3.1 實驗材料
3.1.1 矽膠管
實驗所用的矽膠管為 Helix Medical Silicone Tube，內徑 1.5 mm，外徑1.96 mm 購自 Helix Medical Inc(USA)。
3.1.2 中藥方劑
六味地黃丸( 錢乙．小兒藥證直訣 ) 人類一日量 4 公克 每 12 克中含有： 熟地黃 8.0 g
山茱萸 4.0 g 山葯 4.0 g 澤瀉 3.0 g 牡丹皮 3.0 g 茯苓 3.0 g
以上生葯製成浸膏 7.2 g（生葯與浸膏比例 25.0：7.2＝3.5：1）澱粉 4.8 g 效能：滋陰補腎
適應症：肝腎不足、腰痛足痠、頭暈目胘、消渴、舌燥喉痛、足跟作痛 依公式換算，以 0.2 ㎏的大鼠為例，該大鼠六味地黃丸一日量為
4 g×[0.2 ㎏ 70 ㎏] ×35＝0.4 g
3.1.3Toluidine blue
Toluidine blue 的化學式為 C15H16SCl+Zn Cl2[164]。由於 Toluidine blue 對神 經組織中蛋白質的碳氧基有高度的親和力，被廣泛地用來當作神經髓鞘的染色
劑[165-169]。以 Toluidine blue 染色時，髓鞘被染成深藍色，而髓鞘環內之軸突則
呈現較淡的顏色。本實驗使用之 Toluidine blue 購自 Sigma Chemical CO.
(USA)。
3.2 方法
3.2.1 實驗動物模式 3.2.1.1 實驗動物分組
Sprague－Dawley 大白鼠 30 隻，210 g±40 g，均為雌性，週齡六至八週。
30 隻實驗動物經手術後，以體重排序，按序分成三組，每組 10 隻，分別為對 照組、四君子湯組及六味地黃丸組，皆餵食標準食物八星期。
(1)中葯組
實驗組除標準食物外分別餵食四君子湯或六味地黃丸，方法是把中葯粉溶 解於 3.c.c.蒸餾水中，手術後二星期開始以食道管灌餵大鼠上述溶液，連續餵 食六星期。
(2)對照組
老鼠坐骨神經在經截斷及矽膠管縫合後，除肌肉及皮膚縫合外不做任何處 置，只餵食標準食物。
3.2.1.2 麻醉
手術前須先將大鼠麻醉，麻醉劑為 pentobarbital (0.2 ml 100 g)（Somnotol 公司出品，美國製造）腹腔麻醉。大鼠於稱重後施打適合劑量的麻醉劑，麻醉 後，以大鼠股骨頭的位置為中心，將大鼠右側臀部及大腿的毛剃掉，剃毛區以 碘酒消毒。手術中，以乙醚輔助麻醉。
3.2.1.3 坐骨神經神經管接合術
大鼠麻醉剃毛消毒後，於右下肢後外側循股骨縱行切開皮膚，鈍性分離股 二頭肌與筋膜，游離出長約 2.5 cm 的坐骨神經，在距梨狀肌下緣 8 mm 處，用 手術刀整齊切斷神經幹。取各組大鼠相對應之神經管，以 9-0 nylon 縫線(Mani , Japan)先自膠管外側穿入,然後穿過斷端之神經外膜，最後自矽膠管內側穿出，
並以少許張力將神經幹斷端帶入矽膠管，內並在矽膠管的兩端內各 1 mm 處打 結固定（圖 3.1）兩斷端神經固定後，實際神經間距為 10 mm。神經兩斷端縫 入矽膠管兩側後，以 4-0 catgut (Unik Taiwan)縫合肌肉，最後以 3-0 silk (Unik Taiwan)將皮膚縫合。術後將大鼠置回籠子，照光維持體溫，待動物甦醒。最 後將抗生素(pamoxicillin)加入 RO 水中(1 g 1 ml)讓大鼠飲用三日，預防感染。
圖 3.1：神經斷端與矽膠管縫合的步驟。(1)9-0 nylon 縫線自矽膠管之外端穿 入，(2)然後穿過斷端之神經外膜，(3)最後自矽膠管之內側穿出，神經藉 著少許張力帶入矽膠管內，並在矽膠管內的外側打結固定。
3.2.1.4 動物飼養環境
實驗動物飼養環境為空調房間，一個鐵籠飼養一隻大鼠，溫度維持 22±3
℃，相對濕度 55±5%，半日照環境，自由飲水及餵食標準大鼠實驗飼料(福壽 公司，台灣)。
3.2.2 觀察重點
3.2.2.1 觀察實驗大鼠外表之變化
八星期內，在上述飼養環境中飼養大鼠，並觀察大鼠的飲食、大小便、傷 口、毛色、行動、重量變化、足趾足跟等。
3.2.2.2 觀察神經再生情形
於術後八星期，將大鼠麻醉，剃毛，碘酒消毒後，於大鼠右臀沿股骨方向 剪開皮膚，鈍性分離肌肉與筋膜，游離出坐骨神經與神經管。肉眼觀察神經管 內是否有再生的神經組織，並將神經管取下。若神經管內有再生神經組織，去 除兩端殘餘的近遠端神經，再把矽膠管中 10 mm 長的再生神經，小心推擠出 矽膠管，去除兩端各 3.5 mm，留下中段 3 mm 長，保存於固定液中(2.5% glutara ldehyde ，4% paraformaldehyde ，1×PBS)，做切片染色顯微觀察（圖 3.2）。
圖 3.2：選取組織切片用的再生神經組織
3.2.3 神經固定、脫水、包埋、切片及染色
將再生神經組織以 2.5% GA (Glutaraldehyde)，4% PA (Paraformaldehyde) buffer 溶液固定約 2 日，隨即將神經以 1% OSO4 後固定約二小時，之後以 50~100%酒精脫水，再以 spur 樹脂包埋，並將含再生神經組織之樹脂置入 60-70
℃烤箱中約 16 小時，待樹脂硬化。隨後將包埋之再生神經組織做切片(4-5 µm 厚)，以 Toluidine blue 染色。當組織切片染色後，髓鞘與 Schwann cell 會明顯 增色。
3.2.4 組織學定性分析
將組織切片置於 25~400 倍之光學微鏡下觀察(Olympus IX70, Olympus Optical Co., Ltd, Japan)，再生神經組織切片的觀察重點如下：(1)再生神經整體 結構是否完整，神經外膜，圍神經膜以及神經內膜是否已長成，(2)在神經內 膜中是否有髓鞘化軸突生成，或者大部分組織中仍只有纖維母細胞或 Schwann cell 而已，(3)血管於再生神經組織中是否已形成。
10 mm
3.5 mm 3 mm 3.5 mm
選取部分