國立臺灣師範大學生命科學專業學院 生技醫藥產業碩士學位學程論文
Graduate Program of Biotechnology and Pharmaceutical Industries School of Life Science
National Taiwan Normal University Master's Thesis
龜鹿二仙膠應用在緩解關節與骨骼退化 的補充替代醫療潛力
Complementary and alternative Medical Potential of Guilu Erxian Glue in Relieving Joint and Bone
Degeneration
林涵君 Lin, Han-Chun
指導教授：吳忠信 博士 Advisor:Wu, Chung-Hsin Ph.D.
中華民國 110 年 10 月
i
謝 誌
終於熬過了研究所的這兩年，身為在職學生這兩年真的很艱辛，
一邊忙碌著工作、一邊忙碌著學業，可所謂蠟燭兩頭燒，也因為有許 多人的鼓勵及幫助讓我可以順利度過這兩年，需要感激的人很多，在 此獻上我最大的敬意。
首先要感謝我的指導教授吳忠信教授，感謝老師的鼓勵及提攜 讓我可以順利完成學業，感謝老師這兩年來的悉心教導，讓我在這兩 年當中學習到很多平常接觸不到的實務技能，讓我收穫非凡，更感謝 老師讓我當您的學生，我想我永遠都不會忘了這兩年的時光。
感謝這兩年教導我所有課程的老師們，因為有你們的教導，讓 我受益良多，由衷的感謝你們。
感謝實驗室的學長、姐及同學們，謝謝你們在我學習過程中的 指導及幫助，在你們忙碌的生活中還撥空幫忙，真的令我感到非常的 窩心，因為有你們，讓我在研究生生涯中增添了許多歡樂與回憶，謝 謝你們。
感謝我職場的長官與同事們，因為有你們的幫忙我才能安心的 學習，讓我可以無後顧之憂的往前行，謝謝你們。
從開始進入學校到論文的順利完成，有多少可敬的師長、同學、
朋友及家人給了我的幫助及鼓勵，在這裡請接受我誠摯的謝意，並將 這份成果呈現給你們，謝謝你們。
涵君 鞠躬敬誌 臺師大生命科學學院 2021 年 8 月 9 日
ii
中文摘要
隨著超高齡社會的來臨，高齡長者行動不便以及長期臥病在床等問題，已經 造成醫療資源與健保費用的龐大支出，為緩解長者骨質疏鬆症和退化性關節炎，
民間常以龜鹿二仙膠補強筋骨。本論文主要研究龜鹿二仙膠對於緩解關節與骨骼 退化的替代醫療效果，本研究選用與順天堂科學中藥廠提供的龜鹿二仙膠，龜鹿 二仙膠主要藥材包括枸杞、龜板、人參和鹿角。本研究首先利用 1,1-二苯基-2-吡 啶並肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl；DPPH）自由基清除能力測試檢視龜鹿二 仙膠的抗氧化力；再利用脂多醣（lipopolysaccharide，LPS）處理關節滑膜細胞
（HIG-82），藉此誘發關節滑膜細胞（synoviocyte，HIG-82）的發炎現象，透過細 胞存活率分析法（3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5- diphenyltetrazolium bromide；
MTT assay）以及酵素結合免疫吸附分析法（Enzyme-linked immunosorbent；ELISA assay），檢視龜鹿二仙膠是否可以緩解脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82）
的發炎；此外，本研究利用化療藥物阿黴素預先處理，藉此誘發老化小鼠的骨骼 疏鬆，然後使用骨骼電腦斷層掃描技術檢視脛骨的骨小樑與骨密度，藉此評估龜 鹿二仙膠是否可以緩解化療藥物阿黴素所誘發小鼠的骨質疏鬆。本論文結果顯示 龜鹿二仙膠不但可以顯著增強 DPPH 自由基清除能力，對於脂多醣（LPS）誘發關 節滑膜細胞（HIG-82）的發炎，也有顯著的緩解效果；此外，對於化療藥物阿黴 素（doxorubicin，DOX）所誘發小鼠的骨質疏鬆，連續餵食龜鹿二仙膠四週後，
也有顯著的緩解效果。歸納本研究結果，可以說明龜鹿二仙膠對於緩解關節與骨 骼退化確實具有替代醫療效果。研究者認為適時給予中、高齡長者補充龜鹿二仙 膠，將有助於緩解高齡長者行動不便以及長期臥病在床等問題，大大降低醫療資 源與健保經費的龐大支出。
關鍵字：關節退化、骨質疏鬆、龜鹿二仙膠、替代醫療
iii
Abstract
With the advent of the super-aged society, elders' problems such as mobility problems and long-term bedridden cause huge expenditures on medical resources and health insurance costs. In order to alleviate the osteoporosis and degenerative arthritis of the elders, the people often use the Guilu Erxian Glue （GEG） to relieve the osteoporosis and degenerative arthritis. This thesis mainly studied alternative medical potential of the GEG in relieving joint and bone degeneration. The GEG, provided by Sun Ten Pharmaceutical Co., Ltd., with four main ingredients of ginseng, wolfberry, tortoise plastron and antler from a famous Chinese prescription. In this study. （we used 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） free radical scavenging assay to examine the antioxidant capacity of the GEG; then we used lipopolysaccharide (LPS） to treats HIG-82 joint synovial cells, thereby inducing the inflammation in HIG-82 cells, through the 3-（4,5-Dimethylthiazol- 2-yl ）-2,5-diphenyltetrazolium bromide （MTT） and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） to examine whether the GEG can alleviate chemotherapy-induced HIG-82 joint synovial cell toxicity and Inflammation.
In addition, we used the doxorubicin （DOX） to induce bone loss in aging mice, and then used bone computer tomography to examine the trabecular density of the tibia, thereby assessing whether the GEG can alleviate the osteoporosis in chemotherapy mice.
Our results of this thesis showed that GEG could not only significantly enhance the DPPH free radical scavenging ability, but also had a significant alleviating effect on the toxicity and inflammation of chemotherapy HIG-82 cells. In addition, After feeding GEG for four consecutive weeks, those chemotherapy mice had a significant relief effect in osteoporosis. To summarize our results, the GEG indeed have an alternative medical effect on alleviating joint and bone degeneration. We believe that timely supplementation of GEG to the middle-aged people that should help to alleviate the mobility problems and long-term bedridden problems for elders, and greatly reduce the huge expenditures on medical resources and health insurance costs.
Keywords: Joint Degeneration, Osteoporosis, Guilu Erxian Gum, Alternative Medicine
iv
論 文 目 錄
謝 誌 ... i
中文摘要 ... ii
Abstract ... iii
第一章 緒論 ... 1
第一節 研究背景 ··· 1
第二節 文獻探討 ··· 3
第三節 研究目的 ··· 4
第二章 材料與方法 ... 6
第一節 實驗設計 ··· 6
第二節 龜鹿二仙膠的高效液相層析 3D-HPLC 圖譜分析 ··· 6
第三節 DPPH 抗氧化與清除自由基能力測定 ··· 7
第四節 脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82）活性與發炎8 第五節 細胞存活率分析法（MTT assay） ··· 8
第六節 酵素結合免疫吸附分析法（ELISA assay） ··· 9
第七節 化療藥阿黴素誘發小鼠骨質疏鬆 ··· 9
第八節 骨骼電腦斷層掃描技術 ··· 10
第九節 統計與資料分析 ··· 10
第三章 實驗結果 ... 11
v
第一節 龜鹿二仙膠的高效液相層析 3D-HPLC 圖譜 ··· 11
第二節 龜鹿二仙膠的抗氧化與清除自由基能力 ··· 11
第三節 龜鹿二仙膠緩解脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82） 活性 ··· 12
第四節 龜鹿二仙膠緩解脂多醣（LPS）誘發 HIG-82 關節滑膜細胞 發炎因子 ··· 12
第五節 龜鹿二仙膠緩解化療藥阿黴素誘發小鼠骨質疏鬆 ··· 13
第四章 討 論 ... 14
第一節 龜鹿二仙膠的抗氧化與抗老化作用 ··· 14
第二節 龜鹿二仙膠對於緩解退化性關節炎醫療潛力 ··· 15
第三節 龜鹿二仙膠對於緩解骨質疏鬆的醫療潛力 ··· 15
第五章 結 論 ... 17
參考文獻 ... 18
附錄圖表 ... 28
vi
圖 表 次
圖 1： 全台民眾骨質檢測數據統計分析... 28 圖 2：龜鹿二仙膠的高效液相層析 3D-HPLC 圖譜 ... 30 圖 3：龜鹿二仙膠的 DPPH 清除氧化自由基能力測定 ... 32 圖 4：龜鹿二仙膠緩解脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82）
活性 ... 34 圖 5：龜鹿二仙膠緩解脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82）
發炎因子 ... 36 圖 6：龜鹿二仙膠緩解化療誘發小鼠骨質疏鬆 ... 38 圖 7：龜鹿二仙膠緩解關節與骨骼退化的統整示意圖 ... 40
1
第一章 緒論
第一節 研究背景
隨著超高齡社會的來臨，高齡長者行動不便、失智以及長期臥病在床等問題，
已經造成國家醫療資源與健保經費的龐大支出。如何提昇並且改善高齡長者的生 活品質，應該是目前急迫需要解決的重要議題。根據 2019 年衛生福利部統計結果：
心血管疾病和跌倒事故傷害已經是 65 歲以上高齡長者的重大死亡因素，而骨質疏 鬆、關節退化、失智與高血壓則是困擾 65 歲以上高齡長者的重大疾病。骨質疏鬆 症（osteoporosis）和退化性關節炎（osteoarthritis）都是老人身上所好發的，
皆與老化有關，但骨骼和關節卻是兩種不同的疾病，骨骼和關節的疾病不論在症 狀、病因、診斷及治療上皆有很大的差異。
骨質疏鬆是一種最常見的骨頭代謝性疾病，本身並沒有任何病徵，若感到痛 楚，一般都是由於骨折所致，此類疾病易造成持續性骨密度的減少，而造成骨頭 脆弱，由於骨密度較低，以致骨頭強度較弱，所以容易造成骨折。在美國每年大 約有 2,500 萬人受到骨質疏鬆症的影響，其中有 130 萬人造成骨折。在任何時候，
骨密度是由兩個因素決定，一個是在發育時所達到的最高骨密度，另一個則是成 年後骨質的流失。因此，骨質缺乏症（osteopenia）是由於發育時骨密度不足，或 是成年後骨質流失太多，甚至是兩者原因共同造成的。一般來說，男性的骨密度 比女性高；若是青春期開始的較晚，也會造成最高骨密度的降低；另外若是生長 激素不足、鈣質攝取不夠以及運動量不足，都會造成最高骨密度的降低。根據世 界衛生組織所做的名詞解釋，骨質缺乏症是骨礦物質密度小於最高骨密度 1 至 2.5 個標準差之間；而骨質疏鬆症則是低於 2.5 個標準差。一般來說，研究者認為只要 骨質減少，不管嚴重程度或組織病理特色都稱為骨質缺乏症。國內知名科學中藥 廠–順天堂藥廠與國立臺灣師範大學吳忠信教授實驗室合作與數據統計分析，公佈 了臺灣首份「全臺民眾骨質危機解密地圖」（圖 1）。檢測結果發現：受測者骨質密 度檢測合格的比例僅為 19%，而檢測不合格比例竟然高達 81%。許多研究證實，
除了老化與女性更年期的因素外，空氣污染 PM2.5 懸浮微粒與骨質流失也有著很 高關聯性，骨質不合格的年齡也在逐年下降，顯見骨質危機已經不只發生在高齡
2
長者身上，所以應該要趁早存「骨」本，增加骨密度。本研究發現，高齡長者若 適時補充科學中藥如龜鹿等，應該能夠有效緩解骨質流失以及關節退化等症狀，
這將有助於改善高齡長者因骨質缺乏或疏鬆而導致行動不便的問題。
退化性關節炎是一種可動關節衰竭的症狀表現，由於骨骼之間相互磨擦，而 造成劇烈的疼痛，其主要病狀為關節軟骨退化。根據衛生福利部統計，台灣民眾 膝關節退化盛行率約佔總人口數 15%，約 350 萬人，其中 58 歲以上的年長者盛 行率約佔 20%，70 歲以上老輩盛行率約佔 70%，女性患者又較多於男性。換言之，
每 10 位 70 歲以上的老人，就有 7 位飽受退化性關節炎之苦，更糟的是，關節軟 骨磨損的時間表已經提早到 20、30 歲，根據世界衛生組織 1998 年的報告，到西 元 2025 年，世界上將近有高達 25％的人口，會由於骨關節的問題而導致行動不便，
以 65 歲以上人口罹患比例約佔 74％ （Baird 等人，2003）。退化性關節炎被認為 與年齡增長老化有關， 55 歲以上的中老年人約有 25%都有關節疼痛的情形發生。
退化性關節炎的治療著重於症狀改善，特別是減輕疼痛及惡化的速度，造成關節 軟骨退化的機轉是多重因素所形成，因此也須經由多種治療策略來達到緩解疼痛 或修復關節軟骨等目的。研究指出，退化性關節炎不全是老人家的專利，如平日 過度使用、受傷，或者基因遺傳、慢性病、肥胖或缺乏運動、體質虛弱等，皆會 使關節軟骨磨損時間表提前到 20、30 歲，使人未老關節卻先退化，而女性得退化 性關節炎比例卻比男性高出約 2 倍，停經後婦女患病率增加，明顯高於同齡男性，
患病率存在顯著性別差異（王香蘋，2004）。一般人所說的退化性關節炎多指軟骨 的退化，由於軟骨沒有神經，在尚未嚴重到使硬骨磨損前，不見得會感受到疼痛 感，但退化性關節炎的病灶範圍不侷限於軟骨，其他軟組織的退化，可能才是疼 痛的主因，需要醫師精確的診斷。目前治療骨關節炎的主要方法，包含藥物治療 與復健治療，但真正能達到實質改善者甚少，最新國際骨關節炎研究學會白皮書 揭示，預計到 2025 年，中國骨關節炎患者將高達 4 億之多，但目前仍缺乏有效的 預防和治療措施。
有鑒於臺灣民間常以龜鹿二仙膠相關藥材補筋骨，龜鹿二仙膠主要藥材包括 龜腹板與鹿角，另外加入枸杞、人參熬製而成，對強健骨質密度和減緩關節退化 有其功效。為此，研究者希望透過關節滑膜細胞（HIG-82）以及骨質疏鬆小鼠模
3
式，檢視龜鹿二仙膠對於關節與骨骼退化的替代補充醫學應用潛力。
第二節 文獻探討
龜鹿二仙膠是傳統的中草藥，包含四個主要成分：枸杞（Lycii Fructus）、龜板
（Testudinis Carapax et Plastrum）、人參（Ginseng Radix）以及鹿角（Cornu Cervi）。
目前龜鹿二仙膠已經廣泛應用於治療和預防骨質疏鬆症和骨質疏鬆症，副作用極 低（Tsai 等人，2014）。此外，龜鹿二仙膠對於治療衰老、婦女更年期以及退行性 關節疾病，也具有長效助益的作用（Long 等人，2001）。在體外細胞實驗發現，龜 鹿二仙膠除了可以刺激成骨細胞中 IGF-1 的分泌並緩解破骨細胞的作用（Zhang 等 人，2005）。於動物實驗中發現，龜鹿二仙膠還可以抑制大鼠膝部骨的關節炎，並 且減輕關節痛以及增加肌肉強度（Chou 等人，2018）。龜鹿二仙膠還可以預防和治 療癌症化療後的骨髓抑制生長作用（Tian 等人，2015）。但是尚未完全闡明龜鹿二 仙膠是否可以緩解癌症化療後引起的關節發炎以及骨質疏鬆症。
過去關於龜鹿二仙膠的效用，在臺灣與中國大陸皆有許多的研究報導（尹玉 彪，2011；李文順等人，2005；李楠等人，2013；林嘉輝等人，2017；盧訓叢，
1999）；有些文獻研究報告甚至指出龜鹿二仙膠可以用於抗老化（池秀華、蔡敏鈴，
2016）、治療化療後血球數提昇（洪宋貞等人，2005）、以及緩解更年期不適症狀
（楊丁友、段學忠，2000）等功效。
由於接受化療的癌症患者通常會因藥物引起許多不良副作用，例如體重減 輕、運動障礙、血液循環缺陷、心肌損傷、關節發炎和骨質疏鬆等症狀（Angsutararux 等人，2005；Minotti 等人，2004；Wissing，2015；Feng 等人，2016；McCrary 等人，2019；Lewalle 等人，2019；Hayek 等人，2005；Fan 等人，2017；Fonseca 等人，2016；Zhou 等人，2020）。此外，化療除前面描述症狀外，也會引起嘔吐、
脫髮、貧血和其他症狀，這將使他們難以進行日常生活的活動或保持運動習慣
（Ansari 等人，2017）。在化療藥物中，阿黴素（Doxorubicin，DOX）常用於治療 人類的淋巴癌以及白血病的化療藥物（Hayek 等人，2005；Fan 等人，2017；Fonseca 等人，2016；Zhou 等人，2020）。以阿黴素（DOX）來治療化療也可能會引起不
4
可逆的心臟衰竭、肌肉損傷、關節發炎和骨質疏鬆症等症狀（Angsutararux 等人，
2005；Minotti 等人，2004；Wissing，2015；Feng 等人，2016）。根據報導，氧化 壓力和發炎是阿黴素（DOX）治療化療所引發心臟毒性的主要發病機制（Chen 等 人，2007；Dogantekin 等人，2016；Bagnall-Moreau 等人，2019；Vyas 等人，2014；
Barry 等人，2007；Ewer 等人，2010；Sawyer 等人，2010）。早期研究學者也證 實，以阿黴素（DOX）進行化療處理的小鼠，會表現出心肌氧化壓力、發炎和細 胞凋亡等，而以中藥配方 B307 處理，則可通過抑制氧化壓力、發炎和細胞凋亡，
反而對阿黴素化療處理的小鼠提供了心臟保護作用（Lien 等人，2015）。過去臨床 證據發現，於接受化療的癌症患者中，以阿黴素（DOX）進行長期化療處理，不 僅會導致嚴重的骨質疏鬆和骨關節炎，並且會損害心肌（Rossi 等人，2018；Si 等 人，2020；Kanis 等人，2019；Kotian 等人，2016；Davis 等人，2016；Deeks 等 人，2018）。例如，接受以阿黴素（DOX）進行化療處理的兒童，可能會導致長期 的骨質受損，成年人甚至使身高降低和骨折風險增加（Rossi 等人，2018）。接受 以阿黴素（DOX）來進行的停經前乳腺癌患者，則明顯表現出骨質流失的症狀（Si 等人，2020）。以阿黴素（DOX）進行化療處理的實驗中，將導致正常大鼠的骨頭 密度減少 60％ （Kanis 等人，2019；Kotian 等人，2016），以及顯著減少兔子的骨 小樑體積（Davis 等人，2016）。在體外細胞實驗部分，以阿黴素(DOX)進行化療處 理，可抑制小鼠成骨細胞的分化（Deeks 等人，2018）。骨關節炎通常會導致跌倒 或殘疾的風險，而骨質疏鬆症通常會導致老年人和接受化療的癌症患者發生骨折 以及併發症的高風險（Felson 等人，1988；Rubenstein 等人，2006；Kahwati 等人，
2018）。對於正在接受阿黴素（DOX）進行化療處理的癌症患者，尋找一種可以緩 解化療不良副作用而又不降低化療效果的替代補充醫療是迫在眉睫。
第三節 研究目的
為緩解年長者骨質疏鬆症和退化性關節炎，在臺灣民眾常以龜鹿二仙膠相關 藥材作為筋骨之保健。龜鹿二仙膠主要由枸杞、龜板、人參與鹿角等藥材熬製而 成，對於減緩關節退化和強健骨質密度有其大功效。故此，研究者希望透過關節 滑膜細胞（HIG-82）以及骨質疏鬆小鼠模式，檢視龜鹿二仙膠對於關節與骨骼退
5
化的替代補充醫學應用潛力。
6
第二章 材料與方法
第一節 實驗設計
本研究選用與順天堂科學中藥廠所提供的龜鹿二仙膠產品，主要藥材包括枸 杞、龜板、人參和鹿角。本研究利用 1,1-二苯基-2-吡啶並肼基（DPPH）自由基清 除能力測試檢視龜鹿二仙膠的清除自由基能力與抗氧化力；再利用脂多醣（LPS）
處理關節滑膜細胞（HIG-82），藉此誘發關節滑膜細胞（HIG-82）的發炎現象，透 過細胞存活率分析法（MTT assay）以及酵素結合免疫吸附分析法（ELISA assay），
檢視龜鹿二仙膠是否可以緩解脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82）的活性 與發炎。
此外，本研究利用化療藥物阿黴素（DOX）預先處理，藉此誘發老化小鼠的 骨骼疏鬆，然後使用骨骼電腦斷層掃描技術檢視脛骨的骨小樑與骨密度，藉此評 估龜鹿二仙膠是否可以緩解化療藥物阿黴素所誘發小鼠的骨質疏鬆。
第二節 龜鹿二仙膠的高效液相層析 3D-HPLC 圖譜分析
本論文研究使用的龜鹿二仙膠由順天堂科學中藥廠(Sun Ten Pharmaceutical Co., Ltd)提供，
以高效液相層析儀（3D-HPLC）的全波長掃描功能分析樣品的成分指紋圖譜，設 定標準品最佳吸收波長利用 HPLC 的全波長掃描功能，顯示化學指標活性成份之 含量。龜鹿二仙膠主要由枸杞、龜板、人參、鹿角和澱粉所製成，用於大補元氣、
益氣養神、治視物不清等適應症。本研究傳統經過煎煮製程所產出之成品以龜鹿 二仙膠濃縮顆粒作為比較樣品。本試驗委託禾百安檢驗公司進行龜鹿二仙膠複合 物中各個中藥的化學指標活性成份分析圖譜。
7
胺基酸指紋圖譜分析：Shimadzu LCMS-2020 系統液相層析質譜儀 質譜偵測器：LCMS-2020
前置管柱：LichrospherRP-18 endcapped （5 μm,4.0 x 10 mm,Merck）
分析管柱：IntradaAminoAcid（3μm,3x 50 mm,Imtakt）
第三節 DPPH 抗氧化與清除自由基能力測定
本研究利用 1,1-二苯基-2-吡啶並肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）
自由基清除能力測試檢視龜鹿二仙膠的清除自由基能力與抗氧化力，1,1-二苯基-2- 吡啶並肼基（DPPH）是一種穩定的自由基，當其溶於甲醇或乙醇中會呈現藍紫色，
當加入的成分樣品可以和 DPPH 自由基直接反應，則會阻斷 DPPH 自由基的連 鎖反應，當呈現藍紫色的 DPPH 溶液顏色會轉成澄清的黃色，表示加入的成分樣 品具有捕捉 DPPH 自由基的能力，而呈現的顏色愈淡，則表示捕捉 DPPH 自由基 的能力愈強，也就表示此成分樣品的抗氧化能力越好，本實驗以 L-ascorbic acid 作 為標準品。
試驗方法及步驟是首先配置 1.5 mM/mL 的 DPPH （D9132, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA），加入 9mL 甲醇（Methanol） 混和溶液中，再取 100 μL DPPH 以及 1、5、10、20 mg/ml 之龜鹿二仙膠顆粒劑試驗樣品各 100 μL，震盪混合均勻 後 於 室 溫 下 避 光 靜 置 30 分 鐘 ， 以 紫 外 光 / 可 見 光 光 譜 儀 （ Microplate Spectrophotometer, uQuant, Biotek Intruments, Inc., Vermont, USA)測其 517nm 之吸 光值。標準品 L-抗壞血酸（L-Ascorbic acid, L-AA）（A5960, Sigma-Aldrich Co., St.
Louis, MO, USA)進行比較。利用對照組之吸光值的減少百分比，可判斷各試驗樣 品清除 DPPH 自由基能力之強弱。本試驗為三重複。DPPH 自由基清除率（%）＝
（1－《實驗組吸收值／對照組吸收值》）× 100。
8
第四節 脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82）活性與 發炎
本研究利用脂多醣（LPS）處理關節滑膜細胞（HIG-82），藉此誘發關節滑膜 細胞（HIG-82）的發炎現象，關節滑膜細胞（HIG-82）使用 F12 基礎培養基進行 培養（Gibco,BRL,Grand Island,NY,USA），同時補充 10 ％ 胎牛血清、1.5 g / L 碳 酸氫鈉、0.11 g / L 丙酮酸鈉、4 mM L-谷氨酰胺、100 U / mL 青黴素和 100 μg/ mL 鏈黴素。將這些細胞在培養基中培養，並在 5％ CO2 保持在 37℃培養箱。用 0.25
％胰蛋白酶（Trypsin）（Gibco BRL,Grand Island,NY）消化關節滑膜細胞（HIG-82）
1 分鐘，直至大部分細胞脫落。
於每個 8 孔腔室載玻片，將所有細胞密度調節至每孔 2×104 個細胞。24 小時 後，添加含有及不含有脂多醣（LPS）（L-2654，Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA）及龜鹿二仙膠顆粒劑於細胞中，藉此誘發關節滑膜細胞（HIG-82）產生細 胞發炎反應，並且檢視龜鹿二仙膠是否可以緩解脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞
（HIG-82）的發炎。
第五節 細胞存活率分析法（MTT assay）
本研究透過細胞存活率分析法（MTT assay），檢視龜鹿二仙膠是否可以緩解 脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82）的細胞活性。本實驗組別分為四組：
空白處理組（sham）、龜鹿二仙膠增補組（GEG）、脂多醣（LPS）誘發滑膜細胞損 傷以及脂多醣（LPS）誘發滑膜細胞損傷加龜鹿二仙膠增補組（LPS+GEG）。反應 24 小時。
MTT 是一種偵測活細胞粒線體的染色法，其主要是以細胞粒線體中的琥珀酸脫 氫酶作用將 MTT 之四唑環打斷，產生氧化還原反應形成藍紫色結晶，再藉由二甲 基亞風（DMSO）有機溶劑將紫色結晶溶解形成紫色液體，利用生成顏色的深淺代 表細胞數目的多寡，以測定關節滑膜細胞（HIG-82）之細胞粒線體增生能力。將 1×105 cells/mL 之關節滑膜細胞（HIG-82），再加入上述實驗組別共同培養 24 小時
9
後，直接加入 0.5mg/mL 之 MTT solution （M5655, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA），培養 3 小時後去除上清液後，再加入 100 μL/well 二甲基亞風（DMSO）有 機溶劑，震盪 10 分鐘後測量 570 nm 之吸光值。
第六節 酵素結合免疫吸附分析法（ELISA assay）
本研究利用酵素結合免疫吸附分析法（ELISA assay），檢視龜鹿二仙膠是否可 以緩解化療誘發關節滑膜細胞（HIG-82）的炎性細胞激素含量。於 96 孔盤加入含 有適量之炎性細胞激素 TNFα（88-7324；Invitrogen, Carlsbad, CA）與 IL-1β
（88-7013；Invitrogen, Carlsbad, CA）純化單株抗體的碳酸鹽緩衝液（每孔 100 μL/well），靜置於 4℃；隔夜以 0.05 %磷酸鹽緩衝液清洗 3 次沖去未結合之單株抗 體，加入阻斷液（每孔200μL/well）以減少非特異性的結合，室溫反應 60 分鐘；
以磷酸鹽緩衝液洗 3 次後加入細胞上清液樣品及抗體標準品 TNF-α 及 IL-1β（每 孔100 μL/well），室溫反應 2 小時；以磷酸鹽緩衝液清洗 4 次，再加入連結生物素 的抗細胞激素 TNF-α 及 IL-1 二級抗體（每孔 100 μL/well），室溫反應 1 小時；以 磷酸鹽緩衝液清洗 5 次後，加入過氧化酵素（每孔 100 μL/well），室溫反應 30 分 鐘 ； 以 磷 酸 鹽 緩 衝 液 清 洗 6 次 ， 再 與 加 入 每 孔 100 μL/well 受 質
（Tetramethylbenzidine; TMB）反應，待室溫避光反應 20-30 分鐘的作用呈色，以 2 % H2SO4 終止反應，測定 450-570 nm 之吸光值。
第七節 化療藥阿黴素誘發小鼠骨質疏鬆
本研究對象為 20 隻十週大的 ICR 小鼠，購自樂斯科生物科技股份有限公司，
實驗期間全程飼養於國立臺灣師範大學公館校區生命科學院動物房，飼養環境控 制室溫為 23-27℃，濕度為 50-60％，飼料及飲用水皆為自取式不限量供應。本實 驗分為四組，分別是：空白處理組（Sham）、每日管餵 100mg/kg 龜鹿二仙膠增補 組 100mg/kg （GEG）、3mg/kg 化療藥物阿黴素誘發小鼠骨質疏鬆組（Dox） 每週 3 次、以及化療藥物阿黴素誘發小鼠骨質疏鬆加龜鹿二仙膠增補組（Dox + GEG）。
10
實驗期總共四週，包含第一週適應環境、第二到四週增補龜鹿二仙膠、第四週結 束後灌流犧牲並收集血液與脛骨組織。
第八節 骨骼電腦斷層掃描技術
本研究利用化療藥物阿黴素預先處理，藉此誘發老化小鼠的骨骼疏鬆，然後 使用骨骼電腦斷層掃描技術檢視脛骨的骨小樑與骨密度，藉此評估龜鹿二仙膠是 否可以緩解化療藥物阿黴素所誘發小鼠的骨質疏鬆。本研究委託中央研究院之台 灣 小 鼠 診 所 的 Skyscan 1076 小 動 物 專 用 型 微 小 面 積 電 腦 斷 層 掃 瞄 儀
（High-resolution micro computed tomography，micro-CT system）測量評估空白處 理組、單獨龜鹿二仙膠增補組、化療藥物阿黴素誘發小鼠骨質疏鬆組、以及化療 藥物阿黴素誘發小鼠骨質疏鬆加龜鹿二仙膠增補組四組小鼠的脛骨的骨密度，再 利用計算軟件 Skyscan 和 ImageJ 分析並且比較各組小鼠的骨小樑與骨密度。
第九節 統計與資料分析
實驗以組為單位，每組實驗至少重複三次，所有的實驗數值都是以平均值±平 均值標準誤差（Standard error of the mean, SEM）來表示，統計資料用單因子變異 數分析 （One-way analysis of variance, ANOVA） 以及 S-N-K 多重差距檢定
（Student-Newman-Keuls multiple range test ） 來分析是否有顯著差異，若有顯著 差異則用**p<0.01 以及*p<0.05 表示。
11
第三章 實驗結果
第一節 龜鹿二仙膠的高效液相層析 3D-HPLC 圖譜
龜鹿二仙膠是傳統中藥，包含四個主要成分：龜板（Testudinis Carapax et Plastrum）、鹿角（Cornu Cervi）、人參（Ginseng Radix）、枸杞（Lycii Fructus）。圖 2 利用高效液相層析 3D-HPLC（200-400 nm，0-65 min）分析龜鹿二仙膠的中藥指 紋圖譜，圖 2A 的中藥指紋圖譜顯示人參的生物活性標記物為人參皂苷 Rg1
（Ginsenoside Rg1 波峰出現在 27.1 分鐘）、人參皂苷 Re（Ginsenoside Re 波峰出現 在 28.1 分鐘）、人參皂甙 Ro（Ginsenoside Ro 波峰出現在 40.2 分鐘）、人參皂甙 Rf（Ginsenoside Rf 波峰出現在 41.6 分鐘）、人參皂甙 Rb1（Ginsenoside Rb1 波峰 出現在 43.2 分鐘）、人參皂甙 Rc（Ginsenoside Rc 波峰出現在 44.2 分鐘）、人參皂 甙 Rb2（Ginsenoside Rb2 波峰出現在 45.2 分鐘）和人參皂甙 Rd（GinsenosideRd 波峰出現在 47.6 分鐘）; 圖 2B 的中藥指紋圖譜顯示其餘的生物活性標記物為甜菜 鹼（Betaine 波峰出現在 3.5 分鐘）、尿嘧啶（Uracil 波峰出現在 5.7 分鐘）、黃嘌呤
（Xanthine 波峰出現在 10.4 分鐘）、尿苷（Uridine 波峰出現在 11.8 分鐘）和鳥苷
（Guanosine 波峰出現在 23.2 分鐘）。
第二節 龜鹿二仙膠的抗氧化與清除自由基能力
圖 3A 測量了各種濃度下龜鹿二仙膠的自由基清除活性，圖 3B 統計結果顯示 龜鹿二仙膠在濃度為 5-20 mg / mL 時，具有 DPPH 抗氧化自由基能力很明顯。 此 外，與 1 mg / mL 龜鹿二仙膠處理的抗氧化自由基能力（10.1 %）相比，5~20 mg / mL 龜鹿二仙膠處理具有顯著的抗氧化自由基能力（55.2-72.7 % ，p <0.01）。而 5 和 10 mg / mL 龜鹿二仙膠處理的抗氧化自由基能力相似；然而，在 20 mg / mL 龜 鹿二仙膠處理觀察到更明顯的抗氧化自由基能力（72.7 % ，p <0.01）。
12
第三節 龜鹿二仙膠緩解脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞
（HIG-82）活性
圖 4A 利用 MTT 方法對順天堂龜鹿二仙膠之抗細胞活性測定，顯示關節滑膜 細胞（HIG-82）加入不同濃度的龜鹿二仙膠處理培養 48 小時後，5~50 mg / mL 龜 鹿二仙膠處理組的關節滑膜細胞（HIG-82）存活率顯著大於空白處理組（p <0.01）
以及 1 mg / mL 龜鹿二仙膠處理組（p <0.05）。空白處理組的關節滑膜細胞（HIG-82）
存活率當作 100 %，1~50 mg / mL 龜鹿二仙膠處理組產生更高的關節滑膜細胞
（HIG-82）存活率（115~131 %）。統計結果顯示：HIG-82 關節滑膜的細胞存活率 會隨著龜鹿二仙膠處理濃度增加而顯著增加。
圖 4B 顯示當關節滑膜細胞（HIG-82）用脂多醣（LPS）誘發細胞發炎活性後，
關節滑膜細胞（HIG-82）的存活率由 100 % 顯著降低至約 56 %（p <0.01），此時 再用 1~50 mg / mL 龜鹿二仙膠處理，關節滑膜細胞（HIG-82）的存活率由 56 % 顯 著增加至 61~99 %。比較用脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82）發炎後，
5~50 mg / mL 龜鹿二仙膠處理組的關節滑膜細胞（HIG-82）存活率顯著高於空白 處理組（p <0.01）以及 1 mg / mL 龜鹿二仙膠處理組（p <0.01）。因此，龜鹿二仙 膠具有緩解脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82）發炎活性。
第四節 龜鹿二仙膠緩解脂多醣（LPS）誘發 HIG-82 關節滑 膜細胞發炎因子
圖 5 結果顯示龜鹿二仙膠可以有效緩解脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞
（HIG-82）的發炎作用。圖 5A 利用 1µg/mL 脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞
（HIG-82）損傷，可觀察到細胞的 TNF-α發炎指數較空白處理組顯著增加
（p<0.01），當添加龜鹿二仙膠於關節滑膜細胞（HIG-82）培養 72 小時後，可以發 現關節滑膜細胞（HIG-82）TNF-α發炎指數顯著降低（p<0.01）。圖 5B 利用 1µg/mL 脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82）損傷，可觀察到細胞的 IL-1β發炎指
13
數較空白處理組顯著增加（p<0.01），當添加龜鹿二仙膠，於 72 小時檢測關節滑膜 細胞（HIG-82），可以發現肝臟巨噬細胞 IL-1β發炎指數顯著降低（p<0.01）。這 結果顯示龜鹿二仙膠確實具有緩解關節滑膜細胞（HIG-82）發炎的功效。
第五節 龜鹿二仙膠緩解化療藥阿黴素誘發小鼠骨質疏鬆
圖 6 結果說明龜鹿二仙膠可以有效緩解化療藥阿黴素（DOX）誘發小鼠骨質 疏鬆。研究者利用化療藥物（DOX）阿黴素預先處理，藉此誘發老化小鼠的骨骼 疏鬆，然後使用骨骼電腦斷層掃描技術檢視脛骨的骨小樑與骨密度，藉此評估龜 鹿二仙膠是否可以緩解化療藥物阿黴素（DOX）所誘發小鼠的骨質疏鬆。
從圖 6A 的骨骼電腦斷層掃瞄圖，研究者觀察到空白處理組與單獨龜鹿二仙膠 增補組小鼠的脛骨和小梁骨密度相當高，但化療藥物阿黴素（DOX）誘發小鼠骨 質疏鬆組小鼠的脛骨和小梁骨密度則明顯變差，反觀化療藥物阿黴素誘發小鼠骨 質疏鬆加龜鹿二仙膠增補組小鼠的脛骨和小梁骨密度則明顯緩解。
圖 6B 統計結果顯示空白處理組與單獨龜鹿二仙膠增補組小鼠的脛骨和小梁骨 密度並沒有顯著差異（p＞0.05），而化療藥物阿黴素（DOX）誘發小鼠骨質疏鬆組 小鼠的脛骨和小梁骨密度則較空白處理組與單獨龜鹿二仙膠增補組小鼠顯著降低
（p<0.01），相較於化療藥物阿黴素（DOX）誘發小鼠骨質疏鬆加龜鹿二仙膠增補 組小鼠，脛骨和小梁骨密度則明顯增加（p<0.01）。惟化療藥物阿黴素誘發小鼠骨 質疏鬆加龜鹿二仙膠增補組小鼠與空白處理組與單獨龜鹿二仙膠增補組小鼠的脛 骨和小梁骨密度比較，仍然無法恢復到正常的骨密度水平（p<0.01）。
本實驗結果證明龜鹿二仙膠增補顯著提高阿黴素（DOX）化療小鼠的骨質密 度，這結果說明龜鹿二仙膠增補具有維持骨質密度的功效，降低化療藥物（DOX）
對骨骼的傷害。
14
第四章 討 論
第一節 龜鹿二仙膠的抗氧化與抗老化作用
龜鹿二仙膠為中醫傳統名方，明代（1569 年）王三才所著的《醫便》就有詳 細記載，該方由枸杞子、龜板、人參、鹿角膠組成。《古今名醫方論》提及「龜得 天地之陰氣最厚，善通任脈，其腹甲為膠，能滋陰潛陽、補血。鹿得天地之陽氣 最全，善通督脈，其角為膠，能補腎陽、生精血。人參大補元氣而生津。枸杞子 益精生血」。《醫方考•虛損勞瘵門》提及「人參善於固氣，而枸杞子善於滋陰」。古 代中草藥著作《本草綱目》提及，鹿角膠可以促進骨骼生長並預防骨質疏鬆症，
從而滋養陽氣。龜板皮能增強心臟，腎臟和血液，從而滋養陰（Long 等人，2001）。 在現代運用中，龜鹿二仙膠成為延緩衰老並被廣泛應用於慢性疲勞綜合症、神經 系統疾病、骨骼系統疾病、血液系統疾病及生殖系統多種疾病。許多研究指出龜 鹿二仙膠可以緩解疲勞，並且增加紅血球數目和血紅蛋白的量。龜鹿二仙膠的人 參能增強免疫力和造血功能，減輕疲勞，增強心臟功能。龜鹿二仙膠的枸杞具有 營養滋補作用，可以改善視力，促進肝細胞再生，增強造血功能，增強免疫力（Tsai 等人，2014）。
本論文研究中，研究者測量了各種濃度下龜鹿二仙膠的自由基清除活性，結 果發現龜鹿二仙膠處理具有顯著的抗氧化自由基能力，而且隨著龜鹿二仙膠處理 濃度增加，龜鹿二仙膠處理的抗氧化自由基能力則變得更加明顯（圖 3）。自由基 主要在線粒體中產生，它們會增加氧化壓力，並且活性氧（ROS）過量產生。中 醫過去認為腎虛是衰老的根本原因，龜鹿二仙膠具有溫腎益精、補氣養血的作用，
適用於虛損衰老。此外，龜鹿二仙膠可減少脂質過氧化物對自由基的損傷，可用 於治療衰老虛損症狀療效明顯。化療藥物阿黴素是一種有效的抗癌藥，可抑制細 胞增殖，但可誘導氧化壓力，最終導致細胞死亡，主要是通過細胞凋亡（Cao 等人，
2013）。本論文研究結果證實龜鹿二仙膠確實可以顯著增強 DPPH 自由基清除能力。
15
第二節 龜鹿二仙膠對於緩解退化性關節炎醫療潛力
退化性關節炎是關節疾病的最普遍形式，通常會導致老年人跌倒，行動不便 或需要醫療與照護人員輔助（Felson 等人，1988；Rubenstein 等人，2006）。中醫 在治療退化性關節炎主要是以「補腎」來治療，古書記載「腎主骨生髓」。常用的 處方有龜鹿二仙膠等。龜鹿二仙膠主要藥材包含枸杞、龜板、人參和鹿角四種成 分，可使腰膝關節與周遭肌群較為有力，進而減輕痠痛、僵硬等症狀。過去實驗 使用從兔子膝關節內襯軟組織分離的關節滑膜細胞（HIG-82）進行體外實驗，以 評估各種關節炎的病理生理學（Georgescu 等人，1988）。
研究者的實驗結果顯示，關節滑膜細胞（HIG-82）經化療藥物阿黴素處理後，
細胞存活率顯著降低至約 56 %，同時給予龜鹿二仙膠處理後，關節滑膜細胞
（HIG-82）存活率顯著提高至 61~99 % （圖 4）。本實驗結果顯示阿黴素化療處理 會引起滑膜細胞損傷，甚至導致關節發炎；而給予龜鹿二仙膠處理則會降低阿黴 素誘導的細胞毒性並促進 HIG-82 關節滑膜的細胞增殖。退化性關節炎除了使用龜 鹿二仙膠改善關節僵硬、無力及痠痛等症狀，並減緩關節的損傷，平常也要多注 重保養，減少上下樓梯、爬山等動作，活動時可戴上護膝。退化性關節炎藉由藥 物、飲食以及生活上的保養，可讓關節更有力，改善患者的活動力，達到改善生 活品質的目的，整個生活也更有活力！
第三節 龜鹿二仙膠對於緩解骨質疏鬆的醫療潛力
國內知名科學中藥廠–順天堂捐贈一部「天上聖母號」醫療公益巡迴車，近三 年來跑遍全臺各縣、市，為民眾進行數十場次骨質密度檢測，透過國立臺灣師範 大學吳忠信教授與順天堂中藥廠的合作以及數據統計分析，公佈了臺灣首份「全 台民眾骨質危機解密地圖」（圖 1）。檢測結果發現，2820 位民眾當中，骨質健康 的比例僅為 19%，骨質密度檢測不合格比例高達 81%。以性別差異分析，女性骨 質密度檢測不合格比例佔全體受檢女性的 84%，50 歲以上女性佔比更攀升至 92%；以年齡差異分析，70 歲以上長者骨質密度檢測不合格比例更是佔全體受檢 70 歲以上長者的 93%；以地域差異分析，北部和中部民眾骨質密度檢測不合格比
16
例為 82%，南部民眾則為 74%。許多研究證實，除了老化與女性更年期的因素外，
空氣污染 PM2.5 懸浮微粒與骨質流失也有著很高關聯性。民眾骨質不合格的年齡 也在逐年下降中，顯見骨質危機已經不只發生在銀髮族身上。
研究發現，高齡長者適時補充科學中藥如龜鹿等，應該能夠有效緩解關節退 化以及骨質流失等症狀，這將有助於改善高齡長者行動不便的問題。國內統計結 果發現，50 歲以上的女性中，每 3 位就有 1 位是骨質疏鬆症患者。骨鬆的人往往 只有下腰背痛、駝背、身高縮水、體重過輕等情形，因症狀不明顯，很容易被忽 略，直到出現骨折才發現。人體骨量一旦流失，就很難恢復到骨組織的正常結構，
因此，早期發現和治療是控制骨質疏鬆症的關鍵。除了停經婦女、50 歲以上的民 眾之外，曾經骨折、長期抽菸喝酒的人也可以考慮接受骨質密度檢測，監測骨密 度。由於骨折的高風險和隨之而來的併發症，骨質疏鬆症已成為普遍的文明病
（Kahwati 等人，2018）。此外，接受癌症化療的兒童可能會抑制身高增長以及骨 折風險 （Rossi 等人，2018），接受癌症化療的癌症患者會有明顯的骨質和礦物質 的流失（Si 等人，2020），阿黴素化療處理可導致正常大鼠的減少 60%的骨質形成 並減少兔子的骨小樑體積、密度和骨頭厚度 （Kanis 等人，2019；Kotian 等人，
2016；Davis 等人，2016）。
本論文研究結果顯示，用阿黴素化療處理小鼠的脛骨小樑密度明顯降低，而 用龜鹿二仙膠治療後，則脛骨小樑密度明顯增加（圖 6）。研究者認為阿黴素化療 會引起小鼠骨質疏鬆，但是龜鹿二仙膠治療後可以緩解這種骨質疏鬆。盡管有研 究指出龜鹿二仙膠可以促進成骨細胞增殖，而且明顯抑制骨髓細胞向破骨細胞的 分化，迄今為止龜鹿二仙膠治療緩解骨質疏鬆和骨關節炎的機制仍不甚清楚。因 此，有必要進行進一步的臨床試驗，以驗證龜鹿二仙膠治療對化療患者的益處。
17
第五章 結 論
本論文主要研究龜鹿二仙膠對於緩解關節與骨骼退化的替代醫療效果，本研 究選用與順天堂科學中藥廠提供的龜鹿二仙膠，利用 DPPH 自由基清除能力測試 檢視龜鹿二仙膠的抗氧化力；再利用化療藥物阿黴素（Doxorubicin, DOX）處理關 節滑膜細胞（HIG-82），藉此誘發關節滑膜細胞的退化與發炎現象，透過細胞存活 率分析法 MTT 分析以及 ELISA 分析，檢視龜鹿二仙膠是否可以緩解化療誘發關 節滑膜細胞（HIG-82）的毒性與發炎；本研究利用化療藥物阿黴素預先處理，藉 此誘發老化小鼠的骨骼疏鬆，然後使用骨骼電腦斷層掃描技術檢視脛骨的骨小樑 與骨密度，藉此評估龜鹿二仙膠是否可以緩解化療藥物阿黴素所誘發小鼠的骨質 疏鬆。本論文結果如圖 7 所顯示，龜鹿二仙膠不但可以顯著增強 DPPH 自由基清 除能力，對於化療藥物阿黴素誘發關節滑膜細胞（HIG-82）的毒性與發炎，也有 顯著的緩解效果；此外，對於化療藥物阿黴素所誘發小鼠的骨質疏鬆，連續餵食 龜鹿二仙膠四週後也有顯著的緩解效果。歸納本研究結果，可以說明龜鹿二仙膠 對於緩解關節與骨骼退化確實具有替代醫療效果。
研究者認為適時給予中高齡長者補充龜鹿二仙膠，將有助於緩解高齡長者行 動不便以及長期臥病在床等問題，大大降低醫療資源與健保經費的龐大支出。
18
參考文獻
（一） 中文參考文獻
尹玉彪（2011）龜鹿二仙膠及其拆方對大鼠軟骨細胞增殖與基質合成的影響。福 建中醫藥大學碩士論文。
王香蘋（2004） 1999 年台灣地區中老年人健康狀況的探討。弘光學報，43 期，
95-109 頁。
台灣必安研究所（2015）龜鹿二仙膠改善骨質疏鬆症之研究。新醫藥週刊第 2564 期。
池秀華、蔡敏鈴（2016）龜鹿二仙膠之簡介與臨床應用。藥學雜誌 126（32） :54-58。
李文順、李楠、余丹丹（2005）龜鹿二仙膠湯治療膝骨性關節炎的臨床研究。福 建中醫學院學報 15（6）。
李雅文（2017）龜鹿二仙膠於足球運動員膝關節炎之影響。義守大學化學工程學 系暨生物技術與化學工程研究所學位論文。
李楠、杜江、黄遠鹏（2013）龜鹿二仙膠及其拆方對 SD 大鼠膝關節炎的影響。中 華中醫學雜誌 28（6）:1677-1680。
周彥瑢（2019）高效能超音波萃取龜鹿二仙膠於骨關節炎的療效研究。輔仁大學 應用科學與工程研究所博士論文。
林嘉輝、陳炳藝、李楠（2017）龜鹿二仙膠治療骨關節炎的研究概況。中華中醫 藥雜誌 2017（12）。
洪宋貞、林毅、司徒紅林（2005）龜鹿二仙丹加味治療乳腺癌化療後骨髓抑制的 臨床研究。新中醫 37（1）。
國家發展委員會（2020）中華民國 2020 至 2070 年人口推估報告。
19
楊丁友、段學忠（2000）龜鹿二仙膠加味治療絕經後婦女不穩定型心絞痛的臨床 究。安徽中醫學院學報 19（4）。
黎榮興（2006）中藥龜鹿二仙膠對停經後婦女骨質密度的影響。中原大學醫學工 程研究所碩士論文。
黎榮興、許忠源、孫盛義（2007）評估雙能量 X 光骨質密度儀及定量超音波骨質 密度儀對服用龜鹿二仙膠後停經婦女骨質密度的影響。中華放射線技術學雜 誌 31（2） 147-153。
盧訓叢（1999）龜鹿二仙膠方義與應用述要。湖北中醫學院學報 1（4）。
（二） 英文參考文獻
Angsutararux P, Luanpitpong S, Issaragrisil S. Chemotherapy-Induced Cardiotoxicity:
Overview of the Roles of Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev.
2015;2015:795602. doi: 10.1155/2015/795602. Epub 2015 Sep 29. PMID:
26491536; PMCID: PMC4602327.
Ansari L, Shiehzadeh F, Taherzadeh Z, Nikoofal-Sahlabadi S, Momtazi-Borojeni AA, Sahebkar A, Eslami S. The most prevalent side effects of pegylated liposomal doxorubicin monotherapy in women with metastatic breast cancer: a systematic review of clinical trials. Cancer Gene Ther. 2017 May;24（5）:189-193. doi:
10.1038/cgt.2017.9. Epub 2017 Apr 14. PMID: 28409561.
Bagnall-Moreau C, Chaudhry S, Salas-Ramirez K, Ahles T, Hubbard K.
Chemotherapy-Induced Cognitive Impairment Is Associated with Increased Inflammation and Oxidative Damage in the Hippocampus. Mol Neurobiol. 2019 Oct;56（10）:7159-7172. doi: 10.1007/s12035-019-1589-z. Epub 2019 Apr 15.
PMID: 30989632; PMCID: PMC6728167.
Baird CL et al. （2003） Self-care women with osteoarthritis living at different levels of independence. Health Care for Woman International 24: 617-634.
20
Barry E, Alvarez JA, Scully RE, Miller TL, Lipshultz SE. Anthracycline-induced cardiotoxicity: course, pathophysiology, prevention and management. Expert Opin Pharmacother. 2007 Jun;8（8）:1039-58. doi: 10.1517/14656566.8.8.1039.
PMID: 17516870.
Brown JC, Huedo-Medina TB, Pescatello LS, Pescatello SM, Ferrer RA, Johnson BT.
Efficacy of exercise interventions in modulating cancer-related fatigue among adult cancer survivors: a meta-analysis. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2011 Jan;20（1）:123-33. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-10-0988. Epub 2010 Nov 4.
PMID: 21051654.
Cao B, Li M, Zha W, Zhao Q, Gu R, Liu L, Shi J, Zhou J, Zhou F, Wu X, Wu Z, Wang G, Aa J. Metabolomic approach to evaluating adriamycin pharmacodynamics and resistance in breast cancer cells. Metabolomics. 2013;9（5）:960-973. doi:
10.1007/s11306-013-0517-x. Epub 2013 Mar 20. PMID: 24039617; PMCID:
PMC3769585.
Chen Y et al. （2020） Chinese herbal medicine Guilu erxian jiao attenuates bone marrow suppression following chemotherapy in patients with advanced lung cancer. Translational Metabolic Syndrome Research 3: 25-28.
Chen Y, Jungsuwadee P, Vore M, Butterfield DA, St Clair DK. Collateral damage in cancer chemotherapy: oxidative stress in nontargeted tissues. Mol Interv. 2007 Jun;7（3）:147-56. doi: 10.1124/mi.7.3.6. PMID: 17609521.
Chou YJ et al. （2018） The potent anti-inflammatory effect of Guilu Erxian Glue extracts remedy joint pain and ameliorate the progression of osteoarthritis in mice.
J Orthop Surg Res. 13: 259.
Chou YJ, Chuu JJ, Peng YJ, Cheng YH, Chang CH, Chang CM, Liu HW. The potent anti-inflammatory effect of Guilu Erxian Glue extracts remedy joint pain and ameliorate the progression of osteoarthritis in mice. J Orthop Surg Res. 2018 Oct 19;13（1）:259. doi: 10.1186/s13018-018-0967-y. PMID: 30340603; PMCID:
PMC6194592.
21
Chuang TY, Lien CY, Tsai YC, Lin KF, Hsu CH, Wu WJ, Su LY, Lu CW, Wu CH. Oral treatment with the Chinese herbal supplements B307 enhances muscle endurance of ICR mice after exhaustive swimming via suppressing fatigue, oxidative stress, and inflammation. Food Sci Nutr. 2020 May 19;8（7）:3682-3691. doi:
10.1002/fsn3.1652. PMID: 32724631; PMCID: PMC7382157.
Davis S, Martyn-St James M, Sanderson J, Stevens J, Goka E, Rawdin A, Sadler S, Wong R, Campbell F, Stevenson M, Strong M, Selby P, Gittoes N. A systematic review and economic evaluation of bisphosphonates for the prevention of fragility fractures. Health Technol Assess. 2016 Oct;20（78）:1-406. doi: 10.3310/hta20780.
Erratum in: Health Technol Assess. 2018 Mar;20（78）:407-424. PMID: 27801641;
PMCID: PMC5107884.
Deeks ED. Denosumab: A Review in Postmenopausal Osteoporosis. Drugs Aging. 2018 Feb;35（2）:163-173. doi: 10.1007/s40266-018-0525-7. Erratum in: Drugs Aging.
2018 Mar 9;: PMID: 29435849.
Dogantekin A, Gurel A, Ustundag B, Ilhan S, Elkiran ET. Oxidative stress and
antioxidant parameters in neutropenic patients secondary to chemotherapy. Pak J Med Sci. 2016 Mar-Apr;32（2）:309-13. doi: 10.12669/pjms.322.9200. PMID:
27182229; PMCID: PMC4859012.
E. R. Hayek, E. Speakman, and E. Rehmus, “Acute doxorubicin cardiotoxicity,” New England Journal of Medicine, vol. 352, no. 23, pp. 2456-2457, 2005.View at:
Publisher Site | Google Scholar
Ewer MS, Ewer SM. Cardiotoxicity of anticancer treatments: what the cardiologist needs to know. Nat Rev Cardiol. 2010 Oct;7（10）:564-75. doi:
10.1038/nrcardio.2010.121. PMID: 20842180.
Fan C, Georgiou KR, Morris HA, McKinnon RA, Keefe DMK, Howe PR, Xian CJ.
Combination breast cancer chemotherapy with doxorubicin and
cyclophosphamide damages bone and bone marrow in a female rat model. Breast Cancer Res Treat. 2017 Aug;165（1）:41-51. doi: 10.1007/s10549-017-4308-3.
Epub 2017 May 26. PMID: 28550626.
22
Felson DT. Epidemiology of hip and knee osteoarthritis. Epidemiol Rev. 1988;10:1-28.
doi: 10.1093/oxfordjournals.epirev.a036019. PMID: 3066625.
Feng L, Huang Q, Huang Z, Li H, Qi X, Wang Y, Liu Z, Liu X, Lu L. Optimized Animal Model of Cyclophosphamide-induced Bone Marrow Suppression. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2016 Nov;119（5）:428-435. doi: 10.1111/bcpt.12600.
Epub 2016 May 27. PMID: 27061017.
Fonseca H, Carvalho A, Esteves J, Esteves VI, Moreira-Gonçalves D, Duarte JA.
Effects of doxorubicin administration on bone strength and quality in sedentary and physically active Wistar rats. Osteoporos Int. 2016 Dec;27（12）:3465-3475.
doi: 10.1007/s00198-016-3672-x. Epub 2016 Jun 18. PMID: 27318466.
Galantino ML, Desai K, Greene L, Demichele A, Stricker CT, Mao JJ. Impact of yoga on functional outcomes in breast cancer survivors with aromatase
inhibitor-associated arthralgias. Integr Cancer Ther. 2012 Dec;11（4）:313-20. doi:
10.1177/1534735411413270. Epub 2011 Jul 6. PMID: 21733988.
Georgescu HI, Mendelow D, Evans CH. HIG-82: an established cell line from rabbit periarticular soft tissue, which retains the "activatable" phenotype. In Vitro Cell Dev Biol. 1988 Oct;24（10）:1015-22. doi: 10.1007/BF02620875. PMID:
2846503.
Hasinoff BB, Schnabl KL, Marusak RA, Patel D, Huebner E. Dexrazoxane
（ICRF-187） protects cardiac myocytes against doxorubicin by preventing damage to mitochondria. Cardiovasc Toxicol. 2003;3（2）:89-99. doi:
10.1385/ct:3:2:89. PMID: 14501028.
Hsu CH, Lin CL, Wang SE, Sheu SJ, Chien CT, Wu CH. Oral treatment with herbal formula B401 alleviates penile toxicity in aging mice with manganism. Clin Interv Aging. 2015 May 28;10:907-18. doi: 10.2147/CIA.S82026. PMID:
26064043; PMCID: PMC4455845.
Hsu CH, Wang SE, Lin CL, Hsiao CJ, Sheu SJ, Wu CH. Neuroprotective Effects of the Herbal Formula B401 in Both Cell and Mouse Models of Alzheimer's Disease.
Evid Based Complement Alternat Med. 2016;2016:1939052. doi:
23
10.1155/2016/1939052. Epub 2016 Sep 28. PMID: 27761145; PMCID:
PMC5059538.
Kahwati LC, Weber RP, Pan H, Gourlay M, LeBlanc E, Coker-Schwimmer M, Viswanathan M. Vitamin D, Calcium, or Combined Supplementation for the Primary Prevention of Fractures in Community-Dwelling Adults: Evidence
Report and Systematic Review for the US Preventive Services Task Force. JAMA.
2018 Apr 17;319（15）:1600-1612. doi: 10.1001/jama.2017.21640. PMID:
29677308.
Kanis JA, Cooper C, Rizzoli R, Reginster JY; Scientific Advisory Board of the
European Society for Clinical and Economic Aspects of Osteoporosis （ESCEO）
and the Committees of Scientific Advisors and National Societies of the International Osteoporosis Foundation （IOF）. European guidance for the diagnosis and management of osteoporosis in postmenopausal women.
Osteoporos Int. 2019 Jan;30（1）:3-44. doi: 10.1007/s00198-018-4704-5. Epub 2018 Oct 15. Erratum in: Osteoporos Int. 2020 Jan;31（1）:209. Erratum in:
Osteoporos Int. 2020 Apr;31（4）:801. PMID: 30324412; PMCID: PMC7026233.
Kilgour RD, Vigano A, Trutschnigg B, Hornby L, Lucar E, Bacon SL, Morais JA.
Cancer-related fatigue: the impact of skeletal muscle mass and strength in patients with advanced cancer. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2010 Dec;1（2）:177-185.
doi: 10.1007/s13539-010-0016-0. Epub 2010 Dec 17. PMID: 21475694; PMCID:
PMC3060645.
Kotian P, Boloor A, Sreenivasan S. Study of Adverse Effect Profile of Parenteral Zoledronic Acid in Female Patients with Osteoporosis. J Clin Diagn Res. 2016 Jan;10（1）:OC04-6. doi: 10.7860/JCDR/2016/17061.7021. Epub 2016 Jan 1.
PMID: 26894105; PMCID: PMC4740633.
Lebrecht D, Geist A, Ketelsen UP, Haberstroh J, Setzer B, Walker UA. Dexrazoxane prevents doxorubicin-induced long-term cardiotoxicity and protects myocardial mitochondria from genetic and functional lesions in rats. Br J Pharmacol. 2007
24
Jul;151（6）:771-8. doi: 10.1038/sj.bjp.0707294. Epub 2007 May 21. PMID:
17519947; PMCID: PMC2014121.
Lewalle A, Land S, Merken JJ, Raafs A, Sepúlveda P, Heymans S, Kleinjans J, Niederer SA. Balance of Active, Passive, and Anatomical Cardiac Properties in
Doxorubicin-Induced Heart Failure. Biophys J. 2019 Dec 17;117（12）:2337-2348.
doi: 10.1016/j.bpj.2019.07.033. Epub 2019 Jul 29. PMID: 31447110; PMCID:
PMC6990149.
Lien CY, Chuang TY, Hsu CH, Lin CL, Wang SE, Sheu SJ, Chien CT, Wu CH. Oral treatment with the herbal formula B307 alleviates cardiac toxicity in
doxorubicin-treated mice via suppressing oxidative stress, inflammation, and apoptosis. Onco Targets Ther. 2015 May 26;8:1193-210. doi:
10.2147/OTT.S82936. PMID: 26060405; PMCID: PMC4454207.
Lien CY, Lu CW, Hsu CH, Chuang TY, Su LY, Wu WJ, Jheng YS, Lee MC, Wu CH.
Chinese Veterinary Medicine B307 Promotes Cardiac Performance and Skeletal Muscle Contraction via Enhancing Intracellular Calcium Levels and Neural Electrical Activity in Animal and Cell Models. Evid Based Complement Alternat Med. 2020 Oct 28;2020:9064824. doi: 10.1155/2020/9064824. PMID: 33178329;
PMCID: PMC7644306.
Long L, Soeken K, Ernst E. Herbal medicines for the treatment of osteoarthritis: a systematic review. Rheumatology （Oxford）. 2001 Jul;40（7）:779-93. doi:
10.1093/rheumatology/40.7.779. PMID: 11477283.
Marques VA, Ferreira-Junior JB, Lemos TV, Moraes RF, Junior JRS, Alves RR, Silva MS, Freitas-Junior R, Vieira CA. Effects of Chemotherapy Treatment on Muscle Strength, Quality of Life, Fatigue, and Anxiety in Women with Breast Cancer. Int J Environ Res Public Health. 2020 Oct 6;17（19）:7289. doi:
10.3390/ijerph17197289. PMID: 33036182; PMCID: PMC7579368.
McCrary JM, Goldstein D, Wyld D, Henderson R, Lewis CR, Park SB. Mobility in survivors with chemotherapy-induced peripheral neuropathy and utility of the
25
6-min walk test. J Cancer Surviv. 2019 Aug;13（4）:495-502. doi:
10.1007/s11764-019-00769-7. Epub 2019 Jun 6. PMID: 31172429.
Minotti G, Menna P, Salvatorelli E, Cairo G, Gianni L. Anthracyclines: molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and
cardiotoxicity. Pharmacol Rev. 2004 Jun;56（2）:185-229. doi: 10.1124/pr.56.2.6.
PMID: 15169927.
Pisoschi AM, Pop A, Cimpeanu C, Predoi G. Antioxidant Capacity Determination in Plants and Plant-Derived Products: A Review. Oxid Med Cell Longev.
2016;2016:9130976. doi: 10.1155/2016/9130976. Epub 2016 Dec 4. PMID:
28044094; PMCID: PMC5164913.
Rossi LMM, Copes RM, Dal Osto LC, Flores C, Comim FV, Premaor MO. Factors related with osteoporosis treatment in postmenopausal women. Medicine
（Baltimore）. 2018 Jul;97（28）:e11524. doi: 10.1097/MD.0000000000011524.
PMID: 29995822; PMCID: PMC6076108.
Rubenstein LZ. Falls in older people: epidemiology, risk factors and strategies for prevention. Age Ageing. 2006 Sep;35 Suppl 2:ii37-ii41. doi:
10.1093/ageing/afl084. PMID: 16926202.
Ruiz JR, Sui X, Lobelo F, Morrow JR Jr, Jackson AW, Sjöström M, Blair SN.
Association between muscular strength and mortality in men: prospective cohort study. BMJ. 2008 Jul 1;337（7661）:a439. doi: 10.1136/bmj.a439. PMID:
18595904; PMCID: PMC2453303.
Sawyer DB. Is there more for us to learn from oncology?: Examining the implications of anthracycline effects on the young heart. Circulation. 2010 Feb 9;121
（5）:623-5. doi: 10.1161/CIR.0b013e3181d2c996. Epub 2010 Jan 25. PMID:
20100976.
Schmidt ME, Wiskemann J, Krakowski-Roosen H, Knicker AJ, Habermann N,
Schneeweiss A, Ulrich CM, Steindorf K. Progressive resistance versus relaxation training for breast cancer patients during adjuvant chemotherapy: design and rationale of a randomized controlled trial （BEATE study）. Contemp Clin Trials.
26
2013 Jan;34（1）:117-25. doi: 10.1016/j.cct.2012.10.006. Epub 2012 Oct 25.
PMID: 23103936.
Si Y, Yao Y, Ma Y, Guo Y, Yin H. Effectiveness and safety of Guilu Erxian Glue （a traditional Chinese medicinal product） for the treatment of postmenopausal osteoporosis: A protocol for systematic review and meta-analysis. Medicine
（Baltimore）. 2020 Jul 17;99（29）:e20773. doi: 10.1097/MD.0000000000020773.
PMID: 32702821; PMCID: PMC7373594.
Tian H et al. （2015） Effects of traditional Chinese medicine on chemotherapy-induced myelosuppression and febrile neutropenia in breast cancer patients. Evid Based Compl Alter Med, 2015: ID 736197.
Tian H, Qin W, Wu W, Guo P, Lu Y, Liu P, Liu Q, Su F. Effects of Traditional Chinese Medicine on Chemotherapy-Induced Myelosuppression and Febrile Neutropenia in Breast Cancer Patients. Evid Based Complement Alternat Med.
2015;2015:736197. doi: 10.1155/2015/736197. Epub 2015 Aug 12. PMID:
26347793; PMCID: PMC4549530.
Tsai CC et al. （2014） Effect of the Herbal Drug Guilu Erxian Jiao on Muscle Strength, Articular Pain, and Disability in Elderly Men with Knee Osteoarthritis.
Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine Volume 2014, Article ID 297458.
Tsai CC, Chou YY, Chen YM, Tang YJ, Ho HC, Chen DY. Effect of the herbal drug guilu erxian jiao on muscle strength, articular pain, and disability in elderly men with knee osteoarthritis. Evid Based Complement Alternat Med.
2014;2014:297458. doi: 10.1155/2014/297458. Epub 2014 Sep 16. PMID:
25309612; PMCID: PMC4182023.
Vyas D, Laput G, Vyas AK. Chemotherapy-enhanced inflammation may lead to the failure of therapy and metastasis. Onco Targets Ther. 2014 Jun 12;7:1015-23. doi:
10.2147/OTT.S60114. PMID: 24959088; PMCID: PMC4061164.
Wang PH et al. （2012） Clinical Evaluation of Guilu Erxian Jiao in Treating Perimenopausal Syndrome. J Chin Med 23（2）: 165-181.
27
Wissing MD. Chemotherapy- and irradiation-induced bone loss in adults with solid tumors. Curr Osteoporos Rep. 2015 Jun;13（3）:140-5. doi:
10.1007/s11914-015-0266-z. PMID: 25712619; PMCID: PMC4417126.
Wu Z （2014） Clinical application of guilu erxian glue. Clin J Chinese Med 6 （17）:
2.
Zhang Y, Mao C, Yan W, Zheng X. Application of cell engineering of herbal Medicine treating bone resorption of osteoclasts. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc.
2005;2005:4958-61. doi: 10.1109/IEMBS.2005.1615587. PMID: 17281357.
Zhou L, Kuai F, Shi Q, Yang H. Doxorubicin restrains osteogenesis and promotes osteoclastogenesis in vitro. Am J Transl Res. 2020 Sep 15;12（9）:5640-5654.
PMID: 33042445; PMCID: PMC7540161.
28
附錄圖表
圖 1： 全台民眾骨質檢測數據統計分析
29
圖 1： 全台民眾骨質檢測數據統計分析
國內知名科學中藥廠–順天堂為民眾進行數十場骨質密度檢測，透過國立臺灣師範大學吳忠信教授與順天堂中藥廠的合作以及數據統計 分析，公佈了臺灣首份「全台民眾骨質危機解密地圖」，檢測結果發現，受測者骨質密度檢測合格的比例僅為 19%，而檢測不合格比例 竟然高達 81%。
30
圖 2：龜鹿二仙膠的高效液相層析 3D-HPLC 圖譜
31
圖 2：龜鹿二仙膠的高效液相層析 3D-HPLC 圖譜
龜鹿二仙膠主要包含四種中藥材：枸杞（Lycii Fructus）、龜板（Testudinis Carapax et Plastrum）、人參（Ginseng Radix）以及鹿角（Cornu Cervi）。利用高效液相層析 3D-HPLC（200-400 nm，0-65 min）分析龜鹿二仙膠的中藥指紋圖譜，箭頭指示為龜鹿二仙膠的活性指標物 質。
32
圖 3：龜鹿二仙膠的 DPPH 清除氧化自由基能力測定
DP PH
33
圖 3：龜鹿二仙膠的 DPPH 清除氧化自由基能力測定
（圖 A） 利用 DPPH 方法對順天堂龜鹿二仙膠進行抗氧化能力測定，結果顯示龜鹿二仙膠具有清除自由基的抗氧化功效。（圖 B）統 計結果顯示龜鹿二仙膠隨著測試濃度增加，清除自由基的抗氧化效率顯著增加。各組數值以平均值±平均值標準誤差（Standard error of the mean, SEM）表示，且用單因子變異數分析（One-way analysis of variance, ANOVA）以及 S-N-K 多重差距檢定 （Student-Newman-Keuls multiple range test ）來分析是否有顯著誤差，若有顯著誤差則用**p<0.01 以及*p<0.05 表示。
34
圖 4：龜鹿二仙膠緩解脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82）活性
脂多醣處理組
35
圖 4：龜鹿二仙膠緩解脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82）活性
（圖 A） 利用 MTT 方法對順天堂龜鹿二仙膠之抗細胞活性測定，統計結果顯示：HIG-82 關節滑膜的細胞存活率會隨著龜鹿二仙膠處 理濃度增加而顯著增加。（圖 B） 而添加脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82）損傷，雖然細胞存活率明顯減少，也會隨著龜鹿 二仙膠處理濃度增加而顯著增加。這結果說明龜鹿二仙膠確實具有保護肝臟巨噬細胞損傷的功效。各組數值以平均值±平均值標準誤差 表示，且用單因子變異數分析以及 S-N-K 多重差距檢定來分析是否有顯著誤差，若有顯著誤差則用**p<0.01 以及*p<0.05 表示。
36
圖 5：龜鹿二仙膠緩解化療誘發關節滑膜細胞（HIG-82）發炎
37
圖 5：龜鹿二仙膠緩解脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82）發炎因子
（圖 A） 利用酵素結合免疫吸附（ELISA）分析，可觀察到添加脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82）發炎的 TNF-α發炎指數 較空白處理組顯著增加（p<0.01），當添加龜鹿二仙膠，於 72 小時檢測關節滑膜細胞（HIG-82），可以發現 TNF-α 發炎指數顯著降低
（p<0.01）。（圖 B） 添加脂多醣（LPS）誘發關節滑膜細胞（HIG-82）發炎的 IL-1β 發炎指數較空白處理組顯著增加（p<0.01），當添 加龜鹿二仙膠，於 72 小時檢測關節滑膜細胞（HIG-82），可以發現 IL-1β 發炎指數顯著降低（p<0.01）。各組數值以平均值±平均值標準 誤差表示，且用單因子變異數分析以及 S-N-K 多重差距檢定來分析是否有顯著誤差，若有顯著誤差則用**p<0.01 以及*p<0.05 表示。
38
圖 6：龜鹿二仙膠緩解化療誘發小鼠骨質疏鬆
39
圖 6：龜鹿二仙膠緩解化療誘發小鼠骨質疏鬆
（圖 A） 利用骨骼電腦斷層掃描技術分析，可觀察到添加化療藥阿黴素誘發小鼠的脛骨組織骨密度較空白處理組疏鬆，而添加龜鹿二 仙膠處理後，骨密度則變得較緊實。尺標刻度= 100μm 。（圖 B）統計結果顯示只有化療藥阿黴素處理組的骨密度均較空白處理組和只 有餵食龜鹿二仙膠處理組顯著降低（p<0.01），而化療藥阿黴素處理加上餵食龜鹿二仙膠處理組則較只有化療藥阿黴素處理組顯著增加
（p<0.05）。這結果說明龜鹿二仙膠確實具有緩解化療誘發小鼠骨質疏鬆的功效。各組數值以平均值±平均值標準誤差表示，且用單因子 變異數分析以及 S-N-K 多重差距檢定來分析是否有顯著誤差，若有顯著誤差則用**p<0.01 以及*p<0.05 表示。
40
圖 7：龜鹿二仙膠緩解關節與骨骼退化的統整示意圖
41
圖 7：龜鹿二仙膠緩解關節與骨骼退化的統整示意圖
綜合本論文研究結果，可以說明龜鹿二仙膠具有較佳的自由基清除能力以及抗氧化力。對於脂多醣（LPS）誘導產生關節滑膜細胞
（HIG-82）活性與發炎反應也有緩解作用。此外。對於化療藥阿黴素誘導產生小鼠骨質疏鬆，也有顯著的緩解效果。
