第二章 材料與方法
第一節 研究物種
紅樹林鱂魚 K. marmoratus (Cyprinodontiformes 鱂形目、Rivulidae 溪鱂科)，
原名為 Rivulus marmoratus，於 2004 年分類到不同屬而更改學名(Costa 2004)。此 魚分布範圍於美國佛羅里達至巴西等地的紅樹林沼澤(Taylor et al. 2008)。K.
marmoratus 為一種雌雄同體、自體受精且具同型合子染色體的魚類(Harrington
1961；Taylor 2001)。K. marmoratus 在野外多躲藏於為潮濕枝葉下方或陸生蟹的 巢洞中(Taylor 1992)；而離開水體的個體，其鰓蓋會停止運動，藉由擴張表皮與 魚鰭上的毛細血管網來呼吸(Grizzle & Thiyagarajah 1987)。此外，在實驗室觀察，
當兩隻 K. marmoratus 相遇時會表現出明顯的攻擊性與打鬥行為(Hsu & Wolf 1999)。
本研究使用於本實驗室繁殖的五個品系(stain)進行實驗；DAN2K 來自於貝 里 斯 香 格 里 拉 鎮 (Dangria, Belize) ； HON9 來 自 於 宏 都 拉 斯 烏 蒂 拉 島 (Utila, Honduras)；RHL 來自於巴哈馬聖薩爾瓦多島(San Salvador, Bahamas)；SLC8E 來 自於美國佛羅里達州聖露西郡(St. Lucie County, Florida, USA)；VOL 來自於美國 佛羅里達州德通海灘市(Daytona Beach, Florida, USA)。此五種品系由 Taylor 博士 從野外採集，於 2002 年 10 月到 12 月進口至本實驗室(防疫二字第 091414621 號)。
目前五個品系皆在實驗室中成功且穩定地繁殖。每個個體皆單獨飼養於半透明聚 丙烯(polypropylene，P.P.)塑膠飼育盒(13.2×13.2×9 立方公分)，以避免互鬥。飼育 盒內含有 550~650 毫升、濃度為 24~26 ppt 的人工海水(以海水素 Instant Ocean ® Sea Salt 或 Coralife ® Salt 配製)，每三周更換乾淨的水。飼養環境溫度維持在 24~26
℃且日夜周期比例為 14：10 h，每天以孵化兩日的新鮮豐年蝦(brine shrimp，
Artemia salina)餵食。
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第二節 實驗設計
為瞭解對手間體型與近期打鬥經驗上的差異共同影響 K. marmoratus 打鬥結 果之方式，本研究使用 3×4 之二因子實驗設計(共 12 種處理)，包含三種體長差 距處理與四種打鬥經驗差異組合；每處理組的樣本數為 40，共使用 480 對(960 隻)魚(表一)。三種體長差異由小至大分別為：0~1 公厘差異、1~2 公厘差異及 2~3 公厘差異。先前 K. marmoratus 的打鬥研究(Hsu & Wolf 1999)指出當體長差異介 於 0~1 公厘時，較大與較小個體之獲勝機率沒有顯著差異，因此 0~1 公厘體長差 異組被視為體長控制組。而每一種體長差異之配對會再被隨機地分配到四種打鬥 經驗差異組合，原則上配對中體長較大的一方獲得相對劣勢的打鬥經驗，而體長 較小的一方獲得相對優勢的打鬥經驗：(1)打鬥者雙方皆無近期勝敗經驗(N-N)，
(2)較大個體無打鬥經驗，較小個體則被給予獲勝經驗(N-W)，(3)較大個體被給予 落敗經驗，較小個體則無打鬥經驗(L-N)，(4)較大個體被給予落敗經驗，較小個 體則被給予獲勝經驗(L-W)。配對中之較小一方的體長被控制於 27.0±0.2 公厘間。
在所有處理組中，以體長較大一方為分析的目標個體，用於瞭解當個體相較於對 手有較差的打鬥經驗時，其體型比對手大之優勢是否能彌補打鬥經驗上的劣勢。
從 N-N 經驗組合中的 0~1 公厘差異、1~2 公厘差異及 2~3 公厘差異三處理 組，可檢測不同體長差異對個體打鬥行為的影響。於 0~1 公厘差異處理中之 N-N、
N-W、L-N 與 L-W 四種打鬥經驗組合，則可檢測近期打鬥勝敗經驗對個體打鬥 行為的影響。其餘六組處理的打鬥對手同時具有體長與打鬥經驗上之差異，則被 用來檢測體長差異與近期打鬥勝敗經驗共同影響個體打鬥行為之方式。
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第三節 實驗流程
本研究實驗流程為三天，第一天將已測量體長的個體分配到各處理組；第二 天給予個體指定打鬥經驗處理；第三天則讓配對個體打鬥並錄影記錄。以下將詳 細敘述各步驟：
一、實驗個體選擇
本研究所使用的魚先前都有被用來進行其他打鬥研究。為了避免實驗個體於 本實驗前獲得的打鬥經驗對本實驗結果造成影響；同時，也為避免實驗個體被過 度使用，本研究使用至少一個月未被用來進行其他實驗的個體進行實驗。
二、體長測量與實驗個體配對
我測量個體的上顎前端至尾鰭基部距離之標準體長(standard length)為打鬥 配對依據。配對的兩隻個體須屬同一品系。此外，由於打鬥勝敗經驗對 K.
marmoratus 打鬥行為的影響長達一個月(Lan & Hsu 2011)，因此，配對的兩隻個 體在一個月前的打鬥結果(獲勝/落敗)也必須相同。
三、標記魚體
為辨識實驗個體，我使用以酒精消毒過的針，劃破實驗個體的尾鰭上端或下 端鰭條間的薄膜作為標記(隨機挑選)，若配對個體其中一方被標記尾鰭上端，另 一方則被標記尾鰭下端。由於薄膜上無血管，此標記方式不會使魚流血，而劃破 的薄膜會在三到四天癒合。
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四、給予實驗個體獲勝或落敗經驗
此研究使用「經驗訓練者」強迫使實驗個體獲得預定的經驗。經驗的給予皆 於打鬥缸(圖一，10.5×7.5×19.5 立方公分)中進行。打鬥缸內部的側面與背景面裝 置黑色不透明隔板，以避免外界干擾。一開始時，打鬥缸中央使用一片黑色不透 明隔板將打鬥缸區分為左右兩個大小相同的空間，實驗個體與其經驗訓練者被分 別放置於此二空間(隨機選定)。給予實驗個體一個獲勝經驗(W)時，所使用之經 驗訓練者(標準敗者)為比實驗個體小 2 公厘以上且有多次落敗經驗的同品系個體。
而給實驗個體落敗經驗(L)時，經驗訓練者(標準勝者)則比實驗個體大 2 公厘以上 且有多次獲勝經驗的同品系個體。給予無經驗(N)處理時，則是將實驗個體放置 於打鬥缸中，但中央隔板之另一邊未放置任何經驗訓練者。
在實驗個體與其經驗訓練者於缸中適應 15 分鐘後，我便將隔板抽開，當實 驗個體擊退較自己小的標準敗者後即判定獲得獲勝經驗；實驗個體被較自己大的 標準勝者擊退則判定獲得落敗經驗；N-W 與 L-N 處理中的無打鬥經驗個體則單 獨在缸中游動，直到其配對對手獲得獲勝或落敗經驗為止。經驗給予完成後，立 即將黑色隔板插回缸中將實驗個體與經驗訓練者隔開，無打鬥經驗個體的打鬥缸 中也同樣插回隔板。若是打鬥雙方皆為無打鬥經驗的處理組(N-N)，則讓兩隻實 驗個體分別於不同打鬥缸中於隔板抽開後自由游動一分鐘後再插回隔板。其後將 所有的實驗個體放回原飼育盒中，並餵食豐年蝦。兩個小時之後隨即將同一配對 的兩個個體放入另一打鬥缸中，分別放於中央隔板的兩邊，一邊一隻，讓牠們於 缸中適應至隔日(約 20 小時)。
五、打鬥測試
第三天早上先給打鬥缸中之實驗個體少量豐年蝦。30 分鐘之後，抽開黑色 不透明隔板，打鬥測試便開始，打鬥中若有一方快速逃離對手且不再反擊，則判 定該個體撤退認輸，表示分出勝負結果，並再多觀察 5 分鐘，以確認勝負關係。
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其後便插回黑色隔板將兩隻實驗個體隔開。若打鬥開始後 1 個小時內無任何一方 表現出認輸的行為，也會插回黑色隔板隔開兩隻魚，並將此打鬥之結果記錄為「沒 有結果」。打鬥測試全程以攝影機錄影。
第四節 打鬥行為定義
打鬥缸中央隔板被抽開當下，兩隻 K. marmoratus 往往會因受到干擾而在缸 中游竄，當個體停止游竄後便會向對手接近，此時被定義為打鬥開始。個體可能 會以張開鰓蓋之鰓蓋展示(gill display)威嚇對手。接著，其中一方可能會以衝撞 或咬等方式攻擊(attack)對手。若在一方接近、鰓蓋展示或攻擊後，其對手便快速 逃竄遠離對方，沒有反擊或威嚇性動作，則判定該個體認輸(retreat)，為落敗個 體，其對手則被判定為獲勝個體。但是，若在一方攻擊後，另一方不撤退而回擊，
則判定進入纏鬥(escalation)。
第五節 統計分析
首先，為瞭解體型與打鬥經驗差異對打鬥結果的影響是否會因打鬥激烈程度 不同而不同，我將 K. marmoratus 的打鬥區分為(1)無纏鬥發生(低打鬥激烈程度) 與(2)有纏鬥發生(高打鬥激烈程度)兩種打鬥類型。我使用多元邏輯迴模式 (multiple logistic regression)，先檢測體型與打鬥經驗對纏鬥發生機率的影響，接 下來分析體型與打鬥經驗對無纏鬥發生與有纏鬥發生之獲勝機率的影響。
接著，從整體來看，體型上與打鬥經驗上的差異如何整合、共同影響 K.
marmoratus 的打鬥結果，我使用多元邏輯迴歸模式(multiple logistic regression)比
較各處理組中體型較大之目標個體的打鬥獲勝機率如何受到體型差異、經驗差異、
以及此二因子之交互作用的影響。若體型差異和打鬥經驗的差異皆會影響獲勝機 率，且兩因子的交互作用變項不影響獲勝機率，則代表體型大小與打鬥經驗兩者 是以累加方式影響個體的獲勝機率。另外，我以二項式檢定法(Binomial test)比較 在各處理組中，目標個體與其對手的獲勝機率有無顯著差異，並以 Cochran-
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Armitage 檢定檢測在不同經驗處理組中，體型較大之個體的獲勝機率是否有隨著 體型差異增加而增加之趨勢，以了解在目標個體的獲勝機率上，體長的優勢與經 驗的劣勢如何消長。
各迴歸模式皆控制目標個體的體長、品系及一個月前的打鬥獲勝/落敗結果。
本實驗使用分析軟體 JMP(v. 9.0.0 SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)進行所有資 料分析。
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