第一章 緒論
三、 肝臟纖維化病理機制
肝纖維化是肝臟受損修復重複不斷的反應。經過急性肝損傷後，
器質性細胞(parenchymal cells)再生以接替壞死或凋亡的細胞，這當 中伴隨著發炎反應和細胞外間質(extracellular matrix ;ECM)的堆積。
如果肝損傷持續至肝細胞再生失敗，肝細胞會被大量的 ECM 取代，其 中包括了膠原蛋白。[23]
在肝纖維化進展到後期，ECM 的量是正常肝臟的六倍，其中包 括collagens (I, III, and IV), fibronectin, undulin, elastin, laminin,
hyaluronan, and proteoglycans。ECM 的增加同時其因於合成增加和降
解減少。[24]
肝星狀細胞(HSCs)是 ECM 主要的產生細胞[25]。正常的肝臟
中，星狀細胞存在於周竇間隙，並能夠貯存維生素A。當長期的肝損
傷使得星狀細胞活化並轉化為類肌成纖維細胞[26]。活化的星狀細胞 遷移至再生的組織處，分泌大量的ECM。
靜止的星狀細胞表現出脂肪細胞的特徵(PPARγ, SREBP-1c, 及 leptin)和活化的星狀細胞的肌纖維形成特徵不同(α smooth muscle actin, c-myb, 及 myocyte enhancer factor–2)[23]
肝臟纖維化是由不同的肝細胞交互影響而成的[27]。肝細胞受到 肝毒性的化合物攻擊，包括肝病毒、酒精代謝產物和膽酸[28]。受損 的肝細胞釋出自由基和纖維化介質並促使白血球回流發生發炎反 應。受損的肝細胞凋亡刺激肝肌纖維母細胞的增殖作用[29]。促進發 炎的細胞，淋巴球或是多核球活化星狀細胞分泌膠原蛋白[30]。活化 的星狀細胞分泌發炎趨化素。發炎反應和纖維化反應交錯影響使得狀 況惡化[31]。庫氏細胞是一種常駐在肝的細胞，藉由釋放自由基和細 胞激素大大影響發炎反應[32]。
膠原蛋白(collagen)主要有六種，包含：type I(存在於疤痕組 織)、III(存在於血管中)、IV(存在於基質周圍的上皮細胞中)、V(存 在於膠原蛋白纖維中)、VI(存在於結締組織中，能固定膠原纖維)、
VII(固定基質與基底膜)。肝臟纖維化是細胞外基質(Extracellular Matrix; ECM)大量增生的結果，增生的 ECM 主要是由膠原蛋白 type I 和III 所構成，是由肝星狀細胞(HSC)分泌出來的。膠原蛋白其結構 為一三股螺旋的結構，其中每一股的氨基酸序列一般以
Glycine-Proline-Hydroxyproline(Hyp)的順序重複出現，這三者胺基酸 的連續序列使得三股的氨基酸鍊能夠緊密的以氫鍵結合在一起，膠原 蛋白得以在生物體結構中提供足夠的強度去支撐器官組織等等的構 成[34]。由於一般蛋白質中膠原蛋白含量很少，但是膠原蛋白中 Hyp 的含量可達總胺基酸含量的 12.5% (Edward and O’Brien,1980)，所以 我們可以在測出Hyp 後回推換算有多少膠原蛋白總量。
(二) 四氯化碳動物病理模式
在動物模式當中，四氯化碳誘導大鼠肝損傷或纖維化被普遍使 用。四氯化碳的代謝過程中會造成肝毒性，如：脂質變性、肝臟纖維 化、肝細胞死亡甚至肝硬化以及肝癌的形成。在四氯化碳的代謝途徑 中，藉著細胞色素CYP2E1、CYP2B1、CYP2B2 或 CYP3A 催化成三 氯甲烷自由基CCl3˙。此自由基能夠減少核酸、RNA 及磷脂質的甲基 化，而抑制蛋白質的合成、脂蛋白的分泌，並影響鈣離子在粒線體、
內質網及細胞膜上的通透性，導致鈣離子濃度下降而造成細胞死亡。
三氯甲烷自由基更進一步能夠與氧結合形成三氯甲烷自由基
CCl3OO˙，攻擊多元不飽和脂肪酸形成脂質過氧化，尤其是與磷脂質
的結合，上述這些影響都可能是造成肝損傷的重要因素 [3] 。 穀胱甘肽(Glutathione; GSH)為一三肽，由谷氨酸、半胱胺酸、
甘胺酸所構成。通常在動物細胞中作為抗氧化劑的功用，此外，在動 物體中它亦有解毒、抗紫外線(對抗UV 造成的 DNA 損傷)、抗癌(防 止DNA 損傷)等功用[35]，並認為與下列疾病有關：糖尿病[36]、
AIDS[37]、免疫反應[38]、帕金森氏症[39]。GSH 存在於細胞質中，
避免細胞DNA 被氧化。在細胞中有 GSH(還原態)和 GSSG(氧化肽) 兩種型態。
脂質過氧化(Lipid peroxidation;LPO)為一種脂質氧化的過程。當 生物體有外來自由基出現，可能會誘發不飽和脂肪酸形成脂質過氧化 物自由基，由於脂質是細胞膜的組成，脂質過氧化如果持續發生可能 會導致脂質變性，有併發癌症的危險。
體內LPO 生合成的途徑如下圖：
最後我們能得出產物Malondialdehyde(MDA)，4-hydroxynonenal (4-HNE)，通常我們利用 Thiobarbituric Acid (TBA)去定量 MDA，由 於TBA 會與 MDA 形成加和物，在波長 532 nm 有明顯的螢光吸收，
藉此來定量MDA，也就能估計生物體內 LPO 的產生量了[40]。
(三) 抗氧化酵素
在生物體內，氧化壓力(oxidative stress)會衍生出許多病變，例如 癌症、腎病、神經病變等等。活性氧 reactive oxygen species(ROS)在 這當中扮演著重要的角色。生物體內有許多種活性氧，包括：nitric oxide (NO·), superoxide (O2·), hydrogen peroxide (H2O2) and
peroxynitrite (ONOO·)。ROS 的反應如下圖：
這當中，與ROS 的生合成有關的酵素包括了：SOD、Catalase、
GSH-Px。超氧化物歧化酶 superoxide dismutase (SOD)於生物體內能 夠將超氧化物轉變為過氧化氫。其反應步驟為：
M(n+1)+ − SOD + O2− → Mn+ − SOD + O2
Mn+ − SOD + O2− + 2H+ → M(n+1)+ − SOD + H2O2
金屬離子M 可為：Cu、Mn、Fe、Ni。
過氧化氫酶Catalase 在生物體內可以將過氧化氫轉變為氧和水。
反應式為：2 H2O2 → 2 H2O + O2
谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)為生物體內另一能將游離態過氧 化氫還原成水的抗氧化酵素，在這過程中，同時將谷胱甘肽 GSH 催化 成其氧化態GSSG。
經過檢測生物體內的這幾種酶活性，可以量化生物體受到的氧化 壓力，也就是活性氧生成量的多寡，並可試驗藥物是否有抗氧化的作
用。
SOD 測定原理：利用 xanthine 和 xanthine oxidase (XOD)反 應，作為superoxide 產生的來源。所產生的 superoxide 與
2-(4-iodophenyl)-3- (4-nitrophenol)-5-phenyltetrazolium chloride (INT) 反應，產生紅色的 formaza。SOD 的活性依據 formaza 受抑制的程度
而定。
Catalase 測定原理：利用在 240nm 波長範圍的 H2O2吸光值，在單 位時間內的差值來測量catalase 的活性。需注意的是為了避免 O2產生 的速度過快，氣泡影響測量精確性，必須用低濃度的H2O2。另外，
最恰當的反應溫度和pH 值為 20℃和 pH7.0[41]。
GSH-Px 測定原理：cumene hydroperoxidase 催化 GSH-Px，使 Glutathione 氧化，氧化的 Glutathione 與 glatathione reductase 和 NADPH 反應，NADPH 所減少的量可在波長 340nm 測出，可估算出 GSH-Px 的活性。
第二章 材料與方法