3-1 ANE 和 ANE 30-100K 長期處理後的細胞株，對化療藥物的抗藥性 化療藥物通常為癌症病患治療方式首選之一，但也因容易產生抗藥 性，導致預後的效果欠佳，因此我們為探討經長期處理的細胞是否會對化 療藥物產生抗性，而影響預後的情況。
3-1-1 Jurkat T 經長期處理後，對 cisplatin 的抗藥性
我們以無血清培養基處理經 ANE（0.023 µg/ml）和 ANE 30-100K（0.016 µg/ml）長期處理的 Jurkat T，之後以 0、28、74、208 µM cisplatin 刺激 24 小時，最後以 LDH 來測定 cisplatin 對經過處理及未經處理之細胞的毒殺 性。結果顯示經 ANE 篩選（ANE-s）的 Jurkat T，與母株細胞（Jurkat T）
比較，對 cisplatin 的刺激無論在何種濃度下，細胞皆有較耐的情形，尤其 在 208 µM 最為顯著；而經 ANE 30-100K 篩選（30-100K-s）的 Jurkat T 則 在 74 µM 就有保護效果，同樣在 208 µM 時對 cisplatin 的耐受性最為明 顯（＊：P < 0.05，＊＊：P < 0.01 圖 1 (a)）。
3-1-2 OECM-1 經長期處理後，對 cisplatin 的抗藥性
以無血清培養基處理經 ANE（0.08 µg/ml）和 ANE 30-100K（0.033 µg/ml）長期處理的 OECM-1，之後以 0、0.68、1.06、1.2 mM cisplatin 刺 激 24 小時，最後以 XTT 作為細胞存活率分析。結果顯示經 ANE-s 與 ANE
30-100K-s 與 OECM-1 相較之下，在 0.68 mM 和 1.06 mM 這兩種濃度的 cisplatin，有經過處理的細胞存活率為較佳（P < 0.05 圖 1 (b)）。
3-1-3 Jurkat T 經長期處理後，對 5-FU 的抗藥性
以無血清培養基處理經 ANE 和 ANE 30-100K 長期處理的 Jurkat T，
之後以 0、6.7、18.3、40 mM 5-FU 刺激 24 小時，最後以 LDH 來測定 5-FU 對有經處理及未處理之母株細胞的毒殺性。結果顯示唯有經 ANE-s 在 6.7 mM 與 Jurkat T 比較，明顯的對 5-FU 較有耐受性，而在其他濃度以及 ANE 30-100K-s 反而比 Jurkat T 的毒殺性來得高（P < 0.01 圖 1 (c)）。
3-1-4 OECM-1 經長期處理後，對 5-FU 的抗藥性
以無血清培養基處理經 ANE 和 ANE 30-100K 長期處理 OECM-1，之後 以 0、5.6、12、40 mM 5-FU 刺激 24 小時，最後以 XTT 作為細胞存活率 分析。結果顯示 ANE-s 在 5-FU 任何濃度下細胞存活率皆比 OECM-1 來得 高，尤其在 5.6 mM 和 40 mM 更為明顯；而 ANE 30-100K-s 則是在 12 mM 和 40 mM 細胞存活率比 OECM-1 高（＊：P < 0.05，＊＊：P < 0.01 圖 1 (d)）。
3-2 ANE 和 ANE 30-100K 長期處理後的細胞株，對低氧的耐受性
腫瘤細胞經常處於缺氧環境中，在此惡劣環境下，反而會刺激癌細胞 快速生長及轉移，因此我們將進一步探討，是否長期處理的細胞，也會對
低氧產生抗性。
3-2-1 Jurkat T 經長期處理後，對低氧的耐受性
以無血清培養基處理 Jurkat T 和經由 ANE 及 ANE 30-100K 長期處理 的 Jurkat T，之後放進含 0.1 % O2 的細胞培養箱 0、12、24 小時，最後以 LDH 測定在低氧環境下對細胞造成的毒性分析。結果顯示，經過處理的細 胞於低氧環境之下 LDH 釋放的量低於 Jurkat T，證實經過處理的細胞對低 氧的耐受性較佳（＊＊：P < 0.01，＊＊＊：P < 0.001 圖 2 (a)）。
3-2-2 OECM-1 經長期處理後，對低氧的耐受性
以 無 血 清 培 養 基 處 理 經 A N E 和 A N E 3 0 - 1 0 0 K 處 理 的 OECM-1，同樣放進含 0.1 % O2 的細胞培養箱 0、24、48、72 小時，最後 以 XTT 作為細胞存活率分析。結果顯示，在低氧環境下 24 小時，篩選的 細胞存活率優於 OECM-1，證實經過處理的細胞對低氧的耐受性較佳（＊
：P < 0.05 ＊＊＊：P < 0.001 圖 2 (b)）。
3-3 Jurkat T 經 ANE 和 ANE 30-100K 長期處理後，對自體吞噬活性的影響 過去我們已知 ANE 和 ANE 30-100K 短期（24 小時）處理細胞會誘導 LC3-II 蛋白堆積，另外自體吞噬的發生也可幫助細胞在惡劣的環境下生 存，因此我們想進一步探討細胞經由低劑量的 ANE 和 ANE 30-100K 長期
處理後對自體吞噬的作用機制為如何。首先我們將 Jurkat T 與長期處理的細 胞分成培養於無血清的培養基以及含有 10% FBS 培養基兩種方式，並利用 西方墨點法觀察 DRAM 和 LC3-II 蛋白的表現情形；結果顯示，長期處理 的細胞在無血清培養基（SF）的條件下，會使 DRAM 和 LC3-II 蛋白增加，
而在含有血清培養基的條件下，則無法辨別其蛋白表現的差異性。將長期 處理之細胞 LC3-II/actin 的比值，均明顯比 Jurkat T 高，且具有統計上的意 義（＊＊：P < 0.01 ＊＊＊：P < 0.001 圖 3）。證實經長期處理的細胞在無 血清培養基的條件下較會發生自體吞噬。
3-4 Jurkat T 經 ANE 和 ANE 30-100K 長期篩選後，其條件培養液的蛋白質 表現圖譜之差異
由以上的結果得知，經長期處理的細胞具有抗藥性、耐低氧及較易發 生自體吞噬的特徵，因此為了探討經過篩選的細胞為何會有這些改變，我 們利用蛋白質體學技術（二維膠體電泳）來建立，透過整體蛋白質表現圖 譜找出其中表現有差異性的蛋白質點；首先將 Jurkat T、ANE-s、ANE 30-100K-s 培養於無血清培養基，之後分別收取條件培養液，使用 pH 值 3-10 範圍的膠條，進行二維電泳，經由銀染後即能清楚看到蛋白質圖譜（圖 4 (a)）。我們將 ANE-s 和 ANE 30-100K-s 與 Jurkat T 用肉眼比較，選出高 度 表現的 蛋白質（ → ）， 送至成大 挖點， 分析定序 ，得知 此蛋白 為
peroxiredoxin-1 (PRDX1)（圖 4 (b)）。
3-5 ANE 30-100K 對 PRDX1 所誘導的情形
由圖 4 的結果得知，經 ANE 與 ANE 30-100K 長期處理的細胞之培養 液中 PRDX1 有增強的現象；我們又進一步探討，在正常細胞 ANE 30-100K 是否也能誘導 PRDX1 的表現，因此我們利用 ANE 30-100K 以 0、4.5、9 µg/ml 短期（24 小時）處理正常口腔纖維母細胞（CMT-415），收取其胞液及細 胞培養液並透過西方墨點法觀察 PRDX1 的表現，結果顯示 PRDX1 會隨著 ANE 30-100K 濃度的增加刺激表現（圖 5 (a)）。另外我們想探討是否在檳 榔使用者的口腔鱗狀上皮細胞癌中（OSCC）會誘導更多 PRDX1 的表現，
因此我們取 5 組檳榔使用者口腔癌病人中正常與腫瘤組織切片，透過免疫 組織染色法觀察 PRDX1 在其中分布之情形，在正常組織的部分可以觀察到 PRDX1 大多表現在上皮的位置，而在腫瘤組織中大部分的細胞皆有表現，
經統計後更進一步確認 PRDX1 在腫瘤組織表現的區域大於正常組織（＊：
P < 0.05，＊＊：P < 0.01 圖 5 (b)）；我們額外挑選 4 組非檳榔使用者之腫 瘤組織切片，同樣觀察 PRDX1 分布情形，並與檳榔使用者腫瘤組織切片比 較，發現雖然同樣屬於口腔腫瘤組織切片，但依 PRDX1 表現區域來比較，
檳榔使用者比非檳榔使用者明顯高出許多（＊＊：P < 0.01 圖 5 (c)(d)）。
3-6 Jurkat T 經 ANE 和 ANE 30-100K 長期篩選，以 RNAi 方式抑制其 PRDX1
之表現
透過二維膠體電泳的結果（圖 4），我們認為 Jurkat T 經 ANE 和 ANE 30-100K 長期刺激後則較會誘導 PRDX1 的分泌，因此我們利用向中研院購 買不同序列的 PRDX1 RNAi（PRDX1-511 及 PRDX1-512）構築的 lentivirus，
以感染的方式，抑制 PRDX1 的表現;結果初步證實 PRDX1-512 抑制的效率 為較佳。