一、 人尿製備物的製備：
詳第二章材料與方法。
二、動物
使用雌性 Sprague-Dawely 大鼠，購自國科會動物中心。飼養室控制 溫度 23±1°C，相對濕度 55±5%，明暗各 12 小時的環境。餵食福壽牌 飼料，自動飲水系統供水。
大鼠六個月齡時，在 pentobarbital (30 mg/kg, i.p.)麻醉下，由背部切 除兩側卵巢，對照組大鼠進行偽手術。飼養三個月後，手術組分為三
組，連續八週，每日經口投予 PHU 1 g / kg、2 g / kg 或飲水 1 ml / 100 g body weight。投藥終了在乙醚麻醉下將大鼠犧牲，取下主要臟器以冰 冷生理食鹽水洗淨，以濾紙吸乾水分後，-800C 下儲存備用。腦部依據 Glowinski and Iversen (1966)的方法，在冰上取出大腦皮質、海馬、紋 狀體等，即刻冰凍備用。
在最後動物犧牲時，檢視去卵巢手術是否成功，手術失敗的動物 檢體不使用。
三、LPO 的測定 1. 加鐵反應
FeCl2-ascorbic acid 誘發腦均漿 LPO 的測定依據 Garrido et al. (1993) 的方法。以 tris-HCl buffer (pH 7.4)製備 2-10 % (w/v) 腦均漿。取腦均漿 0.3 ml 加入 0.0625 mM 的 ascorbic acid 0.05 ml 、 2.5 mM FeCl2 0.05ml 及 0.05 ml H2O，於 37℃水浴中放置 30 分鐘反應。反應終了依據 Ohkawa et al. (1979)的方法使用 2- thiobarbituric acid 測定 LPO 的量。
FeCl2-ascorbic acid 誘發組織均漿 LPO 的測定依據 Kimuya et al.
(1981)的方法。以 tris-HCl buffer (pH 7.4)製備 10 % (w/v)均漿。取均漿 0.5 ml、tris-HCl buffer 0.15ml，加入 0.1 mM 的 ascorbic acid 0.05 ml 、 4.0 mM FeCl2 0.05ml 及 0.05 ml H2O，於 37℃水浴中放置 1 小時反應。
反應終了依據 Ohkawa et al. (1979)的方法使用 2- thiobarbituric acid 測定 LPO 的量。
2.不加鐵反應
不加鐵誘發的 LPO 測定方法和加鐵的方法類似，唯反應系統以相 同二次水體積取代 FeCl2-ascorbic acid。
四、SOD 活性測定
測定方法詳第二章材料與方法。
五、過氧化氫 (Catalase)活性之測定
實驗參照 Aebi (1984)所描述之方法進行。取組織 0.5g 加入 5 ml buffer (0.32mol/L sucrose、1 ml mol/L EDTA、10 nmol/L Tris-HCl，pH 7.4 )，以均質機均質化，高速離心 30 分鐘 (13600 xg，40C)，取上清液 0.9 ml 加入 0.1 ml triton X-100 (10%)，混合均勻。取混合液以磷酸鹽緩 衝液 (50 mM，pH 7.0) 稀釋 400 倍，將 4 ml 稀釋液加入 2 ml H2O2 (30 mM )，混合均勻後，在溫控 25℃、波長 240 nm 條件下測吸光值，每 隔 5 秒測量一次，時間總共 1 分鐘。計算求得反應速率常數 K ( 1 / min )。
K = (2.3 / Δt ) logA1/A2
Δt :時間間隔 (分鐘)。
A1 : T1時間，檢品之吸光值。
A2 : T2時間，檢品之吸光值。
組織 catalase 比活性以 K / mg protein 表示。
六、穀胱甘 過氧化 [Glutathione peroxidase (GSH-Px)]活性之測定 實驗參照 Hafeman et al. (1974) 所描述之方法進行，取組織 0.5 g 加 5 ml buffer ( 0.32mol/L sucrose、1 ml mol/L EDTA、10 nmol/L Tris-HCl，
pH 7.4 )，以均質機均質化，高速離心 30 分鐘 (13600 xg，40C)，取上 清液稀釋 50 倍。取稀釋液 0.4ml 加上 0.4 ml GSH (1 mM )，置於 37℃
水浴加熱 3 分鐘。然後再加入 H2O2 0.2 ml，置於 37℃水浴加熱 5 分鐘。
然後迅速置於冰中冷卻，加入 4 ml 偏磷酸鈉溶液 (偏磷酸鈉 0.635%，
NaCl 30%，EDTA 0.2% )，混合後離心 10 分鐘，3000 rpm。取上清液 2 ml，加入 2 ml Na2HPO4溶液( 0.4M )與 1 ml 5，5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)(0.04%，sodium citrate 1%)溶液，混合均勻後於 412 nm 測量吸光 值，以多重校正曲線計算濃度。另外測量非酵素所造成 GSH 的氧化，
其步驟與測量酵素反應步驟相同，兩者差別只是將組織稀釋液以蒸餾 水取代。GSH-Px 以 Hafeman 單位( U )表示，Hafeman 單位定義為單位 時間內檢品消耗之 GSH 濃度對數值 ( log[GSH]E )，減去非酵素反應消
耗之 GSH 濃度對數值( log[GSH]NE )，所得值之千分之一為 GSH-Px 活 性單位(U) :
U = (log[GSH]E - log[GSH]NE) / 1000×Δt 組織內 GSH-Px 活性以 U / mg protein 表示。
七、試藥
KCl、pyridine、NaCl、Trichloroacetic acid (TCA)、Na2HPO4•12H2O、
NaH2PO4•2H2O、sucrose、sodium citrate、FeCl2等購自 Wako Pure Chemical Industries,Ltd.。reduce glutathione、2-thiobarbituric acid、sodium dodecyl sulfate (SDS)、NaN3、Tris-base、 triron X-100、pyrogallol、
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)、Vit.C 等購自 sigma chemical CO.P.O.。 acetic acid 購自 Shimakyu’s pure chemicals。n-butanol 購自聯 工化學廠。. 5,5’-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) 購自 Fluka chemie:AG CH-9470 Buchs。methanol 購自 BDH Laboratory supplies Poole,BH 15 1TD,England。metaphosphoric acid (NaPO3)n 購自 Hayashi pure chemical Industries Ltd.Japan。H2O2購自 Ferak laborat gmbh berlin (west)。
八、統計方法
以單尾變異數分析(one-way analysis of variance )方法分析，並進行 Dunnet 測試，以 P 值小於 0.05 認為有顯著差異。