第一節 實驗動物小鼠
購自台大醫學院動物繁殖組之 4~5 周 BALB/c 雌鼠，於台大醫學院動物代養組 飼養於溫度 20~22 度的代養環境中，設定白天及夜晚各 12 個小時循環，飼料與飲 水於老鼠自由取食。
第二節 啤酒酵母菌豆類發酵產物(SCLFP)的製備
實驗中所使用之啤酒酵母菌豆類發酵產物(Saccharomyces cerevisiae legume fermented product, SCLFP)是由廠商提供，其主要成分為大豆、黑豆、紅豆、芥花 油等，而其大概製備的流程如下：
(1)將各種豆類分別潤溼及浸泡；
(2)泡軟後研磨成液狀，置於發酵槽中由啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)進行 150 個小時的發酵作用；
(3)最後以高溫乾燥，將不同豆類產物以一定比例混合，裝入膠囊中即完成。
第三節 小鼠食道插管餵食
將餵食管裝置在注射器上，伸進小鼠食道的方式強迫定量餵食；將 SCLFP 溶 於二次水中，調配濃度為 150 mg/ml；自老鼠七周大時開始餵食，每周餵食三次，
每次餵食 0.2 ml/隻。
第四節 異位性皮膚炎(Atopic dermatitis, AD)模式建立
主要是參考台大醫學院皮膚科王莉芳醫師實驗室的實驗方法進行貼皮致敏 (epicutaneous sensitization)以及參考文獻(Spergel et al., 1998)的方式。利用兩種藥劑 --雞卵蛋白(ovalbumin,OVA)：以一倍 PBS 配製濃度為 100 mg/ml，用量為 20 μl/patch，
12
即每隻為 2 mg、金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B)：以一倍 PBS 配製濃度為 400 μg/ml，用量為 10 μl/patch，即每隻 4 μg；將兩種藥劑滴於皮 膚貼布(finn chamber)上，將老鼠背部皮膚剃毛後，直接貼附，並用彈性繃帶加以 固定，以每天換藥的方式，進行連續五天的貼皮致敏，再休息兩個禮拜再進行第 二次的貼皮，貼皮三次後，老鼠在最後一天貼皮隔天犧牲(組別設計見圖一)。
第五節 耳朵腫脹過敏試驗(mouse ear swelling test, MEST) 模式建立
依據參考文獻(Kohtaro Fujihashi et al., 2001)的方式，利用 OVA 以一倍 PBS 和 alum (40 mg/ml) 1:1 的比例配製濃度為 1mg/ml，用量為 50 μl/隻，即每隻給予 50μg，
以腹腔注射的方式致免老鼠，隔兩周再打第二次，總共打三次後，再利用 OVA 以 一倍 PBS 配製成 10 mg/ml，用量為 20 μl/隻，即每隻給予 200 μg，在老鼠的左耳 以皮下注射的方式致免老鼠，另在右耳以 PBS 皮下注射做為控制組，老鼠在 72 小 時後犧牲(組別設計見圖六)。
第六節 DSS 誘導腸炎模式(DSS-induced colitis)建立
依據參考文獻(Philip Alex et al., 2009)，利用分子量為 35000~50000 Da 的右旋 醣酐硫酸酯鈉(Dextran sulfate sodium, DSS)以二次水配製濃度為 3%，並經過高壓滅 菌以及 0.45 μm 濾紙過濾後即可使用。先將小鼠餵食四周後，將飲用水換成 3%DSS 達十天，隔天進行犧牲(組別設計見圖九)。
第七節 組織與檢體收集
糞便：犧牲時，將老鼠小腸和大腸取下，用針筒的尾端將其內的渣滓刮出，
並蒐集置於-80℃冰箱保存。
脾臟：將脾臟放置在 10 ml 之一倍 HBSS 於 10 公分培養皿，以兩片滅菌過的 載玻片磨砂面分離出單細胞懸浮液，以茶包袋濾去大塊組織於 15 ml 離心管，在室
13
溫 1500 rpm 離心五分鐘 (Centrifuge 5415 D, Eppendorf)，倒掉上清液，將細胞沉澱 拍散，每離心管加入冰的 10 ml 含 8.3% NH4Cl 及 1% KHCO3之紅血球分解緩衝液 (RBC lysis buffer)，盡快在室溫 1500 rpm 離心五分鐘，倒去上清液，拍散細胞後，
加入 2 ml 加入含有 10% 胎牛血清(fecal calf serum, FCS)，1% HEPES，1%
L-glutamine，1% Penicillin/ Streptomycin 之 RPMI 1640 細胞培養液(complete RPMI, cRPMI)，最後細胞計數後備用。
淋巴結：將淋巴結放在 0.5 ml cRPMI 於 24 孔盤， 藉由將淋巴結移至加有新 鮮 cRPMI 的圓孔洗去表面血液，以滅菌過的 3 ml 針筒的活塞底部將淋巴結的細胞 壓出，形成單細胞懸浮液，以茶包袋濾去大塊組織於 15 ml 離心管，在室溫 1500 rpm 離心五分鐘，倒掉上清液，將細胞拍散，加入 1 ml cRPMI，最後細胞計數後備用。
第八節 細菌核酸萃取(bacterial DNA extraction)
1. 利用糞便 DNA 萃取套組 ZR Fecal DNA MiniPrep(ZYMO RESEARCH)和 QIAamp DNA Stool Mini Kit(QIAGEN)萃取出糞便中的 DNA。
2. 取 10-50 mg 糞便加入 200μl lysis buffer(50 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，1% SDS)，
再加入 0.3 g Zirconia-Silica beads (Biospec. Co.)和一顆 3 mM Tungsten-Carbide beads (QIAGEN)，加熱至 90℃十分鐘，使用均質振盪器 FastPrep 120 FP120 (Bio101, SAVANT)以震速 4.0、5.0、6.0 各 1 分鐘，加入 150 μl 1% SDS，加熱 至 70℃十分鐘，加入 500 μl phenol 作用兩分鐘，在 4℃離心 10000rpm 三分鐘，
取上層液加入 500 μl phenol-chloroform-isoamylalcohol (25:24:1 混合)，震盪均勻 後在 4℃離心 10000 rpm 三分鐘，取上層液加入 1000 μl 100% ethanol、40 μl 5 M NaCl，隔夜沉澱一個小時，取出後在 4℃離心 10000 rpm 三十分鐘，加入 1000 μl 70% ethanol，在 4℃離心 10000 rpm 三分鐘，最後將 DNA pellet (白色顆粒) 以 50 μl ddH2O 回溶。
14
第九節 組織核酸萃取(tissue RNA extraction)
將犧牲後的 BALB/c 老鼠組織加入液態氮磨碎後，加入 solution D (4M Guanidinium iso-thiocyanate、25 mM Sodium citrate pH 7.0、0.5% Sarcosyl、0.1 M 2-Mercaptoethanol)，搖晃均勻後分別加入 2 M Sodium Acetate pH 4.0、Acid phenol (water-saturated)、Chloroform:isomylalcohol (49:1)，搖晃均勻後在冰上作用 20 分鐘，
經 10000 rpm 於 4℃離心 20 分鐘，取上清液加入一倍體積 Isopropanol 於-20℃沉 澱一小時。取出 sample 在 10000rpm 於 4℃離心 20 分鐘，倒掉上清液後取 DNA pellet 加入 0.5ml solution D 回溶並移置 eppendorf 中，加入 0.5ml Isopropanol 於-20℃沉 澱一小時。經光譜分析儀(Ultrospec 3300 pro, Amersham Bioscience)定量 RNA 濃度 後，取 2 μg RNA 以 RQ1 DNase(Promega)於 65℃作用 30 分鐘以進行 DNA 清除，
再利用 M-MLV Reverse Transcrptase(Promega)以及 oligo-dT 於 37℃作用一小時進行 反轉錄。
第十節 聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)
將 cDNA 加入 0.04 μΜ 的正向和反向引子、1 unit Taq polymerase 及 0.25 mM dNTP 及 2 μl 的 10x buffer，加滅菌水補足體積至 25 μl，PCR 條件如下：95℃五分 鐘，25 個循環(95℃45 秒，58℃或 65℃45 秒，72℃一分鐘)以及 72℃兩分鐘，作用 結束後取 10 μl DNA 進行 2%洋菜膠 DNA 電泳。最後洋菜膠照相完的結果以 Analysis System 120 (Scientific Imaging Systems, Eastman Kodak)分析。
第十一節 即時定量聚合酶連鎖反應(real-time PCR)
將 cDNA 和引子(Applied Biosystem)利用 POWER SYBR GREEN PCR Master Mix (Applied Biosystem)於 Applied Biosystem 7500 system 中進行同步定量聚合酶 連鎖反應，不同基因之 Ct 值結果將以 bacterial 16S rDNA gene 或 mouse β-actin gene 做為基準，代入以下公式：Relative expression=(2-dCt)。(引子序列清單附於附表 1)
15
第十二節 組織化學染色(H&E stain)
在老鼠犧牲當天取下大腸組織，以 10%福馬林浸泡一天以上後送至台大醫學 院動物中心進行脫水滲蠟，並以石蠟進行包埋，之後將組織切成 5-8 μm 大小的標 本，最後即可進行 H&E 組織化學染色。
(1) 將標本浸入 xyline 中，進行脫蠟；
(2) 依次浸入 100%-70%的酒精之中，進行回水；
(3) 浸入 Haematoxylin 中染色約 100 秒，由流水褪色後浸入氨水約十秒進行固定，
再放入 Eosin 中染色約四十秒；
(4) 待組織風乾後，滴上適量中性樹脂進行封片。
第十三節 統計分析
本研究中結果皆以平均值(Mean)與標準差(Standard Deviation)表示，利用 Student’s t-test 的 unpaired t test 比較實驗結果中各組數據之間的差異，並以 P<0.05 做為達到統計學上顯著差異的界定標準。*表示統計學上 P<0.05，**表示統計學上 P<0.001，***表示統計學上 P<0.0001。
16