前言
去卵巢大鼠由於缺乏雌激素，與婦人的更年期類似，會產生骨質 疏鬆的症狀，因此在抗骨質疏鬆的研究是常用的動物實驗模式 (Kalu et al., 1991)。在前章實驗我們以抗氧化的觀點，探討人尿製劑對去卵巢大 鼠的影響。本章實驗利用前章實驗所保留的大鼠的骨標本，進行骨質 疏鬆的相關研究。
材料與方法
一、動物
本章實驗是利用第三章實驗動物犧牲後所保留的骨檢品來進行。收 集犧牲前 20 小時尿液供尿鈣測定，動物犧牲時取相關臟器重量稱重，
採得的血液進行膽固醇及雌激素的測定。膽固醇、血鈣及尿鈣使用生 化自動分析儀測定。雌激素(estradiol) 以酵素免疫分析法測定，使用 Cobas Core Estradiol EIA II 試劑。
二、骨密度之測定：
骨體積和密度之測量依據 Archimedes 原理 (Kalu et al. 1991)，先將 第四腰椎及股骨之軟組織清除乾淨。骨放於盛去離子水之燒杯，燒杯 放置在真空乾燥器中，抽真空 90 分鐘。取出骨將水分吸乾，即刻稱重，
得骨之重量。緊接著，將骨懸浮在裝有去離子水的燒杯中，稱其重量，
得骨體積。由骨重量及骨體積求出骨密度(g/cm3)。
三、骨灰分及骨含鈣量之測定
骨在 100℃經 12 小時烘乾得骨乾重。再於 1000℃高溫燒嬂 12 小 時，等冷卻後稱其重量，得骨灰分重，算出骨灰分百分比。 將燒嬂後 的骨研磨均勻，取骨灰 10 mg，加入 1ml HCl (6N)、9.5 ml HNO3(0.1N)，
混合均勻，取 0.5ml 混合液，稀釋 20 倍，加入 20% LaCl3溶液 0.1m l，
充分混合。使用原子吸光儀(Z-8200 Polarized Zeeman Atomic Absorption Spectrophotometer)測定鈣含量。以多重校正曲線計算濃度，骨中鈣濃 度以 mg / cm3表示之。
四、試藥
LaCl3購自 sigma chemical CO.P.O。HNO3購自 Ferak laborat gmbh berlin(west)。HCl 購自 Wako Pure Chemical Industries.Ltd。Ca 購自 Kanto
chemical CO.Inc。
五、統計方法
除大鼠體重變化及部分結果使用 paired t-test 外，其餘結果以單尾變 異數分析(one-way analysis of variance )方法分析，並進行 Dunnet 測試，
以 P 值小於 0.05 認為有顯著差異。
結 果
一、 體重變化
與偽手術組比較，去卵巢大鼠手術後 12 週的體重較手術前 (第 0 週) 明顯上升。經口投予 PHU 八週後，控制組在 20 週的體重較 12 週 時體重有意義增加。投予 PHU 的無顯著變化 (Fig 4-1)。
二、 膽固醇濃度
與偽手術組比較，去卵巢大鼠手術後 12 週的血清膽固醇濃度較手 術前有意義上升。去卵巢大鼠經口投予 PHU (2 g/kg )八週後，血清膽 固醇濃度較控制組低 (Fig. 4-2)。
三、 血清 estradiol 濃度
PHU 200 mg/ml 所含的 estradiol 量為 443.07 pg/ml。去卵巢大鼠血
清 estradiol 濃度較偽手術組低，PHU 對去卵巢大鼠血清 estradiol 濃度 沒有影響 (Table 4-1)。
四、血鈣濃度及尿鈣量
PHU 200 mg/ml 所含的鈣濃度為 5.13 µg/ml。去卵巢大鼠血鈣濃度 與偽手術組比較沒有差異，PHU(2 g/kg)對去卵巢大鼠血鈣濃度有提升 作用(Table 4-1)。去卵巢大鼠 20 小時的尿鈣量較偽手術組低，PHU (2 g/kg)增加去卵巢大鼠尿鈣量 (Table 4-1)。
五、子宮、陰道及腦下垂體的重量變化
去卵巢大鼠，子宮及陰道重量，與偽手術組比較明顯萎縮。 PHU 處理的去卵巢大鼠其子宮及陰道重量較控制組明顯增加。去卵巢大鼠 腦下垂體重量較偽手術組輕，PHU 處理的去卵巢大鼠其腦下垂體重量 沒有增加的作用(Fig 4-3)。
六、骨密度、骨灰分及骨含鈣量
去卵巢大鼠第四腰椎和右股骨的密度、灰分百分比及平均含鈣量較 偽手術組明顯下降(Fig. 4-4、 4-5、4-6)，PHU (2 g/kg) 處理的去卵巢大 鼠可以獲得改善。
討 論
去卵巢大鼠與偽去卵巢大鼠組比較，體重上升，子宮、陰道、腦 下垂體重量明顯降低，血清中膽固醇增加，這些症狀皆與缺雌激素有 關 (Li et al., 1998; Luo, et al., 1998; Kalu, et al., 1991; Van Nesselrooij, 1989)。去卵巢大鼠投予 PHU，除腦下垂體外，體重、子宮和陰道重量、
及血清中膽固醇皆有改善的效果。顯示 PHU 具有雌激素樣的效果，但 又不完全相似，因對腦下垂體重量沒有改善作用。這些結果顯示，PHU 的作用不是來自其所含微量的雌激素，況且投予 PHU 的大鼠血中雌激 素濃度並沒有上升。
雌激素接受體亞型有α型及β型，這些在器官的分佈及功能仍有待
進一步闡明 (Wamer et al., 1999)。或許 PHU 中含有與這些接受體作用 的物質，但因對接受體的選擇性不同，因而無法增加腦下垂体重量。
去卵巢大鼠血鈣雖有下降的報導(Kalu et al.,1984 ; Turner et al., 1987 ; Burnett and Reddi,1983)，但在我們的實驗和 Kalu et al.,(1991)相 同，與偽手術組沒有差異。Wronski et al.,(1988) ; Liu and Kalu (1990)指 出，雌激素處理的去卵巢大鼠，可能促進腸對鈣的吸收而使血鈣增加，
因此尿鈣也增加。在本實驗同樣的發現 PHU 使血鈣增加、尿鈣排泄增 加，此顯示 PHU 有類似雌激素的作用，也能促使腸對鈣的吸收。我們
在其他的實驗，PHU 3 g/kg 處理的大鼠，血鈣並無增加的情形，因此 推論 PHU 使血鈣、尿鈣增加，與其本身的含鈣量無關。
去卵巢大鼠第四腰椎及右股骨密度、骨灰分百分比及骨含鈣量明 顯低於偽手術組大鼠，PHU 對此有明顯改善作用。由上述可推論 PHU 的作用，可能是其本身含有雌激素接受體相類似的物質。
Fig 4-1. Effect of PHU on the changes of body weight in ovariectomized rats. All data are means ± S.E. **p<0.01 compared with the body weight of 12 weeks of sham operated group . #p<0.05 compared with the body weight of 12 weeks of control group by paired t-test. CON : control group.
Body weight(g)
0 100 200 300 400 500
∗∗ ∗∗
∗∗
#
Sham CON PHU (g/kg)
0 week 12 weeks 20 weeks
1 2
Fig 4-2. Effect of PHU on the concentration of cholesterol in ovariectomized rats. All data are means ± S.E. *p<0.05 compared with the sham operated group. #p<0.05 compared with the control group. CON : control group .
Cholesterol(mg/dl)