第三章 希仙草萃取物對人類子宮內膜癌 細胞轉移之抑制作用及對基因訊息
3.2.7. 細胞侵襲能力試驗－Cell invasion assay
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Cell invasion assay 為測試細胞侵襲能力的方法，當癌細胞要進行轉移 時，癌細胞需分泌酵素降解 ECM，突破基底膜的限制進入血液(淋巴)循環進 行轉移，而此法利用一層基質 (Matrigel) 將細胞隔在上層，經固定的培養時 間後，隨後以顯微鏡觀察不同株子宮內膜癌細胞之移行穿過此基質的能力 (圖 3-3)。
圖 3-3、Cell invasion assay (擷取自 Cell Biolabs 公司網頁)
將 BD BioCoat™ Matrigel™ Invasion Chamber (BD Biosciences, Billerica, MA, USA) 的 Matrigel Invasion Chambers 浸泡於不含血清的培養液中，置入 5% CO2 的 37℃培養箱培養 4 hr。將 1×106/mL 不含血清的癌細胞懸浮液培養 在 Matrigel Invasion Chambers 中，Matrigel Invasion Chambers 下方則加入含 血清的的培養液並置於 5% CO2、37℃培養箱中培養 24 hr 後以不同濃度樣品 (樣品最高濃度在 IC20值以下)及 2.5 ng/mL 的 TGFβ1 加入待測細胞株中，再 於培養箱中分別培養 72 hr。待培養固定時間後，將上層 insert 內部的培養液
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吸除，以 PBS 清洗三次並將 insert 放入 methanol 中 20 min 以固定細胞，再 用棉尖拭子末端輕輕拭除 insert 內部未移行的細胞。在新的 24 孔盤內加入 400 µl Crystal violet stain solution，並將所有 insert 換至到此 24 孔盤中，把 insert 在室溫下浸泡在此染色液中 30 min。以 PBS 並輕輕清洗已染色的 insert 數次後將 insert 放置風乾 30 min，然後把 insert 放在顯微鏡下觀察不同劑量 樣品對細胞移行能力的影響。細胞侵襲能力指標(Invasion index) 之計算如下 列公式：
Invasion index (%) = 藥物處理後侵襲至下層的細胞量/控制組細胞量 × 100%
3.2.8. 西方墨點法
先利用不同濃度之 SDS 電泳膠，將蛋白質依不同分子量加以分離後，
轉漬至膜上，再加入一級抗體，利用抗體會與抗原的抗原決定基專一性地結 合。隨後，利用可與 ECL 接合之二級抗體反應之後，以 ECL 試劑反應，膜 上與抗體結合的位置會發出冷光，再利用冷光影像分析儀拍攝即可得到清晰 的蛋白定量結果。
將 1×106的癌細胞培養在 6 cm dish 中，置於 5% CO2、37℃培養箱中培 養 24 hr 後以不同濃度樣品加入待測細胞株中，再於培養箱中培養 24 hr。待 培養固定時間後去除培養液，以冰冷磷酸緩衝溶液清洗細胞兩次，加入 modified RIPA 緩衝液 150 μL，緩慢使溶液完全浸潤 dish 表面，再收集細胞 至微量離心管中靜置 20 min，最後以 12000 rpm 於 4℃ 離心 5 min，得到上 清液為細胞溶解液。測定蛋白質濃度後，將 35 μg 蛋白質溶液、去離子水與 sample buffer 混合均勻並離心後，於 95℃加熱 5 min 使蛋白質變性，待其冷 卻後，再次離心 (6000 rpm, 5 min)，放入電泳樣品槽中進行電泳，首先以較 低的伏特，讓 band 的形狀較完整 (50 V, 60 mA, 30 min)，後再轉至高伏特 (100 V, 60 mA, 90 min)。
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將已完成的 SDS-PAGE 凝膠取出，利用蛋白質轉漬槽 (TE70 ECL Semi-Dry Transfer Unit, Amersham Biosciences, GE Healthcare, Piscataway, N.J., USA) 進行轉漬，將經過甲醇處理 5 min、去離子水處理 5 min 及 Blotting buffer 處 理 15 min 的 PVDF 膜置於 Extra Thick Blot Paper 上方，將凝膠置於 PVDF membrane (Immobilon-P Transfer Membrane, Millipore, Bedford, M.A., USA)上 方，並另外用 Extra Thick Blot Paper 覆蓋，裝設好裝置之後，進行轉漬(25 V, 200 mA, 1 hr/片)。
將轉漬完成的 PVDF membrane 置於 Blocking buffer 中，於室溫下以搖 擺振盪器輕輕搖動 (15 rpm) 反應 1 hr，以阻斷非特異性結合。待時間到後將 浸泡 PVDF membrane 的 Blocking buffer 去除，以 PBST 清洗 10 min 重覆 3 次後，加入一級抗體，放 4℃，15 rpm 反應 overnight 後，以 PBST 清洗 PVDF 膜 10 min 3 次，以去除非特異性結合並加入二級抗體，並於室溫下以 搖擺振盪器輕輕搖動 (15 rpm) 反應 1 hr 後，去除二級抗體溶液，並以 PBST 清洗 PVDF 膜 10 min 3 次，以去除非特異性結合。最後利用 ECL Plus Western Blotting Detection Reagents 呈現螢光物質，再利用冷光影像分析儀 (ChemiDocTMXRS+ System, Bio-Rad, USA)，可得到清晰的蛋白定量結果。
3.2.9. 統計分析
數據結果以平均值 ± 標準差(mean ± SD)表示，各組與對照組間之數據 分析以 Student’s t-test 進行統計分析(a: p<0.05, b: p<0.01, c: p<0.001)。