SOE 對 RL95-2 細胞內凋亡蛋白及抗凋亡蛋白之影響

引起細胞凋亡的途徑主要分為外在路徑(Extrinsic pathway) 以及內在路徑 (Intrinsic pathway) (Yoon et al., 2002)。為了闡明 SOE 介導細胞凋亡的分子途 徑 效 應 ， 本 研 究 觀 察 經 不 同 濃 度 SOE 處 理 RL95-2 子 宮 內 膜 癌 細 胞 內 Caspases 家族蛋白表現，由圖 2-6 顯示隨著 SOE 劑量增加 procaspase-3、

procaspase-8、procaspase-9 明顯所有的 procaspases 皆隨 SOE 濃度增加而被降 解，其後 caspases 亦隨濃度增加而被活化。

許多胞質蛋白亦參與細胞凋亡的調控，特別是 Bcl 家族蛋白，包含 Bcl-2 與 Bcl-xL，此類蛋白於細胞中屬於抗凋亡蛋白，對應於 Bcl 家族蛋白，其 餘尚有 Bax、Bad 與 Bak 蛋白，在細胞中執行促使細胞死亡的工作(Catz and

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Johnson, 2003)，由圖 2-6 顯示隨著 SOE 劑量增加，Bad、Bax 與 Bak 蛋白表 現隨而增加，相對地，Bcl-2 與 Bcl-xL 蛋白表現減少，結果指出 SOE 藉由調 控細胞內凋亡蛋白及抗凋亡蛋白使子宮內膜癌 RL95-2 細胞走向凋亡。

圖 2-4、不同劑量 SOE 處理不同時間對於子宮內膜癌 RL95-2 細胞生長週期 比例之影響。未加藥處理為 Control 組，0.5% DMSO 為 Vehicle 組。

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圖 2-5、不同劑量 SOE 處理不同時間對於子宮內膜癌 RL95-2 細胞凋亡比例 之影響。LL：左下角象限，UL：左上角象限，LR：右下角象限，UR：右上 角象限。未加藥處理為 Control 組，0.5%DMSO 為 Vehicle 組。

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圖 2-6、不同劑量 SOE 處理 24 hr 對於子子宮內膜癌 RL95-2 細胞內訊息分子 的表現量，以β-actin 作為 loading control。

24 2.3.6. SOE 對不同人類癌細胞之毒殺活性

為了調查 SOE 對於其他癌細胞之毒殺效果，SOE 用以處理不同癌細 胞。由表 2-1 顯示 SOE 對多種癌細胞株生長皆有抑制生長作用，包括人類肺 腺癌細胞(A549)、類肝癌細胞(HepG2)、咽部鱗狀細胞癌(FaDu)、人類乳癌 腺癌細胞(MDA-MB-231)及人類攝護腺癌細胞(LNCaP)，其中以 LNCaP 的抑 制生長效果最為顯著，處理 24 hr 的 IC₅₀ = 87.2 ± 1.3 μg/mL。此外，SOE 對 於肺正常細胞 MRC-5 的毒殺作用則較低(IC₅₀ = 220.8 ± 4.5 μg/mL)，顯示 SOE 對癌細胞的毒殺具有選擇性。

表 2-1、SOE 對不同細胞株處理 24 hr 之毒殺效果 IC₅₀值

Cell Type Cell Line IC50

(μg/mL)^a

Human endometrial carcinoma RL95-2 163.5 ± 3.3

Human lung carcinoma A549 179.1 ± 1.8

Human hepatoblastoma Hep G2 135.4 ± 2.4

Human pharynx squamous cell carcinoma FaDu 105.0 ± 1.8 Human breast adenocarcinoma MDA-MB-231 124.3 ± 4.0

Human prostate carcinoma LNCaP 87.2 ± 1.3

Human normal lung cells MRC-5 220.8 ± 4.5

aResults are expressed as mean ± SD of five experiments.

2.3.7. SOE 主要成份對 RL95-2 細胞之影響

由 圖 2-7 與 表 2-2 的 GC-MS 分 析 結 果 顯 示 ， SOE 之 主 要 成 份 有 caryophyllene oxide (CPO, 46.9%)、[−]-spathulenol (25.7%)、hexadecanoic acid ethyl ester (9.6%) 和 caryophyllene (CP, 3.1%)。CPO、CP、6,10,14-trimethyl-2-pentadecanone 和 hexadecanoic acid ethyl ester 為 SOE 中所含之成分且可由

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圖 2-7、SOE 之氣相層析質譜儀(GC/MS)分析圖譜

表 2-2、利用氣相層析質譜儀(GC-MS)分析 SOE 之主要成分

No. Component Rt

(min)^a

Percentage (%)^b

R.

Match

1 2-Oxabicyclo[2,2,2]octane-6-ol 20.72 1.8 763

2 2-tert-Butyl-1,4-dimethoxy-benzene 23.13 3.8 805

3 Caryophyllene 23.59 3.1 866

4 cis-α-Bisabolene 26.57 4.1 860

5 [−]-Spathulenol 27.62 25.7 853

6 Caryophyllene oxide 27.95 46.9 858

7 cis-Lanceol 29.28 1.7 719

8 [Z,Z,Z]-9,12,15-Octadecatrienoic acid ethyl ester 32.49 1.2 736

9 6,10,14-Trimethyl-2-pentadecanone 33.53 2.1 790

10 Hexadecanoic acid ethyl ester 36.93 9.6 794

a Retention time (min); ^b Relative percentage calculated by integrated peak area.

26 Aspirin、digoxin 與 taxol 等(Lyseng-Williamson and Fenton, 2005)。近年來，

報導指出一些植物萃取物已普遍使用在對抗更年期疾病，包含大豆(Glycine max L.)、黑升麻(Cimicifuga racemosa L.)、紅花苜蓿(Trifolium pratense L.) 及 蛇麻(Humulus lupulus L.)衍生物。此外，亦有文獻宣稱希臘蜂蜜提取物在人 類癌細胞如抗雌激素活性之 MCF-7、攝護腺癌與子宮內膜癌具有明顯的細胞 抑制活性；石榴甲醇萃取物在濃度範圍 20-320 μg/mL 分別對人類乳癌細胞 (MCF-7、MDA-MB-231)、子宮內膜癌細胞(HEC-1A)、子宮頸癌細胞(SiHa、

HeLa)、卵巢癌細胞(SKOV3)與正常乳纖維細胞(MCF-10A)具有抑制生長活性 (Sreeja et al., 2011)，而本篇研究為首次探討台灣產希仙草萃取物及其活性成 分對子宮內膜癌之抗癌活性。

細胞凋亡(Apoptosis)，一種導致細胞程序性死亡 (Programmed cell death, PCD)的機制，在保護人體對抗腫瘤生成的過程中扮演著一個關鍵的角色，其 可藉由消除不必要的或失常的細胞以維持細胞存活和細胞死亡之間的正常平 衡 (Cotter, 2009)。“細胞程序性壞死”為目前在癌症治療研究中相當受到重 視的一個作用機轉，促使細胞凋亡的產生可提升癌症治療的有效性，其也是 抗藥性癌症新藥開發的一個重要趨勢 (Han et al., 2007; Hassan et al., 2014)。

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因此，誘導凋亡的產生已為目前研發抗癌藥物或治療癌症的主要研究焦點。

如圖 2-8 所示，細胞凋亡主要由兩條途徑主導，一條為外因途徑 (extrinsic pathway)：由死亡受器 (death receptor, DR) 傳導凋亡訊息；另一條為內因途 徑 (intrinsic pathway)：經由粒線體釋放 cytochrome c 傳導凋亡訊息，兩者交 會形成 caspase 途徑而執行細胞凋亡 (Yoon et al., 2002)。Casapses 的活化被認 為是引發細胞凋亡的生物指標 (Kaufmann et al., 1993)，外因途徑涉及 TNF 家 族死亡受器的寡合作用，使膜內區域 caspase binding adaptor 蛋白增加，隨後 導致 caspae-8 活化 (Yoon and Gores, 2002)；內因途徑之 cytochrome c 藉由 ATP 與 Apaf-1 和 procaspase-9 結合成凋亡小體，因此當 cytochrome c 的大量 增加，會使 procaspase-9 降解而活化 caspase-9 活性，但無論外因與內因途 徑，最終皆會活化 caspase-3 的向上調控，促使下游 PARP 裂解，終至達成 細胞凋亡 (Hassan et al., 2014)。本研究結果中 SOE 可向上調控外因途徑相關 蛋白 caspase-8 與內因途徑相關蛋白 caspase-9，且以 caspase-9 活化現象較為 顯著，顯示 SOE 是以內因途徑造成凋亡成因為主，並導致下游 caspase-3 活 化促使細胞凋亡。

內因途徑中 Bcl-2 family 是促進或抑制細胞凋亡的重要調控者，依其結 構以及功能的不同，Bcl-2 蛋白可分為三個 subfamily：(1) Bcl-2 subfamily，

主要功能是抑制細胞凋亡的發生，其成員包括 Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W 及 Mcl-1；(2) Bax subfamily，主要功能是促進細胞凋亡的發生，其成員包括有 Bax、Bak 及 Bok；(3) Bcl-2 homology or BH3-only，僅有 BH3 的 Bcl-2 亞家 族，主要功能亦是促進細胞凋亡，其成員包括有 Bik、Blk、Bad 及 Bid (Li et al., 2002; Shangary and Johnson, 2002; Zhao et al., 2003)。在正常環境下，細胞 內這些不同功能的 Bcl-2 family 的表達，基本上是處於相對的動態平衡狀 態，一旦細胞受到任何凋亡訊息刺激後，促凋亡蛋白的表達量亦隨之增加，

而改變其動態平衡(Li et al., 1998)。本研究結果中 SOE 可向上調控促凋亡蛋

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白 Bad、Bak、Bax，並向下調控抗凋亡蛋白 Bcl-XL、Bcl-2，顯示 SOE 是循 著內因途徑造成癌細胞凋亡。

圖 2- 8、細胞凋亡之訊息傳遞路徑(Ashkenazi, 2008)

本研究中藉由顯微鏡觀察經 SOE 處理之 RL95-2 細胞，隨濃度與處理時 間延長，出現細胞皺縮、空泡化、細胞膜脹破等現象，最終造成細胞懸浮與 許多凋亡小體，顯示細胞有走向計畫性凋亡之特徵。以流式細胞儀分析細胞 週期變化，結果顯示 SOE 可使 RL95-2 細胞停滯生長於 G2/M 期促使細胞走 向凋亡。許多藥物也是透過抑制癌細胞生長並促發細胞凋亡，而發揮藥物特 有活性，如腰果(cashews) 與漆樹 (Rhus verniciflua Stokes) 樹皮分離物 Butein 可藉由促成細胞體 ROS 增生，使肝癌細胞停滯生長於 G2/M 期，最後誘發細

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胞凋亡 (Moon et al., 2010)；印度獼猴桃所含 catechin 類化合物 pyrogallol 能 使肺癌細胞停滯生長於 G2/M 期，並在動物模式中有效抑制腫瘤增生(Yang et al., 2009)；百里香 (Thymus vulgaris) 中分離出的柚皮素 (naringenin) 能誘導 乳癌細胞及大腸癌細胞停滯生長於 S 期與 G2/M 期，經由活化 caspase-3、

caspase-7、caspase-8 與 caspase-9 蛋白誘發細胞凋亡 (Abaza et al., 2015)。

CPO 及 CP 是倍半萜類化合物，主要來源於藥用植物的精油，如羅勒、

萬壽菊、香椿、穗花香苦草等(Bayala et al., 2014; Shirazi et al., 2014; Wu et al., 2014)。CP 已被證實對於於許多細胞株具有抑制生長的效果，包含口腔癌、

肝癌、肺癌、大腸癌、黑色素瘤、白血病及紅血球性白血病(Lampronti et al., 2006 ; Tundis et al., 2009 ; Su et al., 2013)。過去研究中也指出 CPO 可透過抑 制 PI3K/AKT/mTOR/S6K1 及 Reactive oxygen species (ROS) 引起 Mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway 的活化達到抑制人類前列腺癌及乳癌 細胞的生長並誘導其走向凋亡(Park et al., 2011; Ryu et al., 2012)。此外，根據 2013 年 Kim et al.的研究中 CPO 可藉由抑制基本內生型(constitutive)與誘發型 (inducible)的 STAT3 活化進而延緩多發性骨髓瘤、乳腺癌和前列腺癌細胞的 增生、誘導凋亡及抑制癌細胞的侵襲。因此，此兩種成分可能為 SOE 中主 要的活性成分。

儘管這兩種化合物僅有些微的結構差異，但 CPO 對於 RL95-2 的抗增生 效果較 CP 的效果為佳，與 2014 年 Sain et al.的研究中所指出的 CPO 較 CP 對於 Jurkat 急性 T 细胞白血病细胞株及人類神經母細胞瘤 IMR-32 細胞株有 較佳細胞毒性的結果一致；此外，另一篇研究中也指出 CPO 較 CP 有較好的 殺蟎活性(Oh et al., 2014)。這些研究結果顯示，CP 的微小結構差異可能顯著 影響其生物活性。

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第三章

希仙草萃取物對人類子宮內膜癌 細胞轉移之抑制作用及對基因

訊息傳遞路徑之影響

31 (Lotocki et al., 1983)。子宮內膜癌的治療普遍是以手術合併術後輔助放射線 治療或化學治療為主，然而，已有研究證實放射線治療反而有助於多型性神 經膠母細胞瘤及胰臟癌細胞 MMP-2、MMP-9 的表現(Wild-Bode et al., 2001;

Qian et al., 2002)。此外，放射線治療也會透過增加子宮內膜癌細胞上皮間質 轉換而增強其侵襲能力(Tsukamoto et al., 2007)。

癌症的侵襲和轉移是癌症病患治療失敗或死亡的重要原因，有幾個關鍵 蛋白質成分(Woessner, 1991; Raza and Cornelius, 2000; Di Nezza et al, 2002)。

MMPs 依 據 其 結 構 及 受 質 特 異 性 的 不 同 可 區 分 為 四 大 類 ： 膠 原 蛋 白 酶 (collagenases)、基質溶解素(stromelysins)、明膠分解酶(gelatinases)、細胞膜 類 基 質 金 屬 蛋 白 酶 (membrane-type MMPs) (Stetler-Stevenson et al., 1996;

Curran and Murray, 1999)。MMP-2 (gelatinase A)為第四型膠原蛋白酶(72-kDa type IV collagenase)，在許多惡性腫瘤及子宮內膜異位的病患中皆可發現其過 量表現(Stetler-Stevenson et al., 1994; Chung et al., 2002)。MMP-9 (gelatinase B)

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也是第四型膠原蛋白酶 (92-kDa type IV collagenase)，除了可分解第四型膠原 蛋 白 之 外 ， 還 可 分 解 第 二 及 第 五 型 膠 原 蛋 白 、 明 膠 (gelatin) 及 彈 性 蛋 白

轉化生長因子-β (Transforming growth factor β, TGFβ)在致癌的過程中扮 演著重要的角色，可以調節人類癌症中致癌的過程，包含癌細胞的增生、存 活、血管新生、移行及侵襲等過程(Alfranca et al., 2008; Pardali and ten Dijke, 2009; Ikushima and Miyazono, 2010)。癌症的發生、進展及轉移過程中皆需透 過複雜的訊息傳遞(Bierie and Moses, 2006; Han and Wang, 2011)，而在臨床研 究中也提出第一期及第二期子宮內膜癌患者血清中的 TGFβ 具有顯著的表現 量(Chopra et al., 1997)。此外，在近期的研究中已指出 TGFβ1 為子宮內膜癌 侵襲作用的關鍵因素，而 TGFβ1 已經被證實透過促進 EMT 的發生進而導致 子宮內膜癌的侵襲作用(Muinelo-Romay et al., 2011)。在先前的研究中，已有 許多研究針對癌症的移行、侵襲及轉移作用做進一步的探討，而其中已有文 獻指出子宮內膜會透過調節 PI3K/Akt 及 MAPK pathway 進而影響其增殖和 侵襲作用並增加 MMP-2 及 MMP-9 的表現量(Zhang et al., 2012; Shan et al., 2013)，此外，TGFβ1、PI3K/Akt 及 MAPK pathway 也被提出具有調解 EMT 的功能(Peinado et al., 2003; Nawshad et al., 2005)。

在前一章的研究中已經證實希仙草乙醇萃取物 SOE 對於子宮內膜癌之 生長具有顯著抑制效果，故在此章研究中進一步探討 SOE 對細胞移行作 用、內部基因訊息及所分泌出具侵蝕性明膠酶的影響，以瞭解 SOE 對於癌 細胞移行與侵襲的抑制機轉。

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3.2. 材料與方法

3.2.1. 希仙草萃取物製備

請參閱 2.2.1 節之萃取製備方法。

3.2.2. 細胞培養

子宮內膜癌 RL95-2 及 HEC-1A 細胞購自 ATCC；培養液為 Dulbecco’s

子宮內膜癌 RL95-2 及 HEC-1A 細胞購自 ATCC；培養液為 Dulbecco’s