第一章 緒論
二、 牛樟芝文獻考察
現存市面上牛樟芝的保健食品有許多不同的來源，涵蓋野生牛樟 芝、椴木栽培、發酵菌絲體、固態培養近似子實體等。本實驗使用的 是牛樟芝為椴木栽培的子實體，以超臨界技術萃取。
本實驗是希望藉由四氯化碳的肝損傷動物模型，來確認牛樟芝對 於大鼠的肝纖維化是否有抑制的活性，並且探討其藥理活性機轉，以 其能增加未來對抗慢性肝病的新藥開發可能性。
二、 牛樟芝文獻考察
樟芝存在已久，1990 年才由中國科學院昆明植物研究所臧穆教 授和台北醫學院蘇慶華教授首次發表，將之歸類為靈芝屬，命名為
Ganoderma camphorata。1995 年，張東柱博士依據樟芝子實體 外觀、
氣味、生長速率、孢子顯微結構特性，判定應為多孔菌科 Antrodia 屬 之一種，命名為 Antrodia cinnamomea (Chang and Chou，1995) 。1997 年，吳聲華等人整合前兩次文獻內容後重新發表，將樟芝命名為
Antrodia comphorata 。2004 年，吳聲華博士等兩岸諸位學者共同發
表
Taiwanofungus, a polypore new genus 研究報告認為牛樟芝的 LSU
rDNA 序列分析結果與 Antrodia 和 Antrodiella 的親緣性並不接近。應該將原本所歸屬的薄孔菌屬 (Antrodia)區分出來，並將牛樟芝歸類 在新屬之中，即為台芝屬(Taiwanofungus) [4]。
(一) 牛樟芝型態 牛樟芝在分類學的地位：
真菌界 (Fungi)
擔子菌門 (Basidiomycota) 擔子菌綱 (Basidiomycetes)
多孔菌目 (Polyporales) 多孔菌科 (Polyporaceae)
台芝屬 (Taiwanofungus)
牛樟芝 (Taiwanofungus camphoratus) 別名有樟芝、樟菇、牛樟 芝、樟內菇、樟菰、樟窟內菰、紅樟及紅樟芝等等。子實體散發出香 郁的香樟味且含有高量精油，為多年生，外形多變化，有板型、鐘形、
馬蹄形或不規則狀。子實體不具菌柄，緊密平貼於木材表面，邊緣不 孕，木栓化或木質化，味極苦。菌蓋具同心環且有波溝，每微米有四 至六個菌孔，菌孔朝上，成圓形至角形，菌管長達 40 mm，不分層，
與菌孔同色。上表面初生時為鮮橘紅色，褐橘色至淡肉色，質地柔軟，
漸長則變為淡黃色，老熟時變為褐棕色至黑褐色。質地也因木栓化而 堅硬。[5]
牛樟芝分布於台灣山區海拔 450m 到 1500m 之間。由於牛樟芝與 其他真菌一樣，不具有葉綠素，無法經由光合作用製造其生長與繁殖 等生理活動所需之營養及能量，因此必須營腐生之生活。野生樟芝在 自然界僅生長於牛樟芝樹幹之腐朽心材內壁，或枯死倒伏隻牛樟木材 陰暗潮濕的表面，菌絲生長過程中所需要的各種營養都是從朽木吸收 的。[6]
(二) 牛樟芝椴木栽培
今日的牛樟芝除了野生之外的取得方法有以下幾種：椴木栽培、
固態栽培、液態栽培。
椴木栽培是以具有牛樟芝原基的牛樟椴木以增加濕度的方式促 進子實體長出，由這個很容易得到子實體，但只有椴木的側方及下方 較容易長出並維持其子實體結構，上方會明顯消退。
固態栽培通常以MEA 培養基(Malt extract 20g、Glucose 20g、
Peptone 1g、Agar 20g 加水定量至 1L，高壓滅菌後使用)或是 PDA 培 養基(Potato Dextrose Agar)，於 25~30℃的溫度生長，但是生長速度 較緩慢。如果要促進其子實體產生，通常要給予機械傷害，可以有效
讓其分化為子實體。
液態栽培在適當的溫度和光照條件下，於液態發酵槽中，利用深 層發酵(SCM, submerged cultivation Mycelium)的原理量產，速度快產 量大，但是液態栽培的方式並無子實體產生。
(三) 牛樟芝化學成分
牛樟芝大約有 78 個化合物已經被純化結構辨認。子實體當中大 多數成分為三萜類 (39 個化合物)。大多數三萜類 (31 種結構) 擁有 相似甚至一樣的骨架，普遍為麥角甾烷 (ergostane) 或羊毛甾烷 (lanostane)。63%的三萜類從子實體而來。其餘成分包括：benzenoids, lignans, benzoquinones 和 maleic/succinic acid derivatives，還有
polysaccharides。[5]
(四) 牛樟芝藥理研究 1. 抗癌活性：
①、 子實體和菌絲體抽出物能抑制肝癌細胞Hep G2 和 PLC/PRF/5 增生。[7]
②、 能藉由抑制內質往鈣離子通道使人類肝癌細胞 Hep 3B 凋亡。[8]
③、 三氯甲烷抽出物對癌細胞Jurkat, Hep G2, Colon 205 和 MCF 7 有細胞毒殺作用。[9]
2. 抗發炎活性：
①、 深層培養菌體(SCM, submerged cultivation Mycelium)抽出物有抗發炎活性，能抑制自由基 產生[10]
②、 SCM 水抽出物能抑制 LPS 引起的 NO、TNF-α、
IL-1β、PGE2產生，也能透過 NF-κB 路徑抑制巨 噬細胞iNOS 和 COX-2 的蛋白表現。[11]
③、 子實體的三氯甲烷和甲醇抽出物能透過抑制 iNOS 表現或是 TNF-α 和 IL-12 產生來抑制 NO 產生。[12]
3. 抗 B 肝病毒複製：
①、 菌絲抽出物在體內試驗有抗 B 肝活性而沒有細 胞毒殺作用[13]
②、 乙醇抽出物對於廣泛還有抗 lamivudine 突變的 病毒有活性[14]
4. 抗氧化活性：
①、 抽出物能清除自由基[15]
②、 發酵培養抽出物和菌絲體水抽出物能抑制脂質 氧化。[16]
③、 發酵培養抽出物和菌絲體水抽出物能抑制靜脈 平滑肌細胞凋亡，透過減少 DNA 碎片、
cytochrome c 釋放、caspase-3 活化、Bcl-2 和 Bax 調節失效。[17]
5. 保肝活性：
①、 對於酒精引起的急性肝毒性能抑制肝發炎和脂 肪肝[18]
②、 子實體的水萃取物對於四氯化碳引起的肝損傷 有抑制作用[19]
③、 抽出物能降低 GSH 相關酶(glutathione
peroxidase, glutathione reductase and glutathione S-transferase)[20]
④、 能降低四氯化碳引起的 ALT 上升[21]
6. 抗肝纖維化活性：
①、 四氯化碳大鼠模型中，發酵濾出液能預防和治療 肝纖維化。[22]
②、 能降低四氯化碳大鼠模型中，collagen I、
TGF-β1、TIMP-1、的 mRNA。並能有效降低 MDA 和 hydroxyproline[22]
(五) 純化合物的藥理活性
1. Terpenoids：由以下 Table 3 可以得知牛樟芝三萜類的 藥理活性。由於三萜類針對腫瘤細胞的細胞毒性大於 正常細胞，導致了其抗癌活性。深層培養含有的化合 物與野生的子實體類似[44]。Zhankuic acids A (10) 和 C (16)能夠毒殺 P-388 murine leukemia cells[45]。其分
子機轉現在仍不能完全確立。zhankuic acids A (10) 和 C (16) and methyl antcinate B (20)對於昆蟲細胞
Spodoptera frugiperda Sf 9 有毒殺能力。zhankuic acids,
(10, 16 和 20)被認為對直腸癌、乳癌、肝癌、和肺癌 細胞有專一性。其中methyl antcinate B (20)活性最 強。化合物10、16、20 能誘導直腸癌細胞 HT-29 凋 亡(sub-G1期休止和DNA 斷裂)[46]。poly-(ADP-ribose) polymerase cleavage、Bcl-2 和 procaspase-3 的癟線都 被抑制。另外，化合物9、18 和 20 被認為有抗幽門 螺旋桿菌(anti-Helicobacter pylori)活性，並且抑制位
上皮細胞AGS cells 的發炎(抑制 NF-κB 的活化和抑制 IL-8 的釋放)[47]。
Antcins A (9)、 B (10) 和 eburicol (31)可以抑制 N-formylmethionylleucyl-phenylalanine (fMLP) 引起 的發炎反應[48]。antcin C (11)、dehydroeburicoic acid (25) 和 eburicoic acid (28)能夠調節免疫系統，減 少ROS 的產生[49]。化合物 10、17、16 和 antcin K (18) 能夠抑制fMLP and TPA 誘導的嗜中性白血球的發炎 反應[50]。化合物 2、3、4、5 和 6 在 Harlan
Sprague-Dawley 大鼠有神經保護的作用[51]。
2. Maleic 和 Succinic Acid 衍生物：深層培養的化合物中
有五種對於肺癌細胞LLC tumor cells 有毒殺作用 [52]。深層培養的化合物 antrodins A-E (56, 60, 62, 64 and 66)有抗肝炎活性[53]。子實體 54 號化合物有抗發 炎和免疫促進活性(增加未被 LPS 活化的 RAW264.7 cells TNF-α 分泌和抑制 IL-6 產生)，化合物 57、58 和 61 抑制 IL-6 的產生(LPS 誘導) [54]。深層培養的化合 物Antrocinnamomins A (65)能抑制巨噬細胞產生 NO[55]。化合物 60、62、64、56、66 具有 HCV 蛋白
酶抑制活性[56]。
3. 多糖：牛樟芝的多糖主要由單醣類、galactose、
glucose、mannose 組成[57]。子實體與深層培養的多 糖都有抗B 型肝炎活性[57]，特別的是其他真菌純化 出的多醣目前都沒有抗B 性肝炎活性。現在純化出的 多醣有抗腫瘤和免疫調節活性[58]。例如抑制血癌 U937 cell 的增生[59]、抑制上皮細胞的血管增生作用 (抑制 cyclin D1 的表現)[60]。深層培養的熱水提取物 多糖ACN2a 對於小鼠 Propionibacterium acnes-LPS 誘導的肝損傷有保護作用。多糖AC-1, AC-2, AC-3, AC-4 and AC-5 對於巨噬細胞有抗發炎活性(抑制 LPS
誘導的NO 產生和 iNOS 的蛋白質表現)[61]。深層培 養出來的多糖能夠調節發炎的細胞激素(Th1-type cytokines such as IFN-γ and TNF-α)[62]。深層發酵的水 溶性多糖可以減少H2O2 誘導 Chang liver cells DNA 損傷和ROS 的產生[63]。深層培養純化硫化多糖 (sulfated polysaccharides ;SPSs)能夠抑制血管增生，並 且避免PC-12 cells 的凋亡[64]。
4. 其他：biphenyl 化合物 68 能夠抑制 HBsAg 和 HBeAg
levels[65]。深層培養的化合物 74 能夠抑制 COX-2 的 活性[54]。化合物 43 與 53 能夠抑制被 fMLP 產生的 超氧化物[48]。子實體和深層培養的 Antroquinonol (71)
能對下列癌細胞有毒殺作用：MCF-7、MDA-MB-231、
Hep 3B、Hep G2、DU- 145、LNCaP[66]。化合物 71
能夠抑制TNF-α and IL-1β 的產生(RAW 264.7
cells)[67]。化合物 71 對 HBsAg 和 HBeAg 抑制作用 [108]。深層培養得到的化合物 75、76、77、78 和 56 能夠抑制LPS 誘導的 NO 產生[69]。化合物 40 能夠 抑制直腸癌細胞COLO 205 增值(G0/G1 休止並誘導 凋亡)[70]。
Table 3 牛樟芝在現有文獻中的藥理活性
No. Compound name Source Biological activity Ref.
Terpenoids
1 Antrocin F In vitro neuroprotective [71]
2 19-Hydroxylabda-8(17)-en-16,15-olide F In vitro neuroprotective [51]
3 3β,19-Dihydroxylabda-8(17),11E-dien- 16,15-olide
F In vitro neuroprotective [51]
4 13-epi-3β,19-Dihydroxylabda-8(17),11Edien- 16,15-olide
F In vitro neuroprotective [51]
5 19-Hydroxylabda-8(17),13-dien-16,15- F In vitro neuroprotective [51]
olide
6 14-Deoxy-11,12- didehydroandrographolide
F [51]
7 14-Deoxyandrographolide F [51]
8 Pinusolidic acid F [51]
9 Antcin A F In vitro anti-inflammatory,
anti-insecticidal and
cytotoxic
[48]
10 Antcin B (Zhankuic acid A) F In vitro anti-inflammatory, anti-insecticidal and
cytotoxic
[48]
11 Antcin C F In vitro anti-inflammatory
and cytotoxic
[49]
12 Antcin D (Zhankuic acid F) F [72]
13 Antcin E F [73]
14 Antcin F F [73]
15 Antcin G F [73]
16 Antcin H (Zhankuic acid C) F In vitro anti-inflammatory, anti-insecticidal and
cytotoxic
[74]
17 Antcin I (Zhankuic acid B) F In vitro anti-inflammatory [50]
18 Antcin K F In vitro anti-inflammatory [50]
19 Methyl antcinate A F [75]
20 Methyl antcinate B F In vitro anti-insecticidal and cytotoxic
[76]
21 Zhankuic acid D F [75]
22 Methyl antcinate G F [73]
23 Methyl antcinate H F [73]
24 Zhankuic acid E F
25 Dehydroeburicoic acid F In vitro anti-inflammatory, anti-insecticidal
[76]
26 Dehydrosulphurenic acid F In vitro anti-insecticidal and cytotoxic
[76]
27 15α-Acetyl-dehydrosulphurenic acid F In vitro anti-insecticidal and cytotoxic
[76]
28 Eburicoic acid F In vitro anti-insecticidal and cytotoxic
[76]
29 Sulphurenic acid F In vitro anti-insecticidal and cytotoxic
[76]
30 Versisponic acid D F
31 Eburicol
(24-methylenedihydrolanosterol)
F In vitro anti-inflammatory [48]
32 3β, 15α-Dihydroxy
lanosta-7,9(11),24-triene-21-oic acid
F In vitro anti-insecticidal and cytotoxic
[76]
38 Ergosta-4,6,8(14)22-tetraen-3-on3 F [48]
39 epi-Friedelinol F [48]
Benzenoids
40 1,4-Dimethoxy-2,3-methylenedioxy-5- methylbenzene
F In vitro cytotoxic [70]
41 1,4-Dimethoxy-2,3-methylenedioxy-5- benzoate
F [52]
42 1,6-Dimethoxy-2,3-methylenedioxy-4- benzoic
F [52]
acid
43 Antrocamphin A F In vitro anti-inflammatory [48]
44 Antrocamphin B F [48]
45 2,3,4,5-Tetramethoxybenzoyl chloride F [48]
46 Antrodioxolanone F [48]
47 Isobutylphenol F [80]
Lignans
48 (+) Sesamin F [80]
49 4-Hydroxy sesamin F [80]
50 (−) Sesamin F [80]
Benzoquinone derivatives
51 5-Methyl-benzo(1,3)-dioxole-4,7-dione M [80]
52 2-Methoxy-5-methyl(1,4)benzoquinone M In vitro anti-oxidant [80]
53 2,3-Dimethoxy-5- methyl(1,4)benzoquinone
M In vitro anti-inflammatory [80]
Succinic and Maleic derivatives
54 trans-3-Isobutyl-4-[4-(3-methyl-2- butenyloxy)phenyl]pyrrolidine-2,5-dione
F In vitro anti-inflammatory [55]
55 trans-1-Hydroxy-3-(4-hydoxyphenyl)-4- isobutylpyrrolidine-2,5-dione
F In vitro anti-inflammatory [55]
56 3R∗,4S∗-1-Hydroxy-3-isobutyl-4-[4-(3- methyl-2-
butenyloxy)phenyl]pyrrolidine-2,5-dione
(antrodin D or Camphorataimide E)
F, M In vitro anti-inflammatory, anti-HBV and anti-HCV
[55]
57 cis-3-(4-Hydroxyphenyl)-4- isobutyldihydrofuran-2,5-dione
F In vitro anti-inflammatory [55]
58 3-(4-Hydroxyphenyl)-4-isobutyl-1Hpyrrole- 2,5-dione
F In vitro anti-inflammatory [55]
59
2,5-dione (Antrocinnamomin
C)
F In vitro anti-inflammatory [55]
60 3-Isobutyl-4-[4-(3-methyl-2- butenyloxy)phenyl]furan-2,5-dione
(antrodin A or Camphorataanhydride A)
M In vitro anti-HBV and
anti-HCV
[81]
61 Dimethyl
2-(4-hydroxyphenyl)-3-isobutylmaleate
F In vitro anti-inflammatory [55]
62 3-Isobutyl-4-[4-(3-methyl-2- butenyloxy)phenyl]-1H-pyrrole-2,5- dione (Antrodin B or Camphorataimide
B)
M, B In vitro anti-inflammatory, anti-HBV and anti-HCV
[81]
63 Antrocinnamomin D M [82]
64 3-Isobutyl-4-[4-(3-methyl-2- nyloxy)phenyl]-1H-pyrrol-1-ol-2,5- dione (antrodin C or) Camphorataimide
C)
M In vitro anti-inflammatory, anti-HBV and anti-HCV
[54][78]
65 Antrocinnamomins A M In vitro anti-inflammatory [83]
66 3R∗,4R∗-1-Hydroxy-3-isobutyl-4-[4-(3- methyl-2-
butenyloxy)phenyl]pyrrolidine-2,5-dione
(Antrodin E or Camphorataimide D)
M In vitro anti-HBV and
anti-HCV
[54]
67 Antrocinnamomins B M In vitro anti-inflammatory [83]
Miscellaneous compounds
68 2,2_,5,5_-Tetramethoxy-3,4,3_,4_-bimethylenedioxy-6,6_-dimethylbiphenyl
F In vitro anti-HBV [65]
69 α-Tocospiro B F [48]
70 Methyl oleate F [80]
71 Antroquinonol M, F In vitro cytotoxic, anti-inflammatory,
[66]
anti-HBV
72 Adenosine M Prevention of PC 12 cells
apoptosis
[83]
73 Cordycepin M [83]
74 2,4,5-trimethoxybenzaldehyde M Prevention of PC 12 cells apoptosis
[54]
75 Antroquinonol B M In vitro anti-inflammatory [69]
76 4-acetyl-antroquinonol B M In vitro anti-inflammatory [69]
77 2,3-(methylenedioxy)-6-methylbenzene- 1,4-diol
M In vitro anti-inflammatory [69]
78 2,4-dimethoxy-6-methylbenzene-1,3-diol M In vitro anti-inflammatory [69]
F: Fruiting bodies; M: Mycelium; B: Culture broth.
三、 肝臟纖維化病理機制