第五章、 結果
四、 IRS-2 酪胺酸磷酸化型式的蛋白質表現量
同樣利用免疫沉澱法和免疫墨點法，比較各組在相同總蛋白質濃度 的情況下，其IRS-2 酪胺酸磷酸化此種活化型 IRS-2 的蛋白質表現情形。
在沒有胰島素刺激的情況下(即為基礎狀態下)，其 IRS-2 酪胺酸磷酸化 型式的蛋白質表現量為6mg 組最高、3mg 組次之而生理水組最低
(p<0.05)。然而在胰島素刺激後，其 IRS-2 酪胺酸磷酸化型式的蛋白質表 現量亦為補充生物素6mg 組最高、3mg 組次之而生理水組最低 (p<0.05)
（圖5-4）。
0
IRS-2-P expression (% of control Ins(-))
IRS-2 tyrosine phosphorylation protein expression
(A) IP：pY
IB：IRS-2 (B)
圖5-4、三組不同劑量生物素補充 4 週後在基礎狀態或胰島素刺激下，骨骼肌細胞中
IRS-2 酪胺酸磷酸化型式的蛋白質表現量。A：免疫墨點法的結果。B：以 Alpha Innotech Coraration ChemiImagerTM 440 定量的結果1。Fig. 5-4. IRS-2 tyrosine phosphorylation protein expression in skeletal muscle cells on basal or insulin-induced condition after 4 weeks with 0,3,6 mg biotin/kg of BW supplementation. A : Immunoblot of IRS-2 tyrosine phosphorylation protein. B : Quantification of protein expression by Alpha Innotech Coraration ChemiImagerTM 4401 . 1 The values are calculated by percentage of control, ins (-), and expressed as mean ± SD. Values with different letter in insulin (-) or (+) group are significantly different (p<0.05).
Biotin (mg) 0 0 3 3 6 6
五、與IRS-1 相連結之 PI 3-kinase 的蛋白質表現量
利用免疫沉澱法和免役墨點法，比較各組含相似 IRS-1 蛋白質表現 量的樣品中，與IRS-1 相連結之 PI 3-kinase 的蛋白質表現量。在沒有胰 島素刺激的情況下(即為基礎狀態下)，生理水組的 PI 3-kinase 的蛋白質 表現量顯著低於補充生物素3 mg 及 6 mg 組，且 6 mg 生物素補充組其 PI 3-kinase 的蛋白質表現量顯著高於 3 mg 組(p<0.05)。然而在有胰島素 的刺激之下，生理水組的PI 3-kinase 的蛋白質表現量顯著低於補充生物 素3 mg 及 6 mg 組，並且補充生物素 6 mg 組其 PI 3-kinase 的蛋白質表 現量顯著高於3 mg 組(p<0.05)。生理水組和 3 mg 生物素補充組均顯示 在有胰島素刺激下，其PI 3-kinase 的蛋白質表現量顯著高於沒有胰島素 刺激的情況(p<0.05)，結果如圖 5-5 所示。
0
PI 3-kinase expression(% of control Ins(-))
IRS-1 associated PI 3-kinase protein expression
(A) IP,IB: IRS-1 IP: IRS-1,IB: PI 3-k
(B)
圖5-5、三組不同劑量生物素補充 4 週後在基礎狀態或胰島素刺激下，骨骼肌細胞中
與IRS-1 連結的 PI 3-kinase 蛋白質表現量。A：免疫墨點法的結果。B：以 Alpha Innotech Coraration ChemiImagerTM 440 定量的結果1。Fig. 5-5. IRS-1 associated PI 3-kinase protein expression in skeletal muscle cells on basal or insulin-induced condition after 4 weeks with 0,3,6 mg biotin/kg of BW supplementation.A : Immunoblot of IRS-1 associated PI 3-kinase protein . B : Quantification of protein expression by Alpha Innotech Coraration ChemiImagerTM 4401 . 1 The values are calculated by percentage of control, ins (-), and expressed as mean ± SD. Values with different letter in insulin (-) or (+) group are significantly different (p<0.05). *mean is significantly different from their insulin (-) group (p<0.05).
Biotin (mg) 0 0 3 3 6 6
六、與IRS-2 相連結之 PI 3-kinase 的蛋白質表現量
利用免疫沉澱法和免役墨點法，比較各組含相似 IRS-2 蛋白質表現 量的樣品中，與IRS-2 相連結之 PI 3-kinase 的蛋白質表現量。在沒有胰 島素刺激的情況下(即為基礎狀態下)，生理水組的 PI 3-kinase 的蛋白質 表現量顯著低於補充生物素3 mg 及 6 mg 組，且補充生物素 6 mg 其 PI 3-kinase 的蛋白質表現量顯著高於 3 mg 組(p<0.05)。在有胰島素的刺激 之下，生理水組的PI 3-kinase 的蛋白質表現量顯著低於補充生物素 6 mg 組(p<0.05)，然而各補充組均未顯示出胰島素刺激 PI 3-kinase 的蛋白質 表現量增加的作用（圖5-6）。
0
PI 3-kinase expression (% of control Ins(-))
IRS-2 associated PI 3-kinase protein expression
(A) IP,IB: IRS-2
IP: IRS-2, IB: PI 3-k
(B)
圖5-6、三組不同劑量生物素補充 4 週後在基礎狀態或胰島素刺激下，骨骼肌細胞中
與IRS-2 連結的 PI 3-kinase 蛋白質表現量。A：免疫墨點法的結果。B：以 Alpha Innotech Coraration ChemiImagerTM 440 定量的結果1。Fig. 5-6. IRS-2 associated PI 3-kinase protein expression in skeletal muscle cells on basal or insulin-induced condition after 4 weeks with 0,3,6 mg biotin/kg of BW supplementation.A : Immunoblot of IRS-2 associated PI 3-kinase protein . B : Quantification of protein expression by Alpha Innotech Coraration ChemiImagerTM 4401 . 1 The values are calculated by percentage of control, ins (-), and expressed as mean ± SD. Values with different letter in insulin (-) or (+) group are significantly different (p<0.05). *mean is significantly different from their insulin (-) group (p<0.05).
Biotin (mg) 0 0 3 3 6 6
第六章 討論
壹、補充生物素對於空腹血糖、葡萄糖耐受性、胰島素阻抗性 及 GLUT4 的影響
許多研究已發現補充生物素可以改善葡萄糖代謝。口服或注射高劑 量生物素已顯示可改善糖尿病KK 小鼠(Reddi et al., 1988)、STZ 糖尿病 大鼠(Zhang et al., 1997)及 OLETF 大鼠(Zhang et al., 1996)的葡萄糖耐受 性。而目前人體的臨床報告中，口服或血液透析9-16 mg/daily 生物素並 沒有副作用的產生。先前有臨床研究將生物素口服劑量提高到 200 mg/daily，也沒有出現任何副作用 (Mock et al., 1996; Yoshikawa et al., 2002)。本研究所使用的雄性 KK/H1J 品系小鼠具有第 2 型糖尿病之特 徵，如葡萄糖不耐症(glucose intolerance)、高胰島素血症(hyperinsulinemia) 與胰島素阻抗性的遺傳性質。這樣的症狀可以經由高脂飲食提早誘發出 來，
本研究室先前的研究結果發現，雄性 KK/H1J 品系小鼠在生物素未 補充前，對照組、3mg 和 6mg 補充組在葡萄糖耐受性試驗的結果並無顯 著差異。補充生物素兩週之後，3mg 組與對照組的葡萄糖耐受性沒有顯
著差異；然而6mg 組第 60、90、120 分鐘之血糖濃度則顯著低於對照組
（p <0.05）。在補充生物素四週後，3mg 組與 6mg 組的血糖濃度值在第 0、30、60、90 與 120 分鐘與對照組比較均顯著較低（p <0.05）。
由這些結果得知，補充生物素可改善KK 小鼠對葡萄糖的耐受性。
上述結果中，生物素 6mg 補充組雖然有顯著改善葡萄糖耐受性，然而 3mg 補充組卻沒有顯著差異，本研究室推測可能是因為補充劑量較少或 是補充期不夠長，所以60 分鐘後血糖下降的趨勢沒有很明顯。
在胰島素阻抗性方面，本研究室之前的結果與 Reddi 等人在 1988 年所得到的結果相似，補充生物素 3mg 或 6mg 四週之後，胰島素阻抗 性有顯著下降（p<0.05）。而研究結果顯示，補充生物素可降低空腹血糖 值，且 3mg 與 6mg 補充四週後均有達統計上的顯著，此顯示生物素對 於第2 型糖尿病 KK 小鼠的血糖調控是有幫助的，但需長期補充(四週以 上)。
本研究室之前的研究發現，補充 3 mg 與 6 mg 生物素四週後，可分 別顯著增加基礎狀態或胰島素誘導後骨骼肌細胞漿膜（PM）部位的 GLUT4 表現量及 GLUT4 在漿膜（PM）部位的比例。由此推論補充生
物素主要是增加骨骼肌細胞基礎狀態與胰島素誘導後的 GLUT4 位移作 用，藉以增加漿膜（PM）部分的表現量而改善胰島素阻抗性，但對骨骼 肌細胞 GLUT4 的蛋白質總量並沒有影響。因此本研究進一步探討生物 素降低空腹血糖、改善葡萄糖耐受性、下降胰島素阻抗性及增加葡萄糖 轉運的可能機制。
貳、補充生物素對胰島素訊息傳遞上游路徑的影響
一、生物素對胰島素訊息傳遞上游路徑中IRS-1、IRS-2 的影響
在細胞的分子機制層面，胰島素的作用，是個複雜的網狀系統，可 由不同的路徑和不同型式的關鍵酵素所調控表現出。由活體試驗與細胞 試驗顯示，IRS-1 對代謝最大的影響在於調節脂肪和肌肉組織中胰島素 的訊號傳遞，而IRS-2 主要影響肝臟和肌肉組織 (Bruning et al., 1998；
Kulkarni et al., 1999；Tamemoto et al., 1994)。
首先，在細胞內的層面，會出現大量的胰島素接受器的受質
IRS-1~IRS-4、Shc 和 Gab-1 等，皆會受 insulin receptor tyrosine kinase 作 用而使其酪胺酸磷酸化，除了Shc 之外，其他的受質磷酸化的部位可同 時與許多src homology 2(SH2)訊號蛋白交互作用。SH2 訊號蛋白包括 adaptor molecular Grb-2 和 PI 3-kinase 的調節單位(P85)等 (Skolnik et al., 1993; Cheatam and kahn, 1995; Sugumoto et al., 1994) 。
有研究指出，當 IRS-1 或 IRS-2 其 serine phosphorylation 後，會進行
另一項訊息傳遞，將迴饋抑制其 tyrosine phosphorylation，使得胰島素訊 息傳遞路徑之PI 3-kinase pathway 無法順利進行，而可能導致胰島素阻 抗性。
表6-1、與 IRS-1 磷酸化相關的激酶及其對 IRS-1 且/或胰島素訊息傳遞 的影響
Table 6-1.Kinases implicated in IRS-1 phosphorylation and the effect on IRS-1 and/or insulin signalling
許多研究都希望藉由增加胰島素訊息傳遞路徑的分子蛋白表現，進 而改善胰島素阻抗性。Takehide 等人發現，給予 SD 大鼠飲食中 8% NaCl 的高鹽飲食，會增加其肌肉和肝臟中 IRβ、IRS-1 phosphotyrosine 和 IRS-2 phosphotyrosine 的蛋白質表現(Takehide et al., 2001)。近年流行的 綠茶也有研究指出，正常動物模式中長期飲用綠茶可降低 SD 大鼠血漿 三酸甘油酯濃度及增加胰島素敏感性，並由實驗結果推測，增加胰島素 敏感性可能與酪胺酸磷酸化的 IR、IRS-1 和 GLUT4 的表現量增加有關
（吳，2003）。此外，在基因層面的研究方面，Loredana 等人發現，Estradiol (E2) 可增加乳癌細胞中 IRS-1 的基因表現，並增強了胰島素的訊息傳遞 (Loredana et al., 2001)。Büren 等人則是發現在初代培養的大鼠脂肪細胞 給予 Dexamethasone 將會減少 IRS-1、PI 3-kinase 與 PKB ( protein kinase B)，而損害了胰島素訊息的傳遞和葡萄糖的轉運 (Büren et al., 2002)。
本研究的結果顯示，給予第2 型糖尿病 KK 小鼠補充生物素 4 週後，
可增加胰島素上游訊息傳遞路徑分子蛋白IRS-1, IRS-2 , PI 3-kinase 的表 現，因此推測生物素可改善葡萄糖的調控，可能是藉由向上調節某些胰 島素訊息傳遞路徑分子蛋白的表現所致。
雖然研究指出，IRS-1 與 IRS-2 的結構與功能性相似(Sun et al., 1995)，
但近來有研究發現兩者間功能上仍有不同，有研究指出，IRS-2 對胰臟 的β細胞，有促進其分泌胰島素的作用，Takehide 等人於 1997 年發現，
骨骼肌細胞在相同胰島素濃度刺激下，IRS-2 去磷酸化(dephosphorylation) 的速度比IRS-1 迅速，IRS-2 在胰島素刺激後會迅速去磷酸化，而 IRS-1 的磷酸化則可持續60 分鐘以上 (Takehide et al., 1997) ，由於本研究室 給予小鼠胰島素30 分鐘的刺激，才進行犧牲，而取出骨骼肌，因此推 測可能是因為此原因而IRS-2 已有部分去磷酸化現象，而導致蛋白質表 現很微弱，但由於每組的胰島素刺激時間相同，所以在相同條件下，或 許仍能從結果中互相比較而得知不同的生物素補充組之間IRS-2 酪胺酸 磷酸化型式的蛋白質表現量。
二、生物素對胰島素傳遞路徑中與 IRS-1、IRS-2 連結的 PI 3-kinase 之影 響
幾乎所有的有胰島素阻抗的動物模式或人體，其胰島素誘導的 PI 3-kinase 的活性有缺陷的情形(Takehide et al., 2001)。研究指出，肥胖的 第2 型糖尿病人骨骼肌中，受胰島素刺激的 PI 3-kinase 活性有受損的情 形(Cusi et al ., 2000)，而非肥胖的第 2 型糖尿病人骨骼肌中，也有相同 的情況(Bjornholm et al., 2000)。
研究指出，IRS-1 對 PI 3-kinase 活化的作用比 IRS-2 強很多；並且 和IRS-1 相比，IRS-2 去磷酸化速度較快，活化 PI 3-kinase 較短暫 (Smith-Hall et al., 1997; Inoue., 1998)。 Takehide 等人發現，在骨骼肌細 胞中，在相同胰島素濃度刺激下，IRS-2 去磷酸化(dephosphorylation) 的 速度非常迅速而導致與IRS-2 相連結的 PI 3-kinase 的活化也變得短暫 (Takehide et al., 1997)，本研究結果中，補充生物素 3 mg 組其與 IRS-2 連結的PI 3-kinase 的蛋白質表現量並不如預期，推測是由於此原因所致, 但仍需進一步探討。
然而本研究著重探討和 IRS-1、IRS-2 連結的 PI 3-kinase 的蛋白質表 現，來證實生物素可促使胰島素訊息順利傳遞，而達調控葡萄糖的作 用。往後可進一步的探討胰島素訊息傳遞路徑的其他蛋白質，以進一步
然而本研究著重探討和 IRS-1、IRS-2 連結的 PI 3-kinase 的蛋白質表 現，來證實生物素可促使胰島素訊息順利傳遞，而達調控葡萄糖的作 用。往後可進一步的探討胰島素訊息傳遞路徑的其他蛋白質，以進一步