壹、試驗動物與飼養環境
一、試驗動物模式
1957 年日本學者 Kondo 等人，以日本小鼠發展出來 KK 品系小鼠，
可作為第2 型糖尿病研究之試驗動物模式（Kondo et al., 1957）。此種 雄性KK 品系小鼠具有葡萄糖不耐症（glucose intolerance）、高胰島素 血症（hyperinsulinemia）、與胰島素阻抗性的表徵和遺傳特性。雄性 KK 小鼠不只會因老化，亦可由高熱量飲食誘導後，表現出與第 2 型糖 尿病人相似的症狀（Ikeda, 1994; Lubec et al., 1997）。因此，雄性 KK 小鼠是作為探討第2 型糖尿病之胰島素阻抗性與機制的良好動物模式。
依據健康食品之「調節血糖功能評估方法」修正草案的糖尿病試驗動 物模式中，KK 品系小鼠屬於遺傳性自發高血糖動物模式，試驗時並 無特別界定血糖變異之空腹血糖值標準，若是由化學藥物所誘導的糖 尿病試驗動物模式，則其空腹血糖值需達或超過13 mM (230 +10 mg /dl) 時，方才視為有糖尿病(行政院衛生署，2006)。
本研究由樂斯科生物科技股份有限公司代理進口（主要購自美國 The Jackson Laboratory）36 隻八週大的雄性 KK/HIJ 小鼠，起始體重約 30 公克，先以 Formulab Diet 5008（其成分接近 The Jackson Laboratory 所使用之餵養飼料 LabDiet 5K52）使其適應 2 週，再以高脂高熱量的 飲食餵食使其誘發出第2 型糖尿病症狀，再經由空腹血糖高於 140 mg/dl 之標準作為判定中度血糖異常，隨後進行分組飼養。
本研究計畫之動物試驗內容已獲中國醫藥大學實驗動物委員會之 核准。
二、飼料與墊料
墊料為Beta Chip 硬木墊料（美國 Northeaston Products Corp 製造）
每週更換清理一次。高脂飼料是MILab Diet（美國 PMI 牌實驗動物飼 料），飼料購得後存放於 4℃冰箱，待餵食時再酌量取用，並詳細紀錄 攝食情況。皆由雍力貿易股份有限公司代理購得。
三、飼料成分
a） 高脂高熱量（含 35.5% Lard）之飼料成分如表 4-1 所示，並計算其 卡路里與三大營養素之比例，如表4-2。
表4-1、高脂高熱量飼料成分
Physiological fuel value（Kcal/gm）
Biotin（ppm） Calrles Provided by
Protein
四、飼養環境條件
飼養於環境溫度22±2℃，濕度 60±5%，光暗循環各 12 小時，並給 予自由進食飼料與去離子水。
五、生物素的補充
本 研 究 所 使 用 的 生 物 素 是 白 色 粉 末 狀 結 晶 的 d-Biotin（ Tanabe seipaku co., LTD, Japan），待需要時依不同劑量溶於生理食鹽水備用。
生物素的補充方式是先將生物素溶於 0.9%的生理食鹽水（saline）
後，再以腹腔注射的方式給予到小鼠體內，每週六天，為期四週。Control 組是給予等體積且不含生物素的0.9%生理食鹽水當作對照組。
貳、試驗設計與分組
首先將小鼠誘發出第2 型糖尿病，隨後分成三組，分別補充不同劑 量的生物素，分別為（1）生理水組：為 0 mg/kg of body weight（control）；
（2）3 mg 生物素補充組：為 3 mg/kg of body weight（3 mg biotin）；（3）
6 mg 生物素補充組：為 6 mg/kg of body weight（6 mg biotin）。分別在 進入試驗前及第二週、第四週進行空腹血糖測試、腹腔葡萄糖耐受性試 驗（intraperitoneal glucose tolerence test, ipGTT）和血清胰島素濃度測定。
並於第四週補充期結束後犧牲小鼠，在犧牲前每組再分成兩組處理方
（mg/kg of body weight/day）
Insulin（-） Insulin（+）
將上述各組小鼠犧牲後分離取出骨骼肌（skeletal muscle），進 行測定骨骼肌中總IRS-1、IRS-2；IRS-1、IRS-2 酪氨酸磷酸化型式 及和其相連結的PI 3-kinase 蛋白質表現量。
參、試驗流程
insulin（-） insulin（+） insulin（-） insulin（+） insulin（-） insulin（+）
（6 隻） （6 隻） （6 隻） （6 隻） （6 隻） （6 隻）
Fig 4-1. The experiment flow chart of this study.
肆、測試項目
一、空腹血糖值之測定
測定前一晚先將小鼠的飼料移走，使其禁食 12-14 小時之後，經由 斷尾法自尾巴採集血液，利用standard glucose oxidas 原理（Reddi et al., 1988）以血糖計 Glucometer EliteR測試血糖值（Bayer, Japan），此時所測 定的血糖濃度即為空腹血糖值。
二、腹腔葡萄糖耐受性試驗
進行葡萄糖耐受性試驗前，先將小鼠的飼料移走，使其禁食 12-14 小時後，經斷尾法由尾巴採集血液，測量血漿葡萄糖濃度，再經由腹腔 注射給予葡萄糖溶液（1.0 g glucose/kg of body weight），之後在第0、30、
60、90 及 120 分鐘測定血漿葡萄糖濃度。
三、血清胰島素濃度
小鼠禁食 12-14 小時之後，經由尾巴靜脈採集血液，在 4℃下離心 3000 rpm 10 分鐘，取上清液即血清的部分，注入新的微量離心管中約 200μl，並置於-80℃下儲存，待要分析時再取出，胰島素是以胰島素檢 測用試劑套組（Roche Elecsys 1010/2010/Modular Analytics E170）依據 electrochemiluminescence immunoassay（ECLIA）的方法測定。
四、胰島素阻抗性
胰島素阻抗性（insulin resistance, IR）是依據下列方程式（Matthews et al., 1985）來做評估
Insulin resistance（HOMA IR）
＝［Fasting insulin（μIU/l）× fasting glucose（mmol/l）］/22.5
五、骨骼肌中總 IRS-1、IRS-2；IRS-1、IRS-2 酪胺酸磷酸化型 式及與其相連結的 PI 3-kinase 之蛋白質表現量
A、骨骼肌肉組織樣本製備
小鼠犧牲後，自小鼠取出骨骼肌，以液態氮快速冷凍，隨後儲存於 -70℃。分析時秤取 0.5g 的肌肉切細，並加入 4 ml buffer A（250 mM sucrose, 20 mM hepes, 1 mM EDTA），使用均質機 Polytron PT20 以最快 速進行30 秒，然後在 4℃下離心 15000 g ，20min。取出上清液並加入 KCl 使其濃度達 0.8 mM，再以 200000 g 超高速離心一個半小時，之後 再將沉澱物（pellet）回溶於 100μl buffer B（20 mM hepes, 1 mM EDTA）， 並進行蛋白質濃度測定後，儲存於-70°C，直到分析。
B、蛋白質濃度測定
以 BSA（Bovine serum albumin）為蛋白質標準品並製作標準品濃度 曲線，並以Bio-Rad 公司的 Dye reagent 染劑反應，再由 O.D 590 nm 的 吸光值，求算出骨骼肌樣品的蛋白質濃度。
（1）蛋白質標準品檢量線製作：
以BSA（Bovine serum albumin）為蛋白質標準品，依照表 4-4 製作 蛋白質標準品樣品。
再將配製好的蛋白質標準品樣品用分光光度計（Hitachi U-2000 Spectrophotometer），在 O.D 590nm 測定各蛋白質標準品吸光值之平均 值。以蛋白質標準品吸光值與濃度畫出標準品檢量線，並求出趨勢線方 程式及R 值。（R 值必須在 0.99 以上之準確度，否則需重新製作檢量線）。
表4-4、蛋白質標準品樣品製備 濃度（μg/ml）
組成
0 2 4 6 8 10
1 mg/ml BSA（μl） 0 2 4 6 8 10 DDW（μl） 800 798 796 794 792 790 Dye reagent 染劑（μl） 200
總體積皆為1000μl（1 ml）
（2）樣品蛋白質定量：
蛋白質樣品稀釋20 倍後取 5μl 稀釋後的骨骼肌樣品與 795μl 的二 次水混合，再加入200μl 的 Dye reagent 染劑（Bio-Rad, Protein Assay, US），混勻5 分鐘後將樣品放入分光光度計，在 O.D 590 nm 測定其吸光 值。將樣品吸光值平均值代入趨勢線方程式，則可以算出稀釋後樣品之 蛋白質濃度，最後再乘上稀釋倍數並換算單位後，即可求得實際蛋白質 樣品濃度。
C、骨骼肌中 IRS-1、IRS-2 總蛋白質表現量
分別取等總蛋白質量的本試驗 6 組骨骼肌樣品，以免疫墨點法，進 行IRS-1、IRS-2 總蛋白質表現量的測定。免疫墨點法詳細步驟於後面介 紹。
D、骨骼肌中 IRS-1、IRS-2 酪胺酸磷酸化型式的蛋白質表現測定
將 6 組的骨骼肌樣品，在相同的總蛋白質含量下，以
anti-phosphotyrosine（4G10）的一抗進行免疫沉澱法，將所有酪胺酸磷 酸化型式的蛋白質沉澱後，再利用IRS-1、IRS-2 的抗體進行免疫墨點法 以測量骨骼肌中 IRS-1、IRS-2 酪胺酸磷酸化型式的蛋白質表現量。
E、骨骼肌中與 IRS-1、IRS-2 相連結的 PI 3-kinase 蛋白質表現測定
以TBS 調整 6 組骨骼肌樣品，使其內約含等量的 total IRS-1 或 IRS-2 蛋白質經由免疫墨點法作確認，再分別以IRS-1、IRS-2 抗體經由免疫沉 澱法將所有IRS-1、IRS-2 的蛋白質沉澱後，再利用 PI 3-kinase 的抗體進 行免疫墨點法以測量骨骼肌中與IRS-1、IRS-2 相連結的 PI 3-kinase 蛋白 質表現量。
F、免疫沉澱法
將計算好濃度的骨骼肌樣品加入 TBS 使其總體積為 500μl 後，再加 入適當的一抗（IRS-1, IRS-2, 4G10），於 4℃下反應 over night。之後再 加入已處理過的Protein A beads Slurry（Upstate Biotechnology）於 4℃反 應2 小時。之後以 10000 g ，30 sec 離心，去除上清液，再以 1000 μl TBS 洗3 次後，加入 30 μl 的 2 ×Laemmli sample buffer（含 100 mM DTT），
於100℃下煮 10 分鐘，使 Protein A 和抗體所接的蛋白質分離。之後再 以10000 g 進行 5 分鐘離心，取上清液，再進行免疫墨點法。
G、免疫墨點法
（1）膠體電泳（SDS-PAGE）
先配製8% SDS-PAGE 的下層膠（Separation gel）和上層膠（Stacking gel），將配置好的下層膠注入鑄膠台後，加入異丙酮去除氣泡並壓平下 層膠之上緣，等約 30 分鐘待膠體凝固，倒掉異丙酮，用二次水沖洗後，
將上層膠注入後插入樣本槽梳子到未凝固的膠體中，避免氣泡出現於 wells 下緣。等待約 30 分鐘上層膠凝固後拔出樣品槽梳子，並以二次水 小心沖洗樣本槽內避免雜質殘留。將鑄好的膠放入電泳槽中，加入 1x Running Buffer 500 ml。Running Buffer 需注滿內槽且外槽之量需蓋過最 下面導電用之白金線，樣本槽也需注滿Running Buffer 且不可有氣泡。
用塑膠滴管以抽吸方式去除膠體下緣殘留的氣泡。將樣本與 4x 樣品緩 衝液（Sample Buffer）混合後（體積比為 3：1），經加熱 95℃，5 分鐘。
4x Sample Buffer 的配製如表 4-9，配製好的 Sample buffer 儲存於 4℃備 用。取出5μl 分子量標準品（MagicMarkTM XP Western Protein Standard）
和配製好的樣品由左至右分別注入樣品槽中。本次所使用的分子量標準 品（marker）可與多種二抗相結合，可與呈色劑結合而發冷光，所以可 經由壓片得知不同分子量蛋白質的分佈。將注入好樣品的膠體，以 100V，120 分鐘或 150 分鐘進行電泳。
表4-5、膠體電泳 8% SDS-PAGE 下層膠和上層膠製備
組成 下層膠
（8% Separation gel）
上層膠
（4% Stacking gel）
（a）Acrylamide/Bis（37.5:1） 2ml 0.503ml
（b）Running gel buffer 1.5M Tris-HCl pH=8.8
2.5ml ×
（c）Stacking gel buffer 0.5M Tris-HCl pH=6.8
× 1.25ml
表4-6、10x Running Buffer 配製
組成 重量（g）
Tris 30.3 Glycine 144
SDS 10 加 DDW 到 1L
表4-7、4x Sample Buffer（SDS Reducing Buffer）配製
藥品名 μl
0.5M Tris-HCl pH=6.8 125
Glycerol 100 10%（w/v）SDS 200
2-Mercaptoethanol 50 0.5%（w/v）bromophenol blue 50
DDW 475 總體積1ml
（2）西方點墨法（Western Blotting）
1. 轉漬步驟：
將轉漬夾打開後黑色朝下放，取出一片海綿墊片浸泡轉漬緩衝液
（Transfer Buffer）後放於其上，並依序在海綿片上放上 3M 濾紙、
SDS-PAGE gel、PVDF 轉漬膜（先用 100％甲醇潤濕）、3M 濾紙，最後 再放上一片海綿墊片後夾上轉漬夾（夾層中間切勿有氣泡），形成類似 三明治夾層的構造。
將轉漬夾放入電泳槽中後放入冰盒並加滿轉漬緩衝液（Transfer Buffer）。於電泳槽外圍放入足夠的冰塊，使整個系統保持低溫狀態。以 100V，3 小時為電泳條件，進行蛋白質轉漬步驟。緊接將轉漬膜以 5％
脫脂奶［溶於 0.1%TBS/Tween（TBST）中］進行 blocking 步驟，以室 溫1 小時為條件搖盪進行。取出轉漬膜後以 TBST 清洗 5 分鐘共 2 次。
TBS 配製如表 4-10，配製好儲存於 4℃，且調整其至 pH=7.4 備用。加入 一級抗體（Alpha Diagnostic International），以 4℃浸至隔夜。隔天以 TBST 清洗 2 次，每次 5 分鐘。之後加入 5ml 的二級抗體（PerkinElmer Life Sciences, Inc）以 TBST 稀釋，於室溫下搖盪進行 1 小時，最後以 TBST 清洗2 次，每次 5 分鐘。
表4-8、1x Transfer Buffer 配製
組成 重量（g）
Tris 3.03 Glycine 14.4 並加入methanol 200μl，再加 DDW 到 1L
表4-9、TBS 配製
組成 重量（g）
NaCl 1.37M Tris base 200mM
PH 7.6
2. 抗體的製備：
一級抗體
Anti-IRS1; Anti-IRS2; Anti-Phosphotyrosine, clone 4G10; Anti-PI3-Kinase p85, N-SH2, cline UB93-3（Upstate Biotechnology）
Buffer：TBS 含 1% 脫脂奶
Western Blotting 時使用濃度：IRS-1 為 1μg/ml IRS-2 為 1：500 PI 3-kinase 為 1：200
二級抗體
Anti-Rabbit IgG（Goat）, Anti-Mouse IgG , HRP-Labeled（PerkinElmer Life Sciences, Inc）
Membrance Immunoassays：1:5000
Western Blotting 時使用的方式為 1μl 二抗 + 10ml TBS + 1%脫脂奶
3. 壓片步驟：（暗室中進行）
將轉漬膜浸泡於ECL（PerkinElmer Life Sciences, Inc）試劑之混合 液（每瓶各取500μl 等比例混合）中反應 2 分鐘。以封口袋平整包覆好 轉漬膜並正面朝上放置於壓片卡匣（Cassette）內，再用膠帶固定好。以
將轉漬膜浸泡於ECL（PerkinElmer Life Sciences, Inc）試劑之混合 液（每瓶各取500μl 等比例混合）中反應 2 分鐘。以封口袋平整包覆好 轉漬膜並正面朝上放置於壓片卡匣（Cassette）內，再用膠帶固定好。以