材料與方法

2.2.1. 希仙草萃取製備

希仙草購自於茶源山企業行，經由 DNA 定序確認確實為希仙草(Hsu et al., 2012) 並以打粉機作第一次打粉(網目：1.3 mesh，即直徑 1.3 cm 之篩板) 後，再做第二次打粉(網目：0.2 mesh，即直徑 0.2 cm 之篩板)。9.3 公斤的希 仙草粉末用 47 L 的 95%酒精萃取 1 天，重複此步驟萃取三次，過濾濃縮後 用真空冷凍乾燥機將水分去除，萃取總重為 489 g， SOE 之萃取率約 5.3%。

2.2.2. 細胞培養

RL95-2 (子宮內膜癌) 購自 ATCC； A549 (肺癌)、Hep G2 (肝癌)、FaDu (咽喉癌)、MDA-MB-231 (乳癌)及 LNCaP (前列腺癌)細胞皆購自於新竹生物 資 源 中 心 (Bioresource Collection and Research Center, BCRC) 。 RL95-2 、 A549、Hep G2、FaDu 和 MDA-MB-231 培養液為 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (Grand Island, N.Y., USA)，而 LNCaP 培養液則為 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) (Grand Island, N.Y., USA)，所有培 養基並含有 10% Fetal bovine serum (FBS)、100 units/ml penicillin-100 μg/ml streptomycin、1% L-glutamine、0.02% NaHCO₃、dH₂O, pH 7.2-7.4，培養箱條 件為 37℃，5% CO₂ 及 95% 空氣。

2.2.3. 細胞存活率分析－MTT assay

其原理是因為活細胞粒腺體內的琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase) 可將水溶性黃色 methylthiazoleltetrazolium bromide (MTT)還原成脂溶性的紫 色 formazan 結晶，之後藉由加入二甲亞颯 (Dimethyl sulfoxide, DMSO)溶劑可 使藍紫色結晶溶解，故可利用分光光度計來偵測藍紫色吸光值強度(OD₅₇₀)以 估算細胞的存活率。

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將癌細胞以 2×10⁴ cells/well 之密度，培養於 96 孔盤，經 24 hr 細胞貼附 後加入不同濃度樣品，再培養 24、48 及 72 hr 後移除細胞上清液，加入 100 μl 含 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (5 mg/ml) DMEM 的培養基。2 hr 過後，移除上清液後加入 100 μl DMSO 使 formazan 溶出，於波長 570 nm 的 ELISA reader 測其吸光值。存活率係以下 列公式進行計算：

Viability (%) = (OD₅₇₀ of drug-treated sample/OD₅₇₀ of untreated sample)×100%

此外，半致死劑量 IC₅₀ (half maximal inhibitory concentration) 則定義為抑制 50%癌細胞生長所需要的樣品有效濃度。

2.2.4. 細胞型態變化觀察

將癌細胞以 1×10⁴ cells/well 之密度，培養於 24 孔培養盤，經 24 hr 細胞 貼附後加入不同濃度樣品，再進行培養 12、24 及 48 hr ，並以倒立式光學顯 微鏡 (Nikon Eclipse TS100, Japan) 與微影像電子目鏡 (YOVICA, Kukusio Biomedical products, Taiwan) 觀察細胞投藥後之型態變化。

2.2.5. 細胞週期之研究

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中，以轉速 100×g 離心 5 min 去除上清液後加入冰冷 PBS 數次清洗殘餘細 胞，再次以 200×g 離心 10 min 去除上清液後以 70%冰冷乙醇溶液固定 24 hr，最後，加入 PI 染劑均勻混合後，避光冷藏於 4℃冰箱約 12 hr 以上，再 以 FACSCalibur^TM Flow Cytometer (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA)分 析，並利用 WinMDI 2.9 軟體((TSRI, La Jolla, CA, USA)計算細胞週期比例。

圖 2-1、細胞週期 (擷取自 BD biosciences 公司網頁)

2.2.6. 細胞凋亡之研究

在正常的生理環境下，磷脂絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)分佈於細胞膜 內側，但當細胞因老化或外在刺激而走向細胞凋亡時，細胞膜的磷脂分佈會 失去對稱性，此時 PS 會從細胞膜內側外翻至外側以吸引吞噬細胞等來清 除。Annexin V 對於 PS 具有高度的親和性，因此可用來偵測細胞凋亡。在細 胞凋亡的初期，細胞膜還維持在完好的狀態，所以 PI 無法穿過細胞膜進入 細胞，但當進入到細胞凋亡後期時，細胞膜失去完整性，所以 PI 就會進入 到細胞內。因此，將 Annexin V 及 PI 染劑合併使用便可將凋亡早晚期的細胞 以及死細胞區分開來。

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將 1×10⁶的癌細胞培養在 6 cm dish 中，置於 5% CO₂、37℃培養箱中培 養 24 hr 後以不同濃度樣品加入待測細胞株中，再於培養箱中分別培養 24、

48 及 72 hr。待培養固定時間後將培養液收集於離心管中，以轉速 100×g 離 心 5 min 去除上清液後加入冰冷 PBS 清洗細胞數次，並以 Trypsin-EDTA 處 理使細胞懸浮，將懸浮液收集於離心管中，以轉速 200×g 離心 10 min 去除上 清液後加入 Annexin V-FITC 染劑與 binding buffer 均勻混合後，避光置於冰 上約 15-20 min，再以 BD FACSCalibur^TM Flow Cytometer 分析，並利用 WinMDI 2.9 軟體計算細胞凋亡比例。

圖 2-2、細胞凋亡分析 (擷取自進階生技公司網頁)

2.2.7. 西方墨點法

先利用不同濃度之 SDS 電泳膠，將蛋白質依不同分子量加以分離後，

轉漬至膜上，再加入一級抗體，利用抗體會與抗原的抗原決定基專一性地結 合。隨後，利用可與 ECL 接合之二級抗體反應之後，以 ECL 試劑反應，膜 上與抗體結合的位置會發出冷光，再利用冷光影像分析儀拍攝即可得到清晰 的蛋白定量結果。

將 1×10⁶的癌細胞培養在 6 cm dish 中，置於 5% CO₂、37℃培養箱中培 養 24 hr 後以不同濃度樣品加入待測細胞株中，再於培養箱中培養 24 hr。待

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將已完成的 SDS-PAGE 凝膠取出，利用蛋白質轉漬槽(TE70 ECL Semi-Dry Transfer Unit, Amersham Biosciences, GE Healthcare, Piscataway, N.J., USA) 進行轉漬，將經過甲醇處理 5 min、去離子水處理 5 min 及 Blotting buffer 處 理 15 min 的 PVDF 膜置於 Extra Thick Blot Paper 上方，將凝膠置於 PVDF membrane (Immobilon-P Transfer Membrane, Millipore, Bedford, M.A., USA)上 方，並另外用 Extra Thick Blot Paper 覆蓋，裝設好裝置之後，進行轉漬(25 V, 200 mA, 1 hr/片)。

將轉漬完成的 PVDF membrane 置於 Blocking buffer 中，於室溫下以搖 擺振盪器輕輕搖動(15 rpm)反應 1 hr，以阻斷非特異性結合。待時間到後將 Western Blotting Detection Reagents 呈現螢光物質，再利用冷光影像分析儀 (ChemiDocTMXRS+ System, Bio-Rad, USA)，可得到清晰的蛋白定量結果。

2.2.8. GC-MS 分析

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將待測樣品溶於溶劑中，並使用 GC-MS 分析(Varian 450-GC 和 240-MS system) ， 管 柱 為 VF-5ms capillary column (30 m × 0.25 mm, 0.25 μm, FactorFour^TM, USA)。注射器和檢測器溫度分別設定在 250℃和 290℃，烘箱 溫度一開始在 50℃維持 5 min，然後以每分鐘 5℃的速度升溫至 120℃，保 持在 120℃下 8 min，然後以每分鐘 10℃的速率升溫至 300℃。載流氣體氦 氣流速為 1 mL/min，1 μL 樣品在分流模式下注入。將所收取數據之分析 peak 按時間排序，顯示 peak 面積及含量，以 Library search spectrum 依據 R.

match、F. match、Prob.及 m/z 訊號逐項篩選最符合之化合物，並以 National Institute of Standard and Technology (NIST MS 2.0 database, Gaithersburg, MD, USA) 確認。

2.2.9. 統計分析

數據結果以平均值 ± 標準差(mean ± SD)表示，各組與對照組間之數據分 析以 Student’s t-test 進行統計分析(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)。