變即所 謂的突變,也就是基因癌化的突變 26,38,46

為了瞭解特定基因中的突變如何造成疾病,科學家必須比較健康及有疾病 的人體中的基因,而從大量人體採樣重覆基因定序是費力且相當耗時的。近來 在基因體研究的發展已減少在診斷、監測及治療疾病過程時間及人力的消耗,

DNA 微陣列技術是一項重要性發展且正於專業生物技術中普及,DNA 微陣列晶片 允許同步監視及測試成千上萬個基因,因此縮短了檢測所需的時間且提高了效 率。

第八小節 本實驗目的

很 多 中 草 藥 具 有 抗 腫 瘤 / 抗 癌 作 用 , 以 一 般 實 驗 方 法 費 時 曠 日 。 Microarray 可同時作多耙標地物評估。中藥治癌有很多評估方法,但較少用到 微陣列基因晶片方法來評估,本所研究生游氏蔡氏等曾做此類似研究 2,6本實驗 目的旨在以微陣列基因晶片方法來評估大蒜成份 DADS 對大腸癌腫瘤細胞株 (Colo 205) 的抗癌效果,來作一初步的評估,(一)並探討 DADS 對 Colo 205 的 基因調控表現作用及可能抗癌細胞凋亡機轉 (二)作為日後其他中草藥抗癌作 用的參考。

(23)

第三章 材料與方法

本論文的重點在利用微晶片偵測討大蒜素(DADS)對於人類大腸腫瘤細胞株 ( Colo 205)之基因表現的影響。也就是經由 MICRO-ARRAY 來篩檢有那些調控 基因可能經由大蒜素的作用而調升表現或或受到抑制,並進一步分析其結果,

來確認大蒜素與人類大腸腫瘤細胞株之基因表現間的關聯,並探討可能的抗癌 機轉。

第一節 材料 一、人類大腸癌細胞

人類大腸癌細胞株(Colo 205),台北榮民總醫院提供這些癌細胞株,培養 於含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培養基,並加入( Penicillin 50ug/ml 及 strepmyin 50mg/ml ) ,置於 37℃5%二氧化碳的細胞培養箱。本實驗採以 Colo 205 細胞株 為材料,有其下列方便好處;1.這人類大腸癌細胞株(Colo 205),是 1975 由一 男性高加索羅患大腸腺細胞癌分離出,細胞株穩定。2.價格不貴( ATCC 的價格 167 美金) 。 3.生物安全指數很好(1 級)。4.易於培養及冷凍運送。5.裸鼠皮下 種植 21 日 即可成長 1,2,28

二、中藥:大蒜素 DADS 由本院醫研所鍾景光教授提供 三、基因晶片:

本實驗所用的7680點晶片是由 ABC 公司所提供 ABC Human Universo Chip 8K-1,基本的實驗步驟亦參照其方法 4,11,51

第二節 方法

一、純化及萃取 RNA:

目前我們使用微陣列晶片標準化操作實驗程序,從細胞株萃取純化總量 RNA (含 polyA RNA)。萃取純化 RNA 時,請小心避免 RNase 污染樣品。總量 RNA 可利用傳統的超高速離心,一般 TriZol 萃取與吸附性管柱萃取法分離之。

本次實驗的方法如下:

實際純化步驟(for Rneasy Midi Kit)4,66

1.本實驗取 5 ×106cells of Colo 205,分別分實驗組 (加)或對照組(不加)大蒜素 2.5Μm,並移入 37℃ 5%CO2 培養箱培養 24 小時,再加入適當量 RLT 緩衝

(24)

液到細胞株中,攪拌均勻溶解. 將細胞打下。

2.將樣品置入 QIA shredder 吸附性管柱 ,以 14,000 rpm 離心 2 分。

3.倒除上清液。

4.以 pipet 加入同量 體積的 70% 乙醇到溶解細胞中,重複數次。

5.上含 Rneasy 管加滿到 700μl 以 14,000 rpm.離心 15 秒,倒掉上層液。

6.加 700μl RW1 緩衝液到 Rneasy 吸附性管柱中. 蓋住試管口以 14,000rpm 離心, 倒掉上層液。

7.上述樣品移到 2 ml 收集管中。

8.Pipet 加入 500μl RPE 緩衝液 以 14,000 rpm.離心 15 秒。

9.Pipet 加入另外 500μl RPE 緩衝液 以 14,000 rpm 離 2 分,乾燥。

10. 沖 洗 , 轉 置 Rneasy column 到 一 2 ml 收 集 管 . 以 pipet 加 入 50 ul Rnase-free 的水, 1 分鐘後以 14,000 rpm.離心一分鐘。

11.重複上述步驟並使 Rnase-free water 減量到 30μl. 且離心 1 min,下層即 RNA,再於 260nm 下測 OD 值。最後將 RNA 交由 ABC 生技公司進行 micro-array 之分析。

二、純化 mRNA:

利用 mRNA 特有之 poly(A) tail,以吸附性管柱來純化 mRNA,本次實驗的 方法如下:又叫 OligotexTM Procedure (Qiagen)。

製備 OBB – 加熱到 37°C 以溶解沉澱物.

Oligotex suspension –加熱到 37°C, 混合並置入 RT.

OEB – 加熱到 70°C

以 Centricon 30 將 total RNA樣品含量少於 500 µg 體積減量到 500 µl體積 未達

假如初始體積 未達500ul,則加入 RNAse-free water使其達500ul

(25)

假如初始體積未達 500ul,則 加入 RNAse-free water 使其 達 500ul

2. 加入 500 µl of OBB.

3. 加入 30 µl oligotex 懸浮液.

4. Votex.

5. 70°C 培養 for 3 min.

6. 從溫室箱取下, 至於 RT 10 分

7. 以 14,000 x g, 離心 2 分

8. Resuspend the pellet in 400 µl OW2 by vortexing or pipeting

轉置 the supernatant 到一乾淨試

.

9. 轉置到一小的 spin column. 加入 10 µl of Oligotex 懸

(26)

浮液

10. 以 14,000 x g 離心 1 min. 再重複步驟 4 一次

11. 轉置 the spin column 到一新的

RNase-free 1.5-ml microcentrifuge tube.

12. 加入 400 µl OW2.

13. 以 14,000 x g 離心 1 min. .

14.. 轉置 the spin column 到一新的 RNase-free 1.5-ml microcentrifuge tube.

15. Pipet 50 µl 熱 OBE, 吸入或吸出 3 or 4 次 來沖洗 resin;

. 以 14,000 x g 離心 1 min

16. Pipet 50 µl 熱 OBE, 吸入或吸出 3 or 4 次 來沖洗 resin; . 以 14,000 x g 離心 1 min

17.將洗提液保存於冰中.

三、cDNA 探針合成及螢光標記:

對於真核 mRNA 新合成的 cDNA 以 Cy3-dCTPor Cy5-dCTP 來標誌。 以總量 RNA(含 polyA RNA)為模版,進行反轉錄標記,將螢光核甘酸標記在 cDNA 上。這 些已標記之 cDNA 將可與晶片上專一之基因雜交而螢光呈色。

1. 1ST 股合成 ( 1 探針)

假如有數個樣品以同樣螢光標誌, prepare a master mix.

(27)

Premi×1 Volume MRNA, 1.5-2μg 2μl Spike mRNA(Cy3 or Cy5) 5μl Random 9-mers @ 1μg/μl 2μl DT primer @ 8Μm 2μl

H2O 0μl

全部反應容量 11μl

.準備 premi×1

.輕輕震盪 旋轉沉澱

.70℃培養 10-20 分 (這時可以開始作 Premi×2 ).

.冰 30 秒, 旋轉沉澱,而且試管保持室溫.

Premi×2 Volume

5×Superscript Buffer 4μl

0.1M DTT 2μl

DNTPmix@5mM d(AGT)TP,1mM dCTP 1μl

Rnasin 1μl

Total premix×2 volume 8μl

.加 Premi×2 到反應試管, 以 pipet 吸入吸出混合.

Cy3 OR Cy5 @ 1nmol/μl(1mM) 1μl

.輕輕震盪混合 旋轉沉澱 此步驟不要曝光

Superscript RT (200u) 1μl

.輕輕震盪 旋轉沉澱.

.以保溫箱或溫水浴在 42℃黑暗中培養 1 小時.

.加入 1μl Superscript II and 繼續培養 1 小時.

2.分解 cDNA/mRNA 雜交物中的 mRNA 的半成量

.加 2.0μl 2.5 M NaOH 到每一試管輕輕震盪 旋轉沉澱.

. 37℃黑暗中培養 10-20min.

.加 10μl 2 M MOPS (or HEPES).

3. 純化探針 (Qiagen’s PCR 純化 columns).

(28)

.加 160μl of PB (Qiagen, PCR 純化 kit).

.Vortex.

.轉置到 Qiaquick 吸附管柱.

.以 4,000 rpm 離心 1 分 .

.倒掉上層液.

.加 750μl of PE.

.以 4,000 rpm 離心 1 分 .

.倒掉上層液.

.以 4,000 rpm 離心 1 分.

.轉置到已滅菌的 1.5 ml microfuge tube.

.加 50μl of EB.

.靜待 1 分.

.以 4,000 rpm 離心 1 分 .

.加 50μl of EB

.靜待 1 分

.以 4,000 rpm 離心 1 分.

.洗出液 (1st cDNA 溶液) 保存-80℃或進行下列步驟.

4.掃描 探針

.以 10mM Tris pH 8.0 (EB) 調整歸零 UV spec.

.以 0.06A-0.5A 範圍,掃讀 spectrum (210-700nm).測量每一探針的螢光 pmol 及 g cDNA 合成量.

a.Cy3: abs 550×probe volume (μl)/0.15=pmol Cy3 probe b.Cy5: abs 650×probe volume (μl)/0.25=pmol Cy5 probe c.50-100 pmol 結合探針量已可以接受.

d.μg cDNA:(A260)×(40μg/ml)×(vol in ml)= μg of cDNA 5. 探針乾燥

.啟動真空吸入幫浦以將強吸乾.

.保持 50℃.

.以金屬薄片覆蓋.

.乾燥 1-3 小時, 使探針結晶.

探針在-80℃ 黑暗中至少可保存 3 個月

(29)

四、雜交反應:標記 cDNA/探針雜交反應:

此步驟將已螢光標記之 cDNA 探針與晶片之基因探針混合作雜交反應,若 兩探針有互補性,則 cDNA 探針會附著在晶片基因上而其螢光可被定量。

1. 在 -20℃ 拿出雜培養在 42℃ 至少 5 分, 保存在 RT. 在-20℃雜交液中 SDS 會沉澱, 在 42℃培養下又會溶解.

2. 在 11.5μl 水蒸氣壓力鍋 溶解已組合細胞株乾燥探針

3. 以 PCR 將探針加熱到 95℃ 2-5 分來分解標誌 Cy3 及 Cy5 探針 . 4. 立即置入冰中 1 分鐘.

5. 加 1μl of poly (A)80(1mg/ml)(MWG) 以 pipetting 混合.

6. 在 PCR 儀器將探針加熱培養到 70℃ 20 分 離心收集.

7. 加 12.5μl of 4× 雜交緩衝液 (Pharmacia) and 25μl of deionized formamide (Sigma) 到探針.

8. 以含探針溶液 (50μl) 加到先前處理過晶片邊緣.

9. 慢慢滑過 晶片探針心壘.

10. 在 42℃培養在濕鍋 (80-90%) 14-16 小時.

Wash(清洗)雜交的晶片 Wash 1 : 1×SSC/0.2% SDS Wash 2 : 0.1×SSC/0.2% SDS Wash 3 : 0.1×SSC

在雜交後,第2日前:

1. 以溫水浴方式對 Wash 1 and 2 再加熱 (最好 54℃ 過夜).

2. 在清洗中,置放晶片容器在雜交溫箱中以定溫.

經 14-16 小時雜交 ,次日清晨

1. 以溫的 Wash 1浸泡晶片.假如溼度及探針溶液足夠, 覆蓋器滑行要立刻停止 . 在 54℃ 將晶片及含物置在含 Wash 1 溶液晶片載器中.

2. 培養 Washes 1-3 應放在震盪器並以金屬薄片覆蓋以避光.

3. 在 Wash 1(@54℃)培養 10 分.

4. 在 Wash 2 (@54℃) 培養 10 分。以清潔wash 2 (@54℃) 重複一次培養 10

(30)

分。

5. 在 Wash 3 (@RT) 培養 1 分. 以清潔 Wash 3 (@RT) 重複一次) 培養 1 分.

6. 重複步驟 2 快速浸泡 在 dH2O (@RT).

7. 以異丙醇浸泡晶片 10 次 並以氮氣乾燥以防異丙醇接觸到標籤.

8. 以自動模式掃描晶片.

.

五、晶片掃瞄

經過雜交反應及清洗之晶片將可作影像掃描 六、分析資料

利用不同軟體(GeneSpring and SpotFire)進行經掃瞄後之資料分析4,51,79

七、Scorecard

本分析為利用已標定在晶片上之標準點、螢光標定控制組與 housekeeping 基因之間對本實驗之品質控制 51,66

八、本 Microarray 實驗相關資料 1. Sample Handling

Sample type:RNA

Sample labeled:Cy3 (Green) for Reference (DMSO), Cy5 (Red) for Treatment (DADS)

Sample status & treatment:Normal 2. Use of Biochip

Chip Type:ABC Human UniversoChip 8K-1 Chip usage:1pcs(HU1201)

3. Quality Analysis Chip:Passed Image:Passed

Internal QC test:Qualified for analysis

(31)

4. Original Sample Status:

Sample type: RNA Organism: Human Tissue: Colon

Strain/Cell line: COLO 205

Disease: Tumor (Non-transmitted)

Genetic variation: Carcinoembryonic antigen Isolation method: Qiagen RNA kit

Treatment: DADS

Customer sample #: Control (DMSO) ABC sample #: 000417

Customer sample #: Exp. (DADS) ABC sample #: 000418

Storage: Dry pellets @ RT Total mass: 000417 = 90 g 000418 = 79 g Volume: 000417 = 90 l

000418 = 90 l

Concentration: 000417 = 1 g/?l 000418 = 0.88 g/?l A260/280: N/A

Gel analysis: 000417 and 000418 = O.K.

(See attached picture and note on page 2, Serial# 0201)

ABC Criteria:

Total mass > 0.1 mg/sample A260/A280 > 1.6

Examination: Total mass < 0.1 mg/sample

5. ABC Sample Status:

(32)

Sample #: 000417 000418 Mass 180.18 ug 144.2 1ug Volume: 16.5 ul 16.5 ul Con centration: 10.92 ug/u?l 8.74 ug/ul A260/280 2.364 2.362

A260/230: 1.902 1.884

Storage: DEPC water, frozen DEPC water, frozen Date Examnined: 01/07/2002

6. Total chip used: 1pc Chip number: HU1201 Date processed: 01/09/2002 Remark: Human 8K

RNA usage: ~5g each for quantification and gel analysis.

cDNA labeling: 000417 = 40.40g Cy3 000418 = 60.31g Cy5

Hybridization usage: 000417 = half volume labeled cDNA 000418 = total volume labeled cDNA Hybridization: 15.5 hrs @ 65℃

Scanning: 01/10/2002 Gel analysis: 01/07/02 Lane 1: 000417 = 3g Lane 2: 000418 = 3g

Summary Information of Scan

Scanned by:GenePix 4000B[84946] Analyzed by:GenePix Pro 3.0.5.56

(33)

When scanned:2002/1/10 05:03 Image wavelengths:635nm,532nm PMT (V):830,700

Laser Power (V) :2.9,3.5 Barcode:HU1201

Comment:Cy3:Reference (DMSO) Cy5:treatment (DADS)

GPS file:HU1201_0110_830_700.GPS GAL file:Hu8Kgall.gal

Temperature (V) :29.1 Laser On-time:346,346 Ratio Formulation:W1/W2 (635nm/532nm)

第三節、實驗簡要流程及儀器

一 般 實 驗 流 程 Experiment Process4,66, 實 驗 流 程 圖 Experimental Procedures51,66, 及相關儀器設備 ,分別呈現於圖 3.1 - 3.5.

(34)

第四章 結果

一、 國內癌症死亡原因-大腸癌居第 3 位

以八十九 九十年這兩年的台灣地區主要死亡原因統計圖比較,並無明顯變化 (圖 1、2);仍以惡性腫瘤居第一位,遠高於其它疾病。且因惡性腫瘤原因而死亡,

九十年較八十九年多出近 1,440 人,這些多出的人數,可能是因為診斷的進步;或 飲食多賴泡製添加速食類食物;或現代人比以前的人有比較多的壓力等種種原因造 成的,但實際的因素仍有待以後進一步探討 53,57,63

以九八十及九十年年台灣地區主要癌症死亡百分比的圖 2 顯示,這二年惡性 腫瘤(癌症)的死亡百分比,並無顯著的變化,大腸結腸癌仍以 10.8%的比例高居 國內癌症死亡原因第 3 位,顯見研究如何預防治療大腸癌及其可能致病機轉,仍是 值得重視探討的問題 25。

二、 生物資訊對基因表現的資料分析

生物資訊對基因表現的資料分析流程列於圖 3-1。經過初步或例行資料的 簡化與分析,包括一些特定的項目例如:點的影像選擇、誤差分析、對含不同 濃度的內部控制基因和 cDNA 做強度校正、計算基因表現比值,選擇重要比值的 基因、基因的註解、UniGene 和 GeneBank 的 IDs 和資料標準化(正常化)的步驟。

微陣列初步數據的分析是微陣列影像之定量,cDNA arrays 之定量我們 使用 GenePix 軟體。經過定量之數據要進行標準化(正常化,均一化)。經過標 準化之數據可以進一步使用 GeneSpring 等相關的實驗條件、樣品等來分析。

進一步高級之統計分析可以評估數據之準確度,並且可設計出偵測其相互 作用模式的方法,可以利用一些分群技術來鑑別基因表現之型態種類,例如:

Hierachical Clustering、tree view 或 Self-Organizing Map。基因可以利用 t test 或 ANOVA 之方法分類過濾,並且可以利用一些生物資訊工具和資料庫做

註解 4,51,75

三、影像分析

在微陣列影像分析方面,我們是使用 GenePix Pro 3.0 這個軟體來處理問題;

(35)

GenePix Pro 是由 Axon 公司所開發之快速且具高品質的 DNA 微陣列掃瞄工具,它 也提供微陣列資料的擷取和初步分析 4,11,51

GenePix 4000 系列掃瞄器利用同步雙雷射(dual-laser)掃瞄系統及時產生 比例影像(ratio image),此比例影像是標準的 24 位元紅、綠、藍色合成影像,

它們的內定值分別為 635、532 及 0 nm 之雷射光。如果我們將參考組(reference) 與檢測組(test)的 cDNA 分別標示為 Cy3 (綠光) 和 Cy5(紅光),(1) 若比例 影像呈現紅色,則表示檢測組之 cDNA 的表現量高於參考組;(2) 反之,若為綠 色,則表示檢測組之 cDNA 的表現量低於參考組;(3) 若兩者差異不大時,則以 黃色呈現。然而,為使基因表現以數量化型式呈現,我們可以定義比例影像為 紅光強度除以綠光強度,亦即 Cy5/Cy3 值大於(小於) 1,表示檢測組之 cDNA 的 表現量高(低)於參考組 4,31,51

GenePix Pro 3.0 將玻片上每一 DAN 斑點(inividual spot)稱作 feature,

並在 feature 上劃出一適當的圓形區域,稱之為 feature-indicator,它是 GenePix Pro 3.0 資料分析的基本單位。首先將整個玻片劃分為格子狀之映像點 (pixel) , 利 用 這 些 原 始 影 像 上 映 像 點 之 雷 射 光 表 現 量 可 以 計 算 各 個 feature-indicator 的 平 均 值 、 中 位 數 及 標 準 差 。 另 外 , 以 每 一 feature-indicator 為中心,並以其直徑之 3 倍為直徑畫出一圓,利用落於此圓 內、斑點外之映像點的雷射光表現量計算背景光強度之平均值、中位數及標準 差。爾後 GenePix Pro 3.0 計算每一 feature-indicator 比例影像值時,均先 減去其各自背景光強度之中位數 51,59

GenePix Pro 3.0 提供的比例影像值包括中位數比值(ratio of medians)、

平均數比值(ratio of means)、比例的百分位數(quantities derived from pixed-by-pixel ratios)、比例的中位數(median of ratios)、比例的平均數 (mean of ratios) 及 迴 歸 比 例 (regression ratio)。 Flag : 影像資料經過 GenePix Pro 3.0 內部粗略分析後,它會標示出 “Bad”、“Good”、“Absent”

及“Not Found”,並且分別以數值 “-100”、“ +100”、 “-75” 和 “-50”

表之;“Bad” 代表資料不合規格,“Good” 表示資料符合我們實驗的要求,

“Absent” 為資料陣列表的某一 feature 是遺漏數據(missing data),“Not Found”表示 feature-indicator 在自動排列時有缺失 66,80

Signal-To-Noise 是對於掃描晶片的不同雷射波長做詳盡地數據化分析,可 以用來檢驗晶片上雜交過程的 quality,也可以用二台不同的掃描器做分析比較

(36)

同一片晶片的訊雜比 51。訊雜比,若信號愈弱,解析度愈弱,愈左邊 ,雜訊愈 多,Noise(Bias)多。看雜訊多不多,即在看基因晶片的好壞。

愈高解析的影像,其 Signal-To-Noise Ratio 也愈高;因此若要比較不同影 像的 Signal-To-Noise Ratio, 該確保在同一解析度之下做掃描。gene pix 3.0 軟體所做的品質管制,基因晶片的相關統計說明晶片好壞的與否。實驗的結果, 我們這一片晶片是做的不錯。

圖 14-15, 雜交後晶片中 32 小方塊中基因的落點。Y 軸的 Log ratio 還沒 標準化 Nomonalization,但都接近於 1 ,顯示大部分的基因多不參予反應。

表 5 中,在接近 90 ,mean 及 median 差異不大。如果 Mean 及 Median 在統計 上差異很大,SD 標準誤差高,表示這個實驗做的不好,必須放棄。但本實驗此一基 因晶片在 gene pix 分析上,波長 635 以 Cy5 表示,波長 532 以 Cy3 表示,在表 5 中 , 最 後 的 部 份 , 以 635/532 的 結 果 , 它 的 Mean(1.203-1.209) 及 Median(1.244-1.248) ,在統計上差異不大,都接近於 1,且 SD 標準誤差不高 (0.44-1.06) ,表示這個實驗做的還可以接受。

四、基因點狀分布圖

每個晶片 4 列乘 8 行共 32 個方塊,每一方塊有 16 行*15 列=240 個基因點,所以 此一基因片應有 7680(7597)個基因點可以表現。但實際扣掉「bad」「not found」,

只有 4682 個 51,82,84

測試晶片中大腸癌細胞株 Colo 205 以 DADS 及 DMSO 雜合處理,並經掃描螢光 的結果,以實驗組 對照組(DADS/DMSO)的基因點狀散布圖 ScatterPlot 落點表 示如圖 4 及圖 5。兩者皆以 GenePix Pro 分析資料及進行探討實驗晶片的品質好 壞。圖 4 是一般正常基因點狀散布圖;圖 5 則是經過標準化(normalization)基因 點狀散布;後者 normalization 後,從圖 5 中可以看出,以 mean of ratio (635/532) 當 Y 軸當縱座標,大部分基因點狀落在趨近於『1』的位置,顯見大腸癌細胞株 Colo 205 經 DADS 及 DMSO 處理並進行雜交後,在微陣列晶片上,大部分的基因點並無明 顯受到活化或抑制的表現,而少部分基因點則有經過調控而呈現較高表現;即>2。

而在圖 5 的下面區域,少部分基因點因受到抑制調控而呈現<0.5 的落點,以後我 們的重點將針對這些有意義的上調或下調基因點進行分析 81,85

圖 6-13 為實驗組 對照組(DADS/DMSO)的基因點狀散布圖

Scatter Plot,分別以立體三度空間及二度平面來呈現表示。圖 6 為實驗組 對照 組的基因點狀立體散布圖.(3D Scatter Plot for all genes.)。 圖 7 為實驗組 對 照 組 的 高 表 現 基 因 點 狀 立 體 散 布 圖 .(3D Scatter Plot for 2 fold

(37)

Expression change genes.)。 圖 8 為實驗組 對照組經標準化取對數值的基因柱 狀頻率圖.(Histogram for all genes normalized log ratio.)。 圖 9 為實驗組 對 照 組 且 經 標 準 化 取 對 數 值 的 上 調 基 因 柱 狀 頻 率 .(Histogram for up regulation in 2 fold Expression change genes.)。 圖 10 為實驗組 對照組且 經標準化取對數值的下調基因柱狀頻率圖.(Histogram for down regulation in 2 fold Expression change genes.)。 圖 11 為實驗組 對照組的基因點狀平面空間 散布圖.(Scatter Plot for all genes.)。 圖 12 實驗組 對照組的高表現基因點 狀平面空間散布圖.(Scatter Plot for 2 fold Expression change genes.)。 圖 13 為實驗組 對照組 標示良好的高表現基因點狀平面散布圖. (Scatter Plot for flag A in 2 fold Expression change genes)。

五、雷射螢光掃描結果

圖 14 圖 15 是此 32 個方塊用 C3(紅色),C5(綠色)螢光激光掃描呈現的情況, 但 Y 軸的 Log ratio 都接近於 1。表示大部份的基因表現並不顯著,即大部份的 基因表現不是很重要(non-signaficiant), 但少部份基因則有顯著的差異,大 於 2.0(上調基因;基因表現被活化)或小於 0.5(下調基因:基因表現被抑制)。

圖 16 為大蒜素 DADS 與對照組 DMSO 晶片雜合後以 Wavelenth 635nm Cy5 雷 色光掃描後紅光呈色圖(紅光)。以用雷射光波長 W635nm 掃描雜合晶片,經過此 波長掃描晶片的每一基因點,會受到此波長的激發而呈現比較紅色亮麗的螢光 點,表示此點的基因 cDNA,是在經過大蒜素 DADS 及對照組 DMSO 雜交處理後,

實驗組 DADS 與 Cy5 螢光染劑結合後基因點被活化上調表現的結果,點愈亮(紅 色)表示基因的表現愈強(up),表示這基因有受到愈活化(上調)的表現。

圖 17 為大蒜素 DADS 與對照組 DMSO 晶片雜合後以波長 W532nm Cy3 雷色光 掃描後綠光呈色圖(綠光)。即同樣的以 W 532nm 波長雷射光會激發與 Cy3 螢光 染劑結合 cDNA 的基因點而呈綠色反應,點愈亮(愈綠),表示對照組中與 DMSO 結合的 cDNA 表現愈強,如將此圖 16 圖 17 二種先後 10 分鐘經過不同波長 W635 及 W532 雷射光激發的螢光基因點,套在一起,則呈現圖 18 的表現。即在圖 18 的晶片螢光呈色反應中,為此晶片每一個基因點,先後經波長 W635 及 W532 二 種雷射激光掃描後套在一起的呈色反應。此種呈色反應大略分成三種:(1)愈 紅;表示經過 DADS 與 DMSO 雜合處理後的基因點上調表現愈強(up) (>2.0),(2)

紅加綠→橙色的呈色反應;表示經過雜合處理後的基因點表現持平(=1) 。(3)

愈綠;表示經過 DADS 與 DMSO 雜合處理後的基因調控表現愈受到抑制(down)(<

(38)

0.5) 4,51,65

六、高表達基因的名稱及數量分析

大蒜素 DADS 處理後的 Colo 205 大腸細胞株基因表達,未經標準化統計時;

共有 366 個基因上調(up-regulation);即 2 倍以上,其 Ratio of mean>2(圖 4)。標準化時(normalization);共有 540 個基因上調(up-regulation);即 2 倍以上(Ratio of mean>2)(圖 5)。本表的數值是取 log2 實驗組 對照組,

故數值若為 1,則為 21=2 倍,數值為 2 則為 22=4 倍。

在下調(down-regulation)的基因方面,未經標準化時;共有 1169 個基 因下調(down -regulation);即 0.5 倍以下(Ratio of mean<0.5)圖 4)。

標準化時;共有 518 個基因下調(regulation);即 0.5 倍以下(Ratio of mean

<0.5)(圖 5)。

表的數值是取實驗組 DADS 對照組 DMSO 的 log2 值。其高表現基因的數值表示 有下列二種統計結果: (一)未經標準化、 (二)標準化。

(一)未經標準化

未經標準化組上調(up)的基因中,表現量最大的基因是 transgelin ;其他 被 活 化 的 基 因 包 括 Homo sapiens U5 snRNP-specific protein, 116Kd (U5-116KD)mRNA;Myosin VI;Frizzled (Drosophila) homolog6;H2A histone family, member I ;Murine leukemia viral (bmi-1)oncogene homolog;ESTs;

Peroxisomal membrane protein 3 (35kD, Zellweger syndrome)28802;Homo sapiens mRNA for centaurin-alpha 2 protein; TATA element modulatory factor 1;Human neuronal membrane glycoprotein M6b mRNA, partial cds;

Eukaryotic translation initiation factor 4A (eIF-4A) isoform 2; 以及 一些其他基因等。

在未經標準化下調(down)的基因中,最受抑制的是;Aquaporin 6, kidney specific;其他包括 Ribosomal protein S17;ALEX1protein;Keratin 4;Human P13-kinase associated p85 Mrna SEQUENCE ; Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1;Homo sapiens candidate tumor suppressor similar to rat Mazpl and ras effector norel (RDA32),mRNA…等基因。

未標準化而言, 如以實驗組 對照組的 Ratio of mean來分析基因受到 DADS

參考文獻

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