SOD 測定原理：利用 xanthine 和 xanthine oxidase (XOD)反 應，作為superoxide 產生的來源。所產生的 superoxide 與
2-(4-iodophenyl)-3- (4-nitrophenol)-5-phenyltetrazolium chloride (INT) 反應，產生紅色的 formaza。SOD 的活性依據 formaza 受抑制的程度
而定。
Catalase 測定原理：利用在 240nm 波長範圍的 H2O2吸光值，在單 位時間內的差值來測量catalase 的活性。需注意的是為了避免 O2產生 的速度過快，氣泡影響測量精確性，必須用低濃度的H2O2。另外，
最恰當的反應溫度和pH 值為 20℃和 pH7.0[41]。
GSH-Px 測定原理：cumene hydroperoxidase 催化 GSH-Px，使 Glutathione 氧化，氧化的 Glutathione 與 glatathione reductase 和 NADPH 反應，NADPH 所減少的量可在波長 340nm 測出，可估算出 GSH-Px 的活性。
第二章 材料與方法 一、 牛樟芝試驗物質製備
本實驗使用的為牛樟芝是由椴木栽培所得到的子實體，其超臨界萃取 物製作成滴丸，以下簡稱TCSE。TCSE 以去離子水配成濃度為 10、
60 mg/ml 的懸浮液使用。大鼠經口投予體積為每 100 公克大鼠體重投 與1 毫升
二、 藥品試劑
編號 名稱 廠牌
1 TBE buffer Amresco
2 Sodium chloride Amresco
3 福馬林 10% BS chemicals
4 Diethypyrocarbonate, DEPC Biotecx
5 Sulfuric acid Fluka
6 Sodium hydroxide , pellets J.T.Baker
7 Sirius red Muto Pure chemicals 8 Potassium chloride , KCl MERCK
9 Alcohol Panreac
10 Hydrochloric acid Riedol-de Haen 11 ALT (ALAT/GPT) Roche/Hitachi 12 AST (ASAT/GOT) Roche/Hitachi
13 Xylene Scharlau
14 3,3’-Diaminobenzidine tetrahydrochlorodehydrate, 97%
Sigma
15 Carboxyl methylcellulose sodium salt Sigma 16 2-Thiobarbituric acid, TBA Sigma 17 4-(Dimethyl0amino)benzaldehyde Sigma
18 Sodium sulfate, Na2SO4 Sigma 19 Hydrogen peroxide, H2O2 Wako
20 Isopropanol Scharlau Chemie S.A.
21 Chloroform Showa
三、 儀器設備
編號 名稱 廠牌
1 KUBOTA 3500 離心機 KUBOTA
2 pH meter HM-5S TOA Electronics
3 Spectrophotometer Hitachi
4 ASTEC program temp. control system ASTEC
5 Gene Amp. PCR system 9700 A&B (Applied Biosystems)
6 AlphaDigDoc hardware Alpha Innotech Co.
7 Fluoroskan Ascent FL Thermo Scientific 8 Microplate reader model 550 Bio-RAD
9 CoBAS MIRA PLUS 生化自動分析 儀
Roche
四、 實驗動物
實驗動物選用Wistar 雄性大鼠，體重 220-260g，購自國家實驗 動物繁殖研究中心。餵養環境維持 22±3℃，相對溼度 55±5℃，光照 為 12 小時亮 12 小時暗(早上八點亮，下午八點暗)，自由飲水及攝食。
將大鼠隨機分為四組，分別為控制組（n=10）、四氯化碳+H2O 組
（n=12）、四氯化碳+TCSE（100、600 mg/kg body weight；n=12、12）、
四氯化碳+Silymarin(n=10)。每週經胃管給予四氯化碳（20% v/v 溶 於橄欖油；0.2 ml/100 g body weight）兩次，藥物則每天經胃管給予，
投與體積皆為每 100g 給予 1 mL，為期八週。之後犧牲大鼠取其肝臟 及脾臟以及血液檢體進行實驗分析。肝臟與脾臟秤重並觀察外觀有無 異常。
五、 肝功能分析
投藥滿八週，利用乙醚麻醉後，使用10 mL 針管由大鼠腹腔動脈 採血致死，在室溫下 4700 rpm 離心 10 min 分離出血漿。使用 Roche 試劑，以自動生化儀檢測alanine aminotransferase (ALT) 、aspartate aminotransferase (AST)的活性和白蛋白(albumin)濃度。
Glutathione 測定方法：肝組織 GSH 的測定依據 Hissin & Hlif (1973)的方法，秤取肝組織 0.5g，加入 5mL 的 1.15%KCl 溶液，以均 質機均漿，去 1mL 均漿液，加入 1mL trichloroacetic acid 10%，混和均 勻後，以3000 g 離心 15 min。取 0.01 mL 上清液，加入 0.18 mL phosphate-EDTA 緩衝液及新鮮配置的 0.01mL σ–phthalaldehyde (OPA) (1mg/mL methanol)溶液，混和均勻後，以螢光 420 nm，激發波長 350 nm 測之。以 μmole/g 表示之。
LPO 測定方法：肝臟脂質過氧化測定參考 Ohkawa 等人(1979) 的方法。秤取肝臟組織0.5 g 加入 5 mL 1.15% KCl 溶液，以均質機均 質化後，取0.1 mL，依序加入 0.2 mL Sodium dodecyl sulfate(8.1%)，
1.5 mL Acetic acid (20%)，1.5 mL 2-thiobarbituric acid (0.8%)，再以去
離子水定量到4 mL，以 95℃水浴 1h，待冷卻後，加入 4 mL
n-butanol/pyridine 混和液(15:1,v/v)劇烈震盪混和均勻後，於 4000 g 離 心10 min，取有機層已分光光度計於 532 nm 測量吸光值。肝臟組織 的脂質過氧化以nmol malondiadehyde(MDA)/mg protein 表示。組織同 時依照Congdon 等人(1993)之 Coomassie Blue 蛋白質定量法，測定肝 臟組織蛋白質含量，以胎牛血清(Bovine derum albumin)為標準品。
SOD 的測定方法：組織之前處理依據 Xia et al.(1995)的方法。活 性的測定使用市售SOD 活性檢驗試劑 Ransod (RANDOX Lab. Ltd.
UK)。SOD 的活性定義為 2-(-iodophenyl)-3-(4-nitrophenol)-5-
phenyltetrazolium chloride 還原反應速率 50%所需要的酵素量為一的 單位(U)，以 U/mg protein 表示。
Catalase 的測定方法：肝組織加入磷酸鹽 KCl 緩衝，配成 10%均 漿，離心後，取上層液加入Triton X-100 (1%)成為 stock homogenate。
加入適量之磷酸緩衝溶液進行稀釋，並調整成pH 7 成為 dilute homogenate (D.H.)。取 D.H.2 mL 加入 1mL H2O2 (0.03 M)，劇烈搖晃 均勻，以分光光度計於25℃，波長 240 nm 測得吸光值，共測兩次，
間隔30s，之後計算反應速率常數 K。K 之計算方式如右：
K=(2.3/t2-t1)(logA1/A2)。A1為t1=0 秒的吸光值；A2為t2=30 秒的吸光
值。以K 表示 catalase 活性，單位為 U/ mg protein。
GSH-Px 測定方法：組織之前處理依據 Xia et al.(1995)的方法。
GSH-Px 活性測試使用市售 GSH-Px 活性檢驗試劑 Ransel(RONDOX Lab.Ltd.UK)。活性定義為每分鐘氧化 1μmol NADPH 所需的酵素量為 一單位(U)。肝組織的 GSH-Px 活性以 mU/mg protein 表示。
六、 肝臟Hydroxyproline 含量測定
Hydroxyproline 的測定參照 Neuman and Logan 的方法[33]。取大 鼠肝臟約0.5g，於 100℃放置隔夜烘乾，將乾燥的肝臟秤重後，加 5mL
6N HCl 100℃加熱 16 小時，加以水解。待冷卻後，取樣品 1mL 離心 1000 rpm，30 min。取 0.1 mL 的上清液，以 1N NaOH 中和水解產物，
每管分別加入檢體0.1 mL，0.1 mL CuSO4 (0.01M)、0.1mL NaOH (2.5N)、0.1 mL H2O2 (6%)震盪後靜置反應 5min，之後 80℃加熱 5min，
去除多餘過氧化物。冷卻後加入0.2 mL 5%
P-dimethylaminobenzaldehyde ，0.4 mL 3N H2SO4劇烈震盪混和均勻 後，於70℃水浴 20 min，冷卻後已分光光度計於 540 nm 測量吸光值。
以Hydroxyproline 為標準品，含量以 μg/g 組織表示。
七、 肝臟病理切片評估
於老鼠犧牲時取下肝臟最大葉的1/3，浸泡在 10%福馬林中固 定，進行石蠟包埋及切片（中興大學獸醫病理所廖俊旺副教授協助製 作）。將組織的切片進行蘇木紫和伊紅染色，觀察肝臟組織變性及壞 死的程度。
肝臟切片染色首先利用xylene 將石蠟脫掉進行復水，染以天狼 星紅的染劑，可將肝臟組織上的膠原蛋白染成紅色，之後進行脫水，
復蠟。以10*4 倍的顯微鏡下照相，利用影像分析軟體計算出肝組織 上膠原蛋白分布的程度。
八、 免疫組織化學染色
石蠟包埋的切片先經由烘箱 60℃烘一個小時，然後依順序經由 xylene 五分鐘*3、100%酒精、95%酒精、70%酒精各一分鐘脫蠟。放 入3%過氧化氫五分鐘，放入草酸緩衝溶液水浴加熱一個小時恢復抗 原活性，冷卻後以TBS-T 潤洗。α-SMA 抗體處理 4℃ 24 小時，TBS-T 潤洗去多餘抗體並滴加二抗室溫一小時。以TBS-T 潤洗後，DAB 30 分鐘；以TBS-T 潤洗後按照 70%酒精、95%酒精、100%酒精、xylene 脫水，之後包埋。
九、 RT-PCR
抽RNA：取 0.1g 肝組織於加入液態氮的研缽中研碎，粉末加入 Trizol，以 18G 和 23G 針頭讓其均質化，Trizol 吸出加入氯仿，混勻 靜置十分鐘靜待分層，12700 rpm 10 min 4℃離心後，抽出上層溶液，
加入75%酒精上下搖動，-30℃ 30min ，待酒精揮發後以 DEPC 水溶 解，測定OD 260nm 和 OD 280nm 以確定其純度。-80℃貯存。
cDNA 製備：以 MMLV-RT kit，取 0.1μl 的 mRNA 加入 kit，混和
均勻後置於PCR 系統中反應，-20℃貯存。
PCR：cDNA 加入適當的 primer，以特定的溫度加入 PCR Master Mix kit 反應。產物 5μl 與 1μl 6x DNA loading dye 混合均勻，加入內
含2% agar 的 EtBr 與 0.5%的 TBE buffer 中 100V 電泳。照相後以 AlphaDigiDoc 軟體分析。
Table 2、primer 序列
mRNA Primer sequence Length (bp) α-SMA Forward: CTGCTCTGCCTCTAGCACAC 138
Reverse: TTAAGGGTAGCACATGTCTG
Col1α1 Forward: GGGACTTCTTGAGGTTGCCA 132 Reverse: ATCCTGCCGATGTCGCTATC
十、 統計方法
數值結果以平均值（mean）±標準偏差（standard deviation，SD）
表示。各組與對照間的數據以SPSS 19 軟體運行 One-Way ANOVA 統 計分析，並進行Dunnett test，以 p 值小於 0.05 表示在統計學上組間 有顯著差異。
第三章 結果 一、 肝功能分析
動物實驗處理第八週的AST、ALT（Fig.1），四氯化碳+H2O
組與控制組相較，大鼠血漿AST、ALT 含量顯著上升，代表實驗模 型建立成功，給予TCSE 後能夠顯著降低大鼠血液中 AST 與 ALT。
低劑量下，AST、ALT 分別降低了 33%、36%；高劑量下，AST、ALT
則是下降了40%、27%。
白蛋白(Albumin；ALB)的方面，四氯化碳+H2O 組與控制組相 較，大鼠血漿ALB 含量顯著下降。經投予 TCSE 後，能血液上升中 的ALB (Fig.2)。低劑量下，ALB 回升了 49%，高劑量下，ALB 回升 82%。
二、 肝臟脾臟檢查
實驗八週後的肝臟重量如Fig.3 所示，給予四氯化碳後，與正常 肝臟相較，發生了腫大的現象。給予TCSE 後，不管是低劑量或是高 劑量，肝臟重量都幾乎沒有改變。
實驗八週後的脾臟重量如Fig.4 所示，給予四氯化碳後，脾臟發 生了腫大的現象。TCSE 低劑量下，脾臟重量下降了 46%；高劑量下，
則下降了61%。
三、 肝臟Glutathione 含量與脂質過氧化的影響
動物實驗八週後肝臟的Glutathione 含量如 Fig.5，我們可發現給
予四氯化碳後，肝臟的 Glutathione 被消耗而降低，但是在給予 TCSE 後，低劑量下，回升了58%；高劑量下，回升了 113%，甚至比原本 正常組要高。
另外，肝臟內Malondialdehyde (MDA)的含量，八週後實驗數據 如Fig.6，我們可發現給予四氯化碳造成的 MDA 上升由於給予 TCSE 後下降了，低劑量下，下降了40%；高劑量下，則是下降了 60%。
四、 肝臟蛋白質與Hydroxyproline 的影響
肝臟蛋白質第八週實驗數據如Fig.7，四氯化碳造成的肝臟蛋白質 下降，給予低劑量 TCSE 下，蛋白質回升了 11%；高劑量下，蛋白質 則是顯著回升了33%。
肝臟第八週 Hydroxyproline 的實驗數據如 Fig.8，四氯化碳造成的
肝臟Hydroxyproline 增加。低劑量下，Hydroxyprolinep 下降了 26%；
高劑量，Hyp 下降了 55%。
五、 SOD、Catalase 與 GSH-Px 的活性影響
SOD 動物實驗八週後測得的數據如 Fig.9，TCSE 低劑量下，SOD 回升了5%；高劑量下，SOD 則是顯著的回升了 26%。
Catalase 動物實驗八週後所得到的數據如 Fig.10，TCSE 低劑量
下，Catalase 回升了 22%；高劑量下，Catalase 回升了 13%。
GSH-Px 動物實驗八週後所得到的數據如 Fig.11，TCSE 低劑量 下，GSH-Px 回升了 8%；高劑量下，只回升了 1%，幾乎無差異。
六、 肝臟病理切片HE 染色分析
如 Table 1 及 Fig. 12 所示，四氯化碳誘發大鼠慢性肝炎，以 H.E.
染色可以明顯看出組織壞死的情形(Fig.12 B)。TSCE 三個劑量組的組 織壞死情形與CCl4 + H2O 組比較沒有明顯差異。
七、肝臟病理切片Sirius Red 染色分析
天狼星紅(Sirius Red)染色能夠染出肝臟切片上的膠原蛋白，用於 切片鏡檢能判斷肝臟纖維化程度的多寡，實驗八週後得到的切片照片 如Fig.12，由照片我們可發現，給予 TCSE 後，呈現紅色的膠原蛋白 明顯減少了。
經由Image Pro 軟體計算面積比例得到的數據見 Fig.13，低劑量 下，纖維化的百分比下降了29%；高劑量下，下降則顯著達到了 40%。
七、 免疫組織化學染色
實驗八週後的數據如Fig.14，對照正常組別，四氯化碳引起 α-SMA
的表現增加。給予TCSE 後，α-SMA 的表現下降了。
八、 Colα1 和 α-SMA 的 mRNA 表現
經由RT-PCR 確認第一型膠原蛋白 α 亞型(Col1α1)和 Alpha-smooth muscle actin (α-SMA)這兩個基因表現的強弱來解釋病理切片結果，第 八週實驗結果如Fig.15 我們可以發現給予 TCSE 能夠有效抑制 Colα1 和α-SMA 這兩個基因的表現。Colα1 分別在低、高劑量下，下降了 41%與 43%。
第四章討論
此動物實驗的設計方法為實驗開始時一週給予兩次四氯化碳同 時每天給予TCSE，跟其他的文獻相較，本實驗算是預防性給藥，而
此動物實驗的設計方法為實驗開始時一週給予兩次四氯化碳同 時每天給予TCSE，跟其他的文獻相較，本實驗算是預防性給藥，而