過細胞存活率分析法（MTT assay）以及酵素結合免疫吸附分析法（ELISA assay），
檢視龜鹿二仙膠是否可以緩解脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82）的活性
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胺基酸指紋圖譜分析：Shimadzu LCMS-2020 系統液相層析質譜儀 質譜偵測器：LCMS-2020
前置管柱：LichrospherRP-18 endcapped （5 μm,4.0 x 10 mm,Merck）
分析管柱：IntradaAminoAcid（3μm,3x 50 mm,Imtakt）
第三節 DPPH 抗氧化與清除自由基能力測定
本研究利用 1,1-二苯基-2-吡啶並肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）
自由基清除能力測試檢視龜鹿二仙膠的清除自由基能力與抗氧化力，1,1-二苯基-2-吡啶並肼基（DPPH）是一種穩定的自由基，當其溶於甲醇或乙醇中會呈現藍紫色，
當加入的成分樣品可以和 DPPH 自由基直接反應，則會阻斷 DPPH 自由基的連 鎖反應，當呈現藍紫色的 DPPH 溶液顏色會轉成澄清的黃色，表示加入的成分樣 品具有捕捉 DPPH 自由基的能力，而呈現的顏色愈淡，則表示捕捉 DPPH 自由基 的能力愈強，也就表示此成分樣品的抗氧化能力越好，本實驗以 L-ascorbic acid 作 為標準品。
試驗方法及步驟是首先配置 1.5 mM/mL 的 DPPH （D9132, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA），加入 9mL 甲醇（Methanol） 混和溶液中，再取 100 μL DPPH 以及 1、5、10、20 mg/ml 之龜鹿二仙膠顆粒劑試驗樣品各 100 μL，震盪混合均勻 後 於 室 溫 下 避 光 靜 置 30 分 鐘 ， 以 紫 外 光 / 可 見 光 光 譜 儀 （ Microplate Spectrophotometer, uQuant, Biotek Intruments, Inc., Vermont, USA)測其 517nm 之吸 光值。標準品 L-抗壞血酸（L-Ascorbic acid, L-AA）（A5960, Sigma-Aldrich Co., St.
Louis, MO, USA)進行比較。利用對照組之吸光值的減少百分比，可判斷各試驗樣 品清除 DPPH 自由基能力之強弱。本試驗為三重複。DPPH 自由基清除率（%）＝
（1－《實驗組吸收值／對照組吸收值》）× 100。
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第四節 脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82）活性與 發炎
本研究利用脂多醣（LPS）處理關節滑膜細胞（HIG-82），藉此誘發關節滑膜 細胞（HIG-82）的發炎現象，關節滑膜細胞（HIG-82）使用 F12 基礎培養基進行 培養（Gibco,BRL,Grand Island,NY,USA），同時補充 10 ％ 胎牛血清、1.5 g / L 碳 酸氫鈉、0.11 g / L 丙酮酸鈉、4 mM L-谷氨酰胺、100 U / mL 青黴素和 100 μg/ mL 鏈黴素。將這些細胞在培養基中培養，並在 5％ CO2 保持在 37℃培養箱。用 0.25
％胰蛋白酶（Trypsin）（Gibco BRL,Grand Island,NY）消化關節滑膜細胞（HIG-82）
1 分鐘，直至大部分細胞脫落。
於每個 8 孔腔室載玻片，將所有細胞密度調節至每孔 2×104 個細胞。24 小時 後，添加含有及不含有脂多醣（LPS）（L-2654，Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA）及龜鹿二仙膠顆粒劑於細胞中，藉此誘發關節滑膜細胞（HIG-82）產生細
空白處理組（sham）、龜鹿二仙膠增補組（GEG）、脂多醣（LPS）誘發滑膜細胞損 傷以及脂多醣（LPS）誘發滑膜細胞損傷加龜鹿二仙膠增補組（LPS+GEG）。反應
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後，直接加入 0.5mg/mL 之 MTT solution （M5655, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA），培養 3 小時後去除上清液後，再加入 100 μL/well 二甲基亞風（DMSO）有 機溶劑，震盪 10 分鐘後測量 570 nm 之吸光值。
第六節 酵素結合免疫吸附分析法（ELISA assay）
本研究利用酵素結合免疫吸附分析法（ELISA assay），檢視龜鹿二仙膠是否可 以緩解化療誘發關節滑膜細胞（HIG-82）的炎性細胞激素含量。於 96 孔盤加入含 有適量之炎性細胞激素 TNFα（88-7324；Invitrogen, Carlsbad, CA）與 IL-1β
（88-7013；Invitrogen, Carlsbad, CA）純化單株抗體的碳酸鹽緩衝液（每孔 100 μL/well），靜置於 4℃；隔夜以 0.05 %磷酸鹽緩衝液清洗 3 次沖去未結合之單株抗
（Tetramethylbenzidine; TMB）反應，待室溫避光反應 20-30 分鐘的作用呈色，以 2 % H2SO4 終止反應，測定 450-570 nm 之吸光值。
第七節 化療藥阿黴素誘發小鼠骨質疏鬆
本研究對象為 20 隻十週大的 ICR 小鼠，購自樂斯科生物科技股份有限公司，
實驗期間全程飼養於國立臺灣師範大學公館校區生命科學院動物房，飼養環境控 制室溫為 23-27℃，濕度為 50-60％，飼料及飲用水皆為自取式不限量供應。本實 驗分為四組，分別是：空白處理組（Sham）、每日管餵 100mg/kg 龜鹿二仙膠增補 組 100mg/kg （GEG）、3mg/kg 化療藥物阿黴素誘發小鼠骨質疏鬆組（Dox） 每週 3 次、以及化療藥物阿黴素誘發小鼠骨質疏鬆加龜鹿二仙膠增補組（Dox + GEG）。
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實驗期總共四週，包含第一週適應環境、第二到四週增補龜鹿二仙膠、第四週結 束後灌流犧牲並收集血液與脛骨組織。
第八節 骨骼電腦斷層掃描技術
本研究利用化療藥物阿黴素預先處理，藉此誘發老化小鼠的骨骼疏鬆，然後 使用骨骼電腦斷層掃描技術檢視脛骨的骨小樑與骨密度，藉此評估龜鹿二仙膠是 否可以緩解化療藥物阿黴素所誘發小鼠的骨質疏鬆。本研究委託中央研究院之台 灣 小 鼠 診 所 的 Skyscan 1076 小 動 物 專 用 型 微 小 面 積 電 腦 斷 層 掃 瞄 儀
（High-resolution micro computed tomography，micro-CT system）測量評估空白處 理組、單獨龜鹿二仙膠增補組、化療藥物阿黴素誘發小鼠骨質疏鬆組、以及化療 藥物阿黴素誘發小鼠骨質疏鬆加龜鹿二仙膠增補組四組小鼠的脛骨的骨密度，再 利用計算軟件 Skyscan 和 ImageJ 分析並且比較各組小鼠的骨小樑與骨密度。
第九節 統計與資料分析
實驗以組為單位，每組實驗至少重複三次，所有的實驗數值都是以平均值±平 均值標準誤差（Standard error of the mean, SEM）來表示，統計資料用單因子變異 數分析 （One-way analysis of variance, ANOVA） 以及 S-N-K 多重差距檢定
（Student-Newman-Keuls multiple range test ） 來分析是否有顯著差異，若有顯著 差異則用**p<0.01 以及*p<0.05 表示。
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