第一節 菌種來源
RP-46 菌，為本實驗室前人自台北地區篩選保存之菌，於 MY 固體培養基中培養，菌體會產生白色菌絲，成絨毛狀，於三天培養可 明顯看見色素分泌於培養基中，經五天培養可觀察色素充滿整個培養 基，如圖一所示，經型態判定為黴菌(mold)。
第二節 分析方法 一. 紅色物質測定
以分光光度計對紅色物質做全光譜掃描，出現的最大吸收波長值 即為紅色抗菌物質主要吸收波長，在此波長下的吸光值會與抗菌物質 的量成正相關，藉此可對紅色抗菌物質作定量的偵測。經確認紅色吸 收波長為500nm 至 505nm 之間，以 502nm 為吸收最高峰，便以此波 長做為測定抗菌物質之吸收波長。
二. 抗菌活性檢測
取 10ml 未凝固約 40~45℃含 MY 之固態培養基，加入 4µl 經約 24 小時以 MY 液態培養基培養之 Bacillus cereus 菌液，混合均勻後，
倒入培養皿中；待凝固後，在固態培養基上挖9 mm 的圓孔，加入 50µl
圖一. RP-46黴菌於MY洋菜培養基培養5天後之生長情形
待測物質，將此培養皿置入30℃培養箱約 20 小時，觀測其抑菌環大 小；抑菌環的測量方式為以孔洞的最外圍為始，單邊量取至透明區域 接觸至始有 Bacillus cereus 生長的區域為終，並以此計算活性。
抑菌環 (mm) ×液體之總體積 (ml) 活性定義= --- 測試抑菌環之液體體積(µl)
三. 薄層色層分析(TLC)
利用 silica gel 60 TLC，以三氯甲烷(chloroform)：甲醇(methanol) = 10：1 比例為展開液，分析各階段產物，並計算其 Rf 值。Rf 值，
即指將原本點滴位置(原點)至色點之距離，除以點滴位置(原點)至展 開液在TLC 板所行的最前端的距離。
第三節 培養基探討 一. 生產天數測定
以MY(1% glucose、0.5% peptone、0.3% malt extract、0.3% yeast extract)培養基培養，作一長時間培養，連續監測其 pH 值變化、顏色 變化以及抗菌物質生成量，找出其最適生長時間。
二.碳源及其濃度的影響
分別加入1%不同碳源至液態基礎培養基(0.5% peptone、0.3%
malt extract、0.3% yeast extract)，對種菌進行培養，測試其抗菌物質 強度，挑出最佳的碳源做不同比例添加，選出最適的添加量。
三.氮源及其濃度的影響
分別加入1%不同氮源至液態基礎培養基(1.5% fructose)，對種菌 進行培養，測其抗菌物質強度，挑出最佳氮源做不同比例添加，選出 最適添加量。
四. 無機鹽類的影響
分別加入0.05%的各種無機鹽類加入液態基礎培養基中，測其抗 菌物質強度，探討其對抗菌物質生成的影響。
第四節 抗菌物質的生產與純化 一.抗菌物質的生產
種菌以固態培養基(MY)培養 5 天後，待其培養基呈現紅色，且 菌絲仍為白色，覆蓋培養基之時，切割約1.5cm x 1.5cm 面積大小，
置入含有最適培養基50 ml 之凹底錐形瓶中培養，以 30℃、轉速 150 rpm 進行培養 6 天後，以濾網過濾菌液，所得之紅色澄清液即為粗萃 取之抗菌物質(crude extract)。
二. 抗菌物質的純化
(1) 三氯甲烷(chloroform)萃取
將抗菌物質原液與 1.5 倍體積的三氯甲烷震盪混合，收集下層(有 機層)。
(2) 減壓濃縮
將以氯仿萃取之有機層，經減壓濃縮趕去氯仿，抽至全乾後， 以 少量之正己烷(hexane)洗下。
(3) Silica gel 60 管柱層析
將正己烷洗下之粉末，通過silica gel 60 管柱，分別以不同比例 之乙酸乙酯(ethyl acetate)與正己烷 (10：3，10：2，10：1)沖洗，再 用三氯甲烷：甲醇= 6：4 沖洗，可沖出一結晶部分，最後以甲醇沖堤；
將自結晶之後，以三氯甲烷：甲醇 = 6：4 所得到的沖洗部分收集起 來，利用減壓濃縮抽乾後，再以甲醇回溶。
(4) LH-20 Gel filtration column
將上述經甲醇回溶的部分，再通過以甲醇溶液混合膠體填充配置 好的LH-20 gel filtration column，column 尺寸為 2.2 cm x 55cm，以甲 醇沖洗之，流速為12 ml/hr，每 10 分鐘收集一管，將收集的各部分
以TLC 片展開。
第五節 抗菌物質的純度
利用silica gel 60 TLC，以三氯甲烷：甲醇 = 10：1 比例為展開 液進行分析，再以25% 硫酸(sulfuric acid)水溶液顯色，並配合抗菌 活性檢測(取 10ml 未凝固約 40~45℃含 MY 之固態培養基，加入 4µl 經約24 小時以 MY 液態培養基培養之 Bacillus cereus 菌液，混合均 勻後倒入培養皿中；待凝固後，在固態培養基上挖9 mm 的圓孔，加 入50µl 待測物質；將此培養皿至入 30℃培養箱約 20 小時，就產物之 抗菌性及純度進行觀察與測量)，證明其活性。
第六節 抗菌物質之性質研究 一. pH 值對抗菌物質之顏色的影響
取過濾後的粗萃取培養菌液，慢慢微量加入 1M NaOH(aq)，以pH meter紀錄經改變後抗菌物質溶液的pH值，並觀察其顏色變化，且於 可見光下測 400~600 nm的波形改變，瞭解在不同pH值的環境下對紅 色抗菌物質的影響。
二. 抗菌物質之萃取溶劑
取 500 µl的過濾後的粗培養菌液置於 1.5 ml 離心管內，加入等體
積的不同有機溶劑，經劇烈震盪，使其充分混合後，分別觀察其有無 分層現象，並將有分層現象的有機層與水層，分別作OD504的測定與 抗菌測試。
三. 抗菌物質之溫度安定性
將較純之抗菌物質，以不同溫度水浴60 分鐘，再做抗菌活性測 試。
四.抗菌物質之有機溶液溶解能力
將較純之抗菌物質100µl，乾燥後分別加入不同有機溶液 200 µl，震盪後靜置 2 小時，再做抗菌活性測試。
五.抗菌物質之最小抑制濃度(MIC)
將抗菌物質(OD504=16)做系列稀釋，取 50µl添加於相同濃度 Staphylococcus aureus菌液培養基中(NAM 950µl)，於 30℃培養箱中，
以150 rpm培養 12 小時，以分光光度計測OD600之吸收值，觀察並紀 錄抗生物質濃度對該菌生長之影響。
六. 抗菌物質之抑制圖譜
取欲測試的不同菌種，置於適合該菌生長之液體培養基中24 小
時，比照活性測試，取4µl 已培養之不同待測菌種之菌液，於 10 ml 該菌之固態培養基中，待其凝固後，在固態培養基上挖取9 mm 的圓 孔，加入50µl 較純之抗菌物質；將此培養皿至入 30℃培養箱約 20 小時，觀測其是否有抑制圈產生，以及抑制圈之大小。
七.抗菌物質之抑制效應
將抗菌物質添加於含Staphylococcus aureus菌液之液態培養基 中，於30℃之培養箱中以 150 rpm培養約 12 小時，以分光光度計測 OD600之吸收值，接著將菌體離心後，以無菌水沖洗數次以除去抗生 物質，重新加入新的培養基，於30℃之培養箱中以 150 rpm培養約 12 小時，再以分光光度計測OD600之吸收值，觀察並紀錄各步驟中，菌 量的變化情形以瞭解抗生物質抗菌方式與特性。
八. 抗菌物質對肉品染色效果
將切片的猪肉片浸置在不同濃度的紅色抗菌溶液 10 ml中，其 OD502值分別為 1~5，浸泡一小時後，取出肉片並靜置數小時，觀察 肉品顏色的轉變並記錄之。
九. 抑菌環與吸光值之對應關係
將經純化後的紅色抗菌物質，以甲醇作稀釋，使其OD504值分別
為0.1~1，取各不同OD504值之各管 50µl，作抗菌實驗，量取其抑菌環 大小。
十. 紅色抗菌物質之固定
將以幾丁寡醣為材質作成的bead 依序分為四組，(1)bead 未處 理，(2) bead 加上紅色抗菌物質，(3)bead 分別加入 glutardialdehyde (1%)以及紅色抗菌物質，(4) bead 分別加入 polyethylenimine (PEI) (4%) 、glutardialdehyde (1%)以及紅色抗菌物質；實驗在加入藥品或 紅色抗菌物質後，皆搖盪一小時使其反應，在觀察其變化。
十一.紅色抗菌物質之固定與時間的關係
以幾丁寡醣材質的bead 分別加入 polyethylenimine (PEI) (4%)、
glutardialdehyde (1%) 以及紅色抗菌物質，但時間分別延長為 2、3、
4 個小時的震盪搖晃反應時間，觀察其固定情況。
十二. 紅色抗菌物質之固定與 pH 值的關係
將已固定紅色抗生素之bead，分別加入 pH 4 及 pH 7 之緩衝溶 液中，觀察其顏色變化。
第七節 LC-MASS 定分子量
將純化所得的紅色抗菌物質，送交高雄大學應化系何永皓老師有 機生化質譜實驗室定其分子量。
第八節 材料 一. 化學試劑
1 以下試藥購自Sigma 公司：
葡萄糖(glucose)、麥芽糖(maltose)、乳糖(lactose)、果醣
（fructose）、纖維素(cellulose)、大豆粉（soybean flour）、
polyethylenimine (PEI)。
2 以下試藥購自Merck 公司：
蔗糖(sucrose)、澱粉(soluble starch)、酪蛋白(casein)、尿素 (urea)、硫酸銨(ammonium sulfate)、異辛烷(isooctane)、丙 酮(acetone) 、甲醇(methanol) 、乙醇(ethanol) 、異丙醇 (2-propanol)、正己烷(n-hexane)、乙酸乙酯（ethyl acetate）、
1-丁烯（ 1-butanol）、氯仿(chloroform) 、氯化鈣(calcium chloride) 、氯化鉀(potassium chloride) 、氯化鈉(sodium chloride)、glutardialdehyde。
3 以下試藥購自Difco 公司：
麥芽抽出物(malt extract)、酵母抽出物(yeast extract)、洋菜 膠(agar)、蛋白萃取物(bacto-peptone)、胰化蛋白(tryptone)、營 養培養液(nutrient broth)及營養洋菜膠(nutrient agar)。
4.以下試藥購自Shcariau 公司 MRS broth
二. 管柱及其材質 1 Column 購自Schott
2 Silica gel 60 TLC 購自Merck 3 LH-20 購自Pharmacia Biotech
三. 菌種
1 Bacillus subtilis 為本實驗室從土壤中篩選之菌株，保存於MY 培養基。
2 Candida albicans CCRC 26512由台北榮民總醫院皮膚科提供，保存 於MY培養基。。
3 Clostridium botulinum ATCC 7928菌種與相關之實驗，由三峽預防醫 學研究所所提供與操作。
4 Escherichia coli ATCC 25922由高雄大學微生物生化實驗室提供保
存於NAM 培養基。
5 Lactobacillus sp.(LP 33)乳酸菌由高雄大學微生物生化實驗室自市 售LP 33優酪乳篩選出，保存於MRS 培養基。
6 Staphylococcus aureus ATCC 29213由高雄大學微生物生化實驗室 提供，保存於NAM 培養基。
Nutrium broth 23.5 g NaCl 0.5%
2 生產用培養基
Fructose 1.5 % Malt extract 1.5 %
第九節 儀器
（一） 分光光度計 BECKMAN COULTER DU 640
（二） 震盪混合器 FISHER SCIENTIFIC VOTEX GENIE 2
（三） 電子天平 METTLER TOLEDO B303-S
（四） 迴旋震盪培養箱 FIRSTEC SCIENTIFIC S306R
（五） 減壓濃縮機 HEIDOLPH CABOROTA 4000
（六） 微量離心機 PANTECH UFO 2100
（七） 超純水製造系統 JIUH HSING INSTRUMENT UPW 100IVS
（八） 製冰機 JIUH HSING INSTRUMENT BREMA ICEMAKERS
（九） 分液收集器 AMERSHAM
（十） 烘箱 CHANNEL
（十一） 乾燥箱 RISEN RHD452
（十二） 高壓滅菌釜 HIRAYAMA HA-300P
（十三） pH METER HORIBA F-52
（十四）微波爐 NATIONAL NE-C30B