2-1-1 儀器
秤量天平（PB602-S; AG285） Mettler Toledo
恆溫水槽（Water bath, BC-2D 18L） WISDOM
乾式加熱器（Dry bath, U-Tech Heating Block ) U-Tech 離心機（Centrifuge, Eppendrofe AG 22331） CAMR 高速冷凍離心機（Centrifuge, MIKRO 22R） Hettich 震盪器（Votex, Genie-2） Scientific Industries
逆滲透水（RO H2O） MLLIPORE
二次過濾水（Milli-Q H2O） MLLIPORE
水平震盪器（Shaker） TKS
冰箱（Fridge, NR-M660MG） National
ELISA 讀取機（ELISA reader, EL-800） BIO-TEK
微波爐（Microwave, EM-17P） SANY
光學顯微鏡（Optical microscopy） LEICA
二氧化碳培養箱（CO
2Incubator） SANYO
轉漬系統（Transfer system） Bio-Rad
分光光度計（Spectrophotometer, DU530） BECKMAN
紫外線照像系統（UV system） VILBER LOURMAT
抽氣櫃（Hood） HIPOINT
pH Meter METTLER TOLEDO
液態氮筒 International Cryogenics
無菌操作台（Laminar flow） Baker
細胞計數器 Marienfeld
迷你垂直電泳槽（Electrophoresis Tank, Mupid-Π） Bio-Rad
PCR 機器（GeneAmp PCR, PC-320） ASTEC
紫外線照射箱（UV box, UV box 8100） Pan Tech
2-1-2試劑 Cell culture
Dulbecco,sModifiedeagleMedium (DMEM) BIOSOURCE
RPMI medium 1640 BIOSOURCE
L-glutamine Gibco BRL
Sodium biocarbonate Gibco BRL
Glucose Gibco BRL
HEPES J.T.Baker
Sodium pyruvate Gibco BRL
Fetal bovin serum (FBS) Gibco BRL
Trypsin-EDTA Gibco BRL
Antibiotic Gibco BRL
Trypan Blue Stain Gibco BRL
NaCl MERCK
KCl MERCK
KH2PO4 MERCK
Na2HPO
4*2H
2O MERCK
Cell viability assay
LDH-cytotoxicity assay kit II BioVision XTT【sodium 3’-(phenylaminocarbony)-3,4-tetrazolium)-bis (4-methoxy-6-nitro) benzene sulfonic acid hydrate】 Sigma PMS【N-methyl dibenzopyrazine methyl sulfate】 Sigma
Trypsin-EDTA Gibco BRL
Centrifugal filter devices
100 kDa, 30 kDa, 3kDa MLLIPORE
0.22 m syringe Filter SARTORIUS
Western blot
Protein assay Bio-Rad
細胞專用刮勺 Orange Scientific
BSA Sigma
Lysis buffer Cell Signaling Technology
Phosphotase inhibitor Sigma
PMSF Sigma
Dye reagent concentrate Bio-Rad
TRIS-base Bio-Rad
TRIS-HCl J.T.Baker
Glycin J.T.Baker
Tween 20 MERCK
Acrylamide Bio-Rad
TEMED Bio-Rad
Ammonium Persulfate Bio-Rad
PONCEAU S CONCENTRATE Sigma
Glycerol (87% w/w) Phamacia Biotech
LC-3 Sigma
β-actin Sigma
Nitrocellulose transfer and immobilization membrane PerkinElmer
Medical X-Ray film Fujifil
顯影劑 Kodka
定影劑 Kodka
Two-dimensional electrophoresis
PlusOneTM2-D clean-Up Kit GE Healthcare
Urea GE Healthcare
Thiourea GE Healthcare
CHAPS J.T.Baker
DTT J.T.Baker
IAA Fluka
IPG Buffer GE Healthcare
DryStrip Cover Fluid Amersham Pharmacia Biotech IPGphor Holoder Amersham Pharmacia Biotech IPGphor Isoelectric Focusing System Amersham Pharmacia Biotech 18 cm strip ( PH3-10 ) GE Healthcare 直立式電泳槽 Amersham Pharmacia Biotech
Sliver stain kit GE Healthcare
ImageScanner Amersham Pharmacia Biotech
Immunohistochemistry
Xylene J.T.Baker
EtOH Sigma
Sodium citrate J.T.Baker
Mouse/Rabbit PolyDetector HRP/DAB Detection System Bio SB
Hematoxylin Bio SB
Peroxiredoxin-1 Abcam
Infection
lentinvirus (PRDX1) 中央研究院購買
TRCN0000029511 (GCTTTCAGTGATAGGGCAGAA)
TRCN0000029512 (GATGAGACTTTGAGACTAGTT)
Puromycin Mediatech, Inc
Polybrene Mediatech, Inc
2-2實驗方法
2-2-1 細胞株的種類與來源
OECM-1：人類口腔鱗狀細胞上皮癌（oral squamous cell carcinoma）細胞株，
由陽明大學口腔生物研究所的張國威教授與成功大學醫學院口 腔生物研究所謝達斌教授所提供。
Jurkat T：人類白血病 T 細胞
CMT-415: 正常口腔纖維母細胞，自奇美醫學中心所提供之口腔癌腫瘤組織 周邊正常細胞所培養出來。
2-2-2 細胞培養方法
◎ 細胞株的培養
OECM-1、CMT 415 細胞皆培養於含有 10% 胎牛血清 【FBS ( Gibco BRL )】的培養基【DMEM ( BIOSOURCE )】與 1% 抗生素混合劑 ( Gibco BRL )。
Jurkat T 細胞培養於含有 10% 胎牛血清 【FBS ( Gibco BRL )】的培 養基 【RPMI1640 ( BIOSOURCE ) 】 與 1% 抗生素混合劑 ( Gibco BRL ) 。培養箱的條件均為 37℃ 與含 5% CO2。
◎ 細胞處理藥物
以每 7×107 個細胞的方式種入 10 cm 培養皿中，隔天改換無血清培養
基後再放置 24 小時，隔天再以藥物處理細胞，最後一天便可收細胞蛋白 質。
◎ 測量細胞毒性（懸浮性細胞）
在測量細胞毒性時，我們將懸浮性細胞（如 Jurkat T）先以無血清培養 基培養在 10 cm 培養皿上，隔天將細胞以每孔 1x105 個細胞的方式種入96 孔培養盤中再以藥物處理細胞，最後一天利用 LDH-cytotoxicity assay kit (BioVision) 來偵測細胞的毒性。
◎ 細胞株藥物的篩選
將 OECM-1 與 Jurkat T 依照各自 ANE 及 ANE 30-100K IC0.1 的劑 量（表一），加入含有10%胎牛血清的培養基裡，長期培養約五個月的時間 即能進行本研究實驗。
2-2-3 細胞存活率分析（Cell viability assay）
使 用 XTT 【 sodium 3’-(phenylaminocarbony)-3,4-tetrazolium)-bis (4-methoxy-6-nitro) benzene sulfonic acid hydrate】(Sigma) 試劑來偵測細胞 增生的情況。將加過藥物的 96 孔培養盤內舊的培養基吸掉，加入 100 μl 培養液、50 μlXTT（1 mg/ml ) 與 1 μl PMS（0.383 mg/ml）【N-methyl dibenzopyrazine methyl sulfate】( Sigma ) 標定混合液，於37℃、5% CO
2 下
反應1～2小時，最後使用 ELISA 讀取機（National）在450 nm波長下測吸
光值。存活的細胞其粒線體內的琥珀酸去氫酶（succinate dehydrogenase）
會將 tetrazolium salt 代謝還原成橘紅色 formazan，而橘紅色的 formazan 其生成量則與存活的細胞數目成正比。
2-2-4 檳榔子萃取液（areca nut extract，ANE）製備過程
在市面上買來的檳榔子經過清洗之後，利用研缽以人工研磨的方式，
未加任何緩衝液直接研磨出檳榔子的汁液，通過裝有棉花 3 ml 的針筒，棉 花含量約為針筒體積的 1/3，再分裝於 1.5 ml eppendorf，經離心 12,000 rpm、10 分鐘之後取上清液，再將上清液通過 0.22 M filter (SARTORIUS, USA) 即為 ANE。之後再去冷凍乾燥，記錄重量。
2-2-5 檳榔子萃取液濃縮製備過程
將 30 ml 檳 榔 子 萃 取 液 先 用 孔 徑 為 100 kDa 的 濃 縮 離 心 管 (MILLIPORE)，在 4℃ 下以 4000 rpm 濃縮離心至上清液剩下 1 ml，時間 約需 2 小時。取其下層液約 29 ml 再用孔徑為 30 kDa 的濃縮離心管 (MILLIPORE) 在 4℃ 下以 4000 rpm 離心，濃縮至剩下 0.5 ml，再加入 (1X) PBS 10 ml 離心至剩下 0.5 ml，此動作重複 2 次。收集分子量介於 30
～100 kDa 的部分稱為 30-100K。再依同樣步驟得到其他兩個部份 : ≧ 100K、30-100K 與 ≦ 30K 一倂加以冷凍乾燥測其內含物的重量，並溶於 1
ml Milli-Q H2O。
2-2-6 西方墨點法（Western blot）
◎ 胞液的收集（collection of cell lysate）
將細胞培養盤中的培養基吸乾，以冰的 PBS (1X) 清洗 2 次後，加 入 0.5 ml 冰的 PBS (1X)，以細胞專用的刮勺刮下細胞，將細胞收集到 1.5 ml eppendorf 中，此動作重複 2 次，最後總體積為 1 ml 。然後以 3500 rpm 離心 5 分鐘，吸除上清液，加入內含稀釋 10 倍的 (10X) lysis buffer (Cell Signaling Technology, Inc.) 與內含稀釋 100 倍的（100 Mm）PMSF (Sigma) 與（100 Mm）phosphatase inhibitor (Sigma)，最後加入 Milli-Q H 2 O 至總 體積為 100 µl。混合均勻至冰上作用 10 分鐘，再以 12,000 rpm 於 4℃ 下 離心 10 分鐘，取上清液（即為胞液）測蛋白質濃度。
◎ 蛋白質濃度測定及轉漬（protein assay and transfer）
以 1, 3, 5, 7, 10 mg/ml BSA 的濃度作標準曲線，並取上述製備的胞液 2 µl 各別加入 Protein assay (Bio-Rad) 25 µl，再補 H 2 O 至 100 µl，最後 測得 OD595 之吸光值，並由 BSA 測得的標準線推算胞液內蛋白質濃度，
求出蛋白質濃度。取定量蛋白質（20 µg）加入 sample buffer (4X)，加入 Milli-Q H2O 至總體積為 20 µl，再以 95-100℃ 煮 10 分鐘。然後以 12%
SDS-polyacrylamide 來進行電泳分析，將蛋白質依分子量大小作分離；然後
利用全濕式轉漬系統 (Bio-Rad) 以 350 mA、1 小時將分離後的蛋白質轉移 到硝化纖維膜 (PROTRAN) 上。再將轉漬完成的硝化纖維膜放入含有 5%
脫脂奶粉或是 5% BSA 溶於 TBS (1X) 進行 blocking，在水平震盪器上於 室溫下作用 60 分鐘或在 4℃ 下置放隔夜。再以 TBS (1X) 緩衝液清洗 3 次，每次 10 分鐘，且水平震盪器 (TKS) 以 60-80 rpm 進行清洗。接著加 入一級抗體（primary antibody）並稀釋 1000 倍，室溫下作用 60 分鐘或在 4℃下於旋轉盤上作用 24 小時（50 轉/分鐘），隔天再以 TBS (1X) 緩衝液 清洗 3-4 次，每次 10 分鐘，去除未附著的一級抗體。接著加入二級抗體
（secondary antibody）並稀釋 5000 倍，在室溫下作用 1 小時，以 TBS (1X) 緩衝液清洗 3-4 次，每次 10 分鐘，去除未附著的二級抗體。最後利用冷 光顯影劑偵測試劑組 (MILLIPORE) 讓二抗 F C 端發冷光，以 1：1 的比 例加入硝化纖維膜上，作用 1-3 分鐘，小心風乾纖維膜，取至暗房壓片、
顯影，且在顯影完後必須以清水沖洗過後再將底片放進定影劑。
2-2-7 二維膠體電泳（two-dimensional gel electrophoresis）
◎ 蛋白質沉澱
取蛋白質 800μg，利用 PlusOneTM 2-D clean-Up Kit (GE Healthcare) 加 蛋白質體積 3 倍量的 precipitant，冰浴 15 分鐘；再加 3 倍體積原始蛋白質 量的 co-precipitant 混和，10000 rpm, 10 分鐘，去除上清液，再將 eppendorf
放回原先離心位置 1 分鐘，移除多餘的上清液；加 3-4 倍 pellet 量的 co-precipitant，10000 rpm，5 分鐘，移除上清液，加入足以覆蓋 pellet 量的 Milli-Q H2O，將 pellet 彈散，加 1 ml wash buffer 與 5μl wash additive，將 pellet vortex 至完全分散，放置 -20℃，30 分鐘，10000 rpm，5 分鐘，移 除上清液，取 400μlRehydration buffer (7M urea, 2M thiourea, 4% w/v CHAPS, 0.002% bromophenol blue, 0.5% IPG buffer, PH 3-10) 與 pellet 混和，10000 rpm，5 分鐘，取上清液做等電點焦聚。
◎ 水合（rehydration）
將電泳膠條（IPG strip, GE Healthcare）以膠面朝下的方式覆蓋在平均 分布蛋白質的 strip holder (Amersham Pharmacia Biotech) 上，覆蓋後之間不 能有氣泡，之後再以 DryStrip Cover Fluid (Amersham Pharmacia Biotech) 覆 蓋，靜置一天。
◎ 等電點焦聚（isoelectric focusing, IEF）
利用 50μA/strip 的電流依以下條件，將蛋白質依不同 pI 值做分離:
200V 200Vhr
500V 500Vhr
1000V 1000Vhr
3000V 3000Vhr
8000V 60000Vhr
◎ 平衡（equilibration）
經 IEF 將蛋白質依不同 pI 值分離完畢後，電泳膠條需做兩個步驟的平
衡作用，使蛋白質保持在還原態。(1) 將電泳膠條浸泡在含有 0.5% w/v DTT 的 equilibration buffer (1.5M Tris, 6M urea, 30% glycerol, 2% SDS, 0.002%
bromophenol blue) 15 分鐘，目的是將蛋白質的雙硫鍵打斷。(2) 之後，再 將電泳膠條浸泡在含有 1% w/v DTT 的 equilibration buffer 15 分鐘，將蛋 白質雙硫鍵被打斷的地方，進行烷化作用（alkylation），以避免雙硫鍵再 接回。
◎ SDS-PAGE
做完平衡作用後，將電泳膠條以 MQW 沖洗後放在 11% polyacrylamide gel 上方，以 0.5% agarose sealing solution 將膠條與膠片間的空隙填滿，以 避免膠條的蛋白質擴散至電泳溶液中，以每片膠 4 瓦，12-16 小時將蛋白質 依分子量不同進行分離
◎ 銀染（silver stain）
利用 Sliver stain kit (GE Healthcare)
Step Solutions Time
Fixing Ethanol
Glutardialdehyde (25% w/v) Sodium thiosulphate (5% w/v)
Sodium acetate (17g) Make up to 250 ml with MQW
Washing MQW 5 min*3
Silver reaction Silver nitrate solution (2.5% w/v) Formaldehyde (37% w/v)
25 ml 100 µl
30 min
Make up to 250 ml with MQW
Washing MQW 1 min*3
Developing Sodium carbonate (6.25g) Formaldehyde (37% w/v) Make up to 250 ml with MQW
1 packet 10 min
Washing MQW 5 min*3
以肉眼觀察差異較大的蛋白質，並委託成大貴重儀器中心，將蛋白質從膠 體內取出，進行酵素分解、質譜分析及蛋白質身份鑑定。
2-2-8 免疫組織化學染色法（immunohistochemistry staining, IHC）
口腔腫瘤病人的病灶組織塊及周圍正常組織塊由奇美醫院病理科進行 包埋及製備，並用切片機切成 5 µm 的薄片，平鋪在載玻片上經乾燥後供本 實驗室作為染色使用。先將石蠟切片利用二甲苯（xylene）脫蠟兩次，每次 10 分鐘，再以每 5 分鐘依序以 100%、95%、80%、70%的酒精（alcohol）
進行復水，並用 pH6 的檸檬酸鈉（sodium citrate）溶液煮沸 30 分鐘，使組 織的抗原決定位裸露，再以過氧化氫（peroxidase，H2O2）作用 40 分鐘，
經 PBS(1X)緩衝液清洗後，以 3% BSA blocking 30 分鐘，以 1 倍 PBS 緩衝 液清洗，加入稀釋 250 倍 primary antibody（PRDX1）於 PBS(1X)中，在室 溫下作用 1 小時。利用 PBS(1X)緩衝液清洗後加入 Mouse/Rabbit PolyDetector HRP（Bio SB），室溫下作用 40 分鐘，以 1 倍 PBS 緩衝液清洗後，加入
PolyDetector DAB (Bio SB)呈色 3 分鐘，並利用蘇木紫（hematoxylin）染劑 做對比染色。使用封片膠封片，最後在光學顯微鏡下觀察組織中 PRDX1 的 表現情況，並拍照記錄。
2-2-9 Infection
將 Jurkat T 經 ANE 及 ANE 30-100K 篩選的細胞以 2*106的細胞數，種 在 6 cm dish，隔天加入向中央研究院所購買的病毒液(PRDX1)（表二），
加入病毒液的量以換算 M.O.I. (multiplicity of infection)為準，並且加入 3µl 的 polybrene (Mediatech, Inc)，再加入 RPMI 使總體積為 3ml 其中含 1％
FBS，隔天將培養基換成內含 10％ FBS 與 5µg/ml Puromycin (Mediatech, Inc) 培養兩天，再換掉培養基，然後取其中 10μl到 10 cm dish，不經過挑 stable clone，待細胞大量培養後，收集胞液，透過西方墨點法(Western blot)來觀察 此蛋白的表現是否受到抑制，以確認 Infection 是否成功。