RP-46黴菌生產紅色抗菌物質之研究

第一章 序論

第一節 細菌造成的危害 自然界存在著許多的微生物，包含了細菌、真菌、原生動物和微 小的藻類，大多數的微生物對地球生態的平衡有著重大的貢獻，人類 也利用某些微生物的特性作為商業的用途，如丙酮、有機酸、酵素、 醛類和多種藥物，這些化學產品的合成；以及食品工業上，生產醋、 酒類、乳酪製品等，都是藉由微生物所完成。雖然微生物對人類的貢 獻卓越，但不可否認的在環境中，存在一些少數的致病微生物，危害 其他生物，甚至是人類的生命安全與健康。 一些細菌成為病原體，導致了破傷風、傷寒、肺炎、梅毒、霍亂 和肺結核。在植物中，細菌導致葉斑病、火疫病。感染方式包括接觸、 空氣傳播、食物、水和帶菌微生物，所以與其相對應的治療藥物的研 發，便成了刻不容緩的工作，而抗生素也是藥物的開發與應用上，其 中重要的一環。 第二節 抗菌物質的介紹 自Fleming於1928年發現 penicillin 以來，抗菌物質便被廣泛的運 用，目前至少已有一萬多餘種具抗菌生理活性物質見諸於報告中，其 中以Streptomyces 為主的放射線菌所生產的佔60%，而 Aspergillus

及Penicillium 為主的真菌生產佔將近19%，以 Bacillus 為主的細菌 生產約10%的抗菌物質。

抗菌物質，亦稱化學療法劑(chemotherapy agent)使用此等藥物作 為感染症之治療，稱之為化學療法(chemotherapy)或抗菌物質療法 (antibiotic therapy)。化學療法劑除抗生物質外 ，其他如磺胺藥類(sulfa drug)及硝基夫喃誘衍生物(nitrofuran derivative)等非微生物由來之合 成抗菌劑(synthetic chemotherapeutic agent)亦包括在內。抗菌物質之作 用機制，以阻礙細胞壁之合成為主，其他則影響或阻礙細胞質膜、蛋 白質、核酸，以及維生素等之合成。抗菌物質依其分類可分為： 一. Aminoglycosides Aminoglycosides包含了amikacin、gentamicin、kanamycin、neomycin、 netilmicin、paromomycin、streptomycin以及 tobramycin等種類。這一 類的抗菌物質，是藉由結合細菌的30S核糖體次單元，造成t-RNA的 錯讀，使細菌的蛋白質合成機制被抑制，而無法繼續存活。此抗菌物 質的抑菌圖譜相當的廣，主要針對好氧性的革蘭氏陰性菌作用，並對 革蘭氏陽性菌的治療有協同作用(Gmonzalez and Spencer, 1998)，不過 其會破壞內耳耳蝸及前庭感覺表皮，並具有腎毒性(De la Rosa-Galvez

二. β-lactam antibiotics

這類包含了cephalosporins、monobactams、carbapenems、

β-lactamase抑制劑和penicillin衍生物，此類抗菌物質是藉由抑制細菌 的transpeptidase，使細菌細胞壁上的 peptidoglycan 鏈無法相互結 合，造成細菌由於細胞壁的缺損，而導致菌體死亡。原本此類抗菌物 質主要針對革蘭氏陽性菌作用(Farrar and Newsome, 1973)，但由於 β-lactam類抗菌物質的發展，現在對數種革蘭氏陰性菌也有抑制效 果，增大了其抑菌圖譜。 三. Glycopeptide antibiotics 這類型的抗菌物質是近年來發展研究所得，vancomycin 以及 teicoplanin 是這類目前常用的兩種抗菌物質，其具有很高的運用性， 包含了數種方面，針對革蘭氏陽性細菌具有很廣的抑菌圖譜，尤其那 些已對其他抗菌物質具抗藥性的菌，或是與其他的抗菌物質相比，具 有很高的安全性。針對多重抗藥性的細菌而言，這類型的抗生素仍有 很高的發展性(Finch and Eliopoulos, 2005)。

四. Macrolide

此類包含了erythromycin、clarithromycin、azithromycin、

元，阻制t-RNA易位，因而抑制菌體的蛋白質合成 (Gaynor and Mankin, 2003)。Macrolide會累積在白血球內，因此會被確實的送至感染處作 用。 五. Polymyxin 包含了colistin、polymyxin B、surfactin等，其結構上有一環狀胜 肽帶有一長疏水性的鏈，藉由與細菌細胞膜上的磷脂質作用，以瓦解 細菌的結構，使細胞的主要成分外漏，或是使有害物質進入細胞內， 細菌因此失去生理活性(Sud and Feingold, 1970)。其主要針對革蘭氏 陽性桿菌作用，且具有神經毒性與腎毒性。 六. Oxazolidinones Oxazolidinones並非天然之產物，主要是由人工合成的抗菌物 質，linezolid便屬這一類。Oxazolidinones 主要作用在革蘭氏陽性菌 上(Shinabarger, 1999)，其會抑制細菌核糖體蛋白質的合成，但不像其 它抗菌物質只針對核糖體，oxazolidinones 類藉由一種和其它抗菌物 質不同的作用機轉，就是能優先阻止細菌核糖體次單位的分離。它可 以結合50S 核糖體次單位鄰近接觸30S 核糖體（與細菌50S 核糖小 體上的23S 核糖RNA 結合），因此能阻止70S 起始複合體的形成， 此複合體是細菌轉譯過程中必要的物質，其作用機制主要是抑菌而非

殺菌。

七. Quinolones

Quinolones是目前被視為安全又有潛力的抗菌物質，不過還是有 部分的副作用；其主要是抑制細菌的DNA gyrase(Bearden and

Danziger, 2001)，達到抑菌的效果。此類包含了ciprofloxacin、 levofloxacin、norfloxacin、ofloxacin、moxifloxacin、gemifloxicin等。 八. Streptogramins 其機制是藉由結合細菌的 50S核糖體次單元，阻制t-RNA易位， 因而抑制菌體的蛋白質合成，streptogramins包含A、B兩個部份，當 單一一個部分與50S核糖體次單元結合時，是抑制作用，為可逆反 應；當兩個部份都與之結合時，則為毒殺作用，為不可逆反應 (Vannuffel and Cocito, 1996)。

九. Sulfonamides

磺胺劑 (sulfonamides) 是由磺酸 (sulfonic acid) 所衍生出的抗菌 藥物，其為氨基苯甲酸 (para-aminobenzoic acid ，PABA) 的競爭抑 制劑；PABA是dihydropteroate synthetase的受質，而PABA是葉酸的一 部份(Jukes and Broquist, 1963)。因此，磺胺劑利用抑制葉酸的合成， 導致細菌的無法存活。

十. Tetracyclines Tetracyclines是由Streptomyces bacterium所生產，可抗許多細菌的感 染。其會結合細菌的30S核糖體次單元，阻止amino-acyl tRNA連結至 核糖體的A site，抑制易位作用，其為可逆性反應，具有肝毒性(Tritton, 1977)。 第三節 色素簡介 顏色使世界豐富多彩，人們生活在充滿色彩的世界中，也特別偏 愛具有天然色彩的食品。在西元前1500 年的埃及，人們就利用天然 抽出物及酒類的添加，開始對食物著色，以改善糖果的顏色。到了 19 世紀中葉，利用各種辛香料來調色，已相當普遍。至今對於食品 的選擇，人們首先判別的往往是顏色而不是風味。許多食品本身並沒 有顏色，或是經加工後使顏色喪失，於是利用色素賦予其風味、質構 相互協調的色彩，從而使產品更富有吸引力。因此，色素在食品工業 中有著非常重要的作用。 一般食用色素依照來源不同，可分為人工合成色素與天然色素兩 大類。自1856 年 Henry Perkin 合成出第一個人工色素後，至 90 年代 後已出現約80 餘種的人工色素。由於其顏色鮮豔，種類繁多，且成 本低廉，所以當時被廣為使用；但隨著時代的進步，科學家們發現部 分的食品添加劑，諸如：著色劑、安定劑、防腐劑等等，對人體的健

康產生危害，進一步檢驗所有食用色素的安全性，結果發現僅有少數 的人工合成色素不具毒性，故許多人工色素被相繼禁止使用；在美國 僅餘九種人工色素(四種紅色、二種黃色、二種藍色與一種綠色)，日 本則有十一種煤焦系 (coal tar dyes) 色素核可使用(紅色二號、黃色二 號、綠色一號、藍色二號)與七種鋁麗基(aluminum lake)色素(紅色二 號、黃色二號、綠色一號、藍色一號)(田中治夫, 1975)；而我國也僅 餘十五種，包含八種煤焦系色素(紅色六號、紅色七號、紅色四十號、 黃色四號、黃色五號、綠色三號、藍色一號以及藍色二號)，以及七 種鋁麗基色素(紅色七號、紅色四十號、黃色四號、黃色五號、綠色 三號、藍色一號和藍色二號) (行政院衛生署編, 2005)。 隨著對食品添加劑安全性要求的增高，天然色素的使用愈來愈引 起人們的重視。但天然色素的品質不容易控制，一般帶有一些特有的 臭味，且易變色，價格高，因而其發展和使用受到一定的限制。天然 的色素包含了薑黃素(curcumin)、胭脂樹色素(bixin)及花青素 (anthocyanins)，還有 β-胡蘿蔔素(β-carotene)、核黃素(riboflavin)及角 黃素(canthaxanthin)等等，這些有機色素係衍生自天然可食用來源， 經認可的加工過程所得到的食用色素。 一. 類胡蘿蔔素

類胡蘿蔔素是是天然色素中最大的族群，其在自然界廣泛的存 在，現已知結構的類胡蘿蔔素近600 種，柑桔中有 115 餘種。其中含 量最大的四種是岩藻黃素(fucoxanthin)(海藻類生物特有)、葉黃素 (lutein)、堇菜黃素(violaxanthin)和新黃質(neoxanthin)。其他的類胡蘿 蔔素如番茄中的番茄紅(lycopene)、紅辣椒中的辣椒紅(capsanthin）及 辣椒玉紅素(capsorubin）、胭脂樹籽中的胭脂樹籽紅(bixin）等，大部 分的類胡蘿蔔素色素都是由這些來源所製得的。這些類胡蘿蔔素可分 為胡蘿蔔素和葉黃素兩大類﹔胡蘿蔔素是不含氧的類胡蘿蔔素的總 稱，而葉黃素是含氧類胡蘿蔔素的總稱。類胡蘿蔔素是由8 個類異戊 二烯單位組成的一類碳氫化合物及其氧化衍物。基本結構是番茄紅 素，其他類胡蘿蔔素是由其氧化、氫化、脫氫、環化以及碳架重排、 降解而衍生。類胡蘿蔔素在自然界以4 種狀態存在，(a)與糖類結合， (b)與蛋白質結合，(c)以結晶或不定型固態存在溶液或油脂基質中，(d) 以脂肪酸酯類的形態存在(Francis, 2000)。 (1).胭脂樹籽紅(annatto) 胭脂樹籽紅色素又稱紅木素，主要成分為胭脂樹素(bixin)以及 降胭脂樹素(norbixin)，前者為類胡蘿蔔雙羧酸的單甲基酯化物，可溶 於油脂中；後者則為類胡蘿蔔雙羧酸的皂化物，呈水溶性。胭脂樹素

不會受pH值的影響，對熱安定，但在100℃以上的溫度會降解，逐漸 變為黃色，曝露於光線下會使顏色逐漸消失，對氧、金屬及二氧化硫 敏感；降胭脂樹素在酸性溶液中會產生沈澱，與二價鈣離子形成鹽 類，使溶解度降低，對熱安定，對光、金屬、氧氣及二氧化硫等因素 敏感(Preston and Rickard, 1980)。

(2).藏紅花素(saffron) 藏紅花色素是種歷史悠久的天然色素，除了可做為色素外，同時 也是種香辛料。藏紅花色素的顏色呈現純黃色，其色素成分與胭脂樹 籽紅很類似，含有crocetin。此外，由於含有 picrocrocin，因此會產 生苦味。由於分子中含有醣類，使其呈水溶性，是類胡蘿蔔素色素中 少見的水溶性色素。其染色能力很強，通常類胡蘿蔔素的含量越高其 染色力則越好。藏紅花素製品在環境中相當安定，因此是相當良好的 色素(Tsimidou and Tsatsaroni, 1993)。

(3). 辣椒紅（paprika）

辣椒紅又名辣椒紅色素，是用純物理方法從紅辣椒中提取精製而 得的一種食用油狀液體色素。其主要成份為辣椒紅素、辣椒玉紅素和 β－胡蘿蔔素，均屬於類胡蘿蔔素。主要來源為甜椒(capsicum

做為香辛料使用，其安全性高、耐熱、耐光、不受環境pＨ值及金屬 離子影響，但因為許多辣椒品種在色素的應用上都會受到味道辛辣的 影響，因而受到限制(Britton, 1995)。 (4). 蕃茄紅（lycopene） 蕃茄紅是lycopersicon esculentum蕃茄的主要色素，其他尚含有β-胡蘿蔔素及少量的類胡蘿蔔素。蕃茄紅為含40 個碳及 56 個氫之高度 不飽和碳氫化合物(C40H56)，其含有 11 個共軛雙鍵和 2 個非共軛雙 鍵，以直鏈狀排列形成反式(trans-)結構(Pfander, 1992)。由於缺乏-紫 羅酮環(β-ionone ring)，因此不具有維生素A原(Provitamin A)之作用。

其為大量存在於熟透的紅蕃茄中之物質，蕃茄越紅，lycopene就越多。 過去由於蕃茄紅易氧化降解的特性，而難以商業化，現今因為製程的 改善及品種的改良，已商業化成為食用色素之一。Lycopene是人體血 液中含量最高的類胡蘿蔔素，蕃茄紅因β-ionone ring之展開式結構， 使得蕃茄紅是所有類胡蘿蔔素中最有效的單重氧螯合劑，其螯合力為 β-胡蘿蔔素之 2 倍以上。據信有自由基螯合的效應，故具有食用色素 及膳食療養等功能(Shi and Maguer, 2000)。

β-胡蘿蔔素是維生素 A 的前體，油溶性 β-胡蘿蔔素其外觀為棕色 液體，水溶性則為橙黃色粉末；可由胡蘿蔔、藻類及棕櫚油等來源取 得，但天然β-胡蘿蔔素的價格較為昂貴，故目前市面上食用 β-胡蘿 蔔色素的商品，大多數都是來自化學合成品。其耐熱、抗光性一般， 有良好染色力，且對pH 反應穩定(Paust, 1991)。 二. 胭脂蟲紅及胭脂蟲紅素 胭脂蟲紅是從胭脂蟲中的胭脂紅酸裡提取的天然色素，主要色素 是胭脂紅酸，而胭脂蟲紅酸可以與金屬產生螯合作用而成為胭脂蟲紅 素，一般以鋁為主。胭脂蟲紅的染色強度很低，使其在應用上受到限 制；胭脂蟲紅素，其染色強度為胭脂蟲紅酸的兩倍，使用上相當方便。 胭脂蟲紅色素被人類使用已有相當久的歷史，是重要的紅色色素來 源，大部分的胭脂蟲紅色素應用於化妝品工業。其具有相當好的水溶 性，但容易受pH 的影響改變其顏色；於酸性環境下呈橘紅色，在鹼 性溶液中則呈紫色，當pH 處於 5.0 至 7.0 之間時，顏色會很快的轉 成紅色。胭脂蟲紅素可溶於鹼性溶液中，但不溶於酸性溶液中。其 pH 在 4.0 時為紅色，當 pH 為 10.0 時則為藍紅色。胭脂蟲紅對熱、 光線、氧及二氧化硫都很安定(Downham and Collins, 2000)。

紅色的甜菜根在溫帶氣候區是重要的作物之一，其被食用已有數 百年的歷史。甜菜紅色素（betalains）是從食用紅甜菜的甜菜根中提 取，通過浸提、分離、濃縮、乾燥而得到得一種生物鹼類色素，可分 為紅色的betacyanins及黃色的betaxanthins，這兩者成分都為水溶性， 水溶液呈現紅色至紫紅色，在鹼性時溶液呈黃色。一般含有甜菜紅色 素的植物，大多不含花青素。甜菜紅的安定性會受到pH的影響，甜 菜紅水溶液在pH3.0－7.0較穩定，特別是在5.0時穩定性最好。甜菜紅 對熱、氧氣及光線都相當敏感，易造成降解退色作用，使其在應用上 受到部分限制(Schliemann et al., 2001)。 四. 薑黃素 薑黃素是薑黃科植物(curcuma longa)之地下根所含的主要色素， 屬於多酚類化合物，化學名稱bis(4-hydrioxy-3-methoxy-pheny 1)-1, 6-diene-3, 5 dionea， 外觀為橙黃色結晶狀，被用來做為香辛料的歷 史亦相當久遠。薑黃素在酸性環境下呈帶有綠色的檸檬黃色，當pH 提高時，綠色會逐漸退去，於pH9.0以上時，則呈橘黃色；薑黃素對 熱相當安定，可耐烘焙加工，因此被廣泛用作食品染料和防腐劑，並 且由於其具有多種的保健功效，故也被用在醫療保健上，治療多種疾 病。但薑黃素對光線敏感，是其最大的缺點；陽離子的存在，會使其

顏色更趨於橘褐色；二氧化硫會使溶解態薑黃素的顏色變淡，尤其當 濃度高時更加顯著(Dziezak, 1987)。 五. 花青素（Anthocyanins） 花青素(anthocyanins)是構成花瓣和果實顏色的主要色素之一，屬 於植物多酚，包含紅色、藍色及紫色色素，主要來源為果類，以葡萄 為主。目前已發現20種以上的花青素，其中有6種在食品應用上較為 重要，分別為pelargonidin(深紅色)、cyanidin(豔紅色）、delphindin(藍 紫色）、peonidin(玫瑰紅）、petunidin(紫色）及malvidin(淡紫色）等。 花青素分子中存在5種糖類，可和酚酸或脂肪族酸進行基化作用，因 此產生花青素衍生物的種類可達300種以上(Strack and Wray, 1989)。 花青素其顏色會隨pH的變化而改變，在酸性環境中呈紅色，中性和 鹼性溶液中呈紫色到藍色，有類似pH指示劑的功用。花青素耐熱性、 耐光性一般，但在液態溶液中會逐漸氧化，可見花青素易與環境中的 分子作用，保存不易。花青素也會與一些蛋白質反應，使花青素產生 濁霧化或甚至沉澱；酵素處理可能會造成花青素的損失，此主要是葡 萄糖酵素存在所造成的結果。花青素在許多研究中皆證明其不具毒 性，是目前於食品工業中，廣為運用的色素之一(Francis, 2000)。 六. 葉綠素(Chlorophyll)

葉綠素是植物中重要的維生色素，存在於所有能進行光合作用的 植物體中。但由於植物中葉綠素易被破壞，其安定性差，所以其在食 用色素的應用上，受到很大的限制。葉綠素是油溶性的色素，其在酸 性的環境下，很容易產生降解作用。天然萃取物是橄欖綠，其含有一 定量葉黃素和類胡蘿蔔素。而葉綠素對熱和光相對穩定，在中性或鹼 性環境穩定(Boyd, 2000)。 七. 紅麴色素 真菌中紅麴菌的數種菌株可以在多種培養基中生長，產生紅麴色 素。目前除了用以釀造紅露酒及紅糟外，在東南亞各國仍將他當作食 品之著色劑，應用於肉類及醬菜之染色。紅麴菌所產生之紅麴色素主 要有六種，分別是rubropunctamine(紫色) 、monascorubramine(紫色)、 rubropunctatin(紅色)及monascorubin(紅色) 、monasin(黃色)、ankaflavin (黃色) (蘇遠志et al., 1973)。由於紅麴菌在生長及代謝過程中易產生乙 醇、酵素、輔酵素、抗生素、抗低壓素及凝絮劑等物質，因此在做為 食用色素之時，必須避免產生或須加以去除。且紅麴色素是屬於內泌 型的色素，故須打破菌體才能得到色素，造成取得的不易。 近年來，由於消費者意識抬頭，食品衛生安全逐漸被重視，使 得食品添加物的安全性被嚴格監控，在食用色素的使用上，由於人工

色素可能有致癌、變異、造成畸形的隱憂存在，所以在近年來已相繼 被禁止使用。而一些含有重金屬或其他有毒物質的天然色素，也具有 隱藏的危機。相較之下，單純由生物體製造的天然色素，雖然有其缺 點，但因其優點甚多，且多數生物性色素為無害，具附加的藥理或是 營養價值，故在國際對於生物性天然食用色素的開發相當的重視。不 過經動物、植物所生產的天然色素，因為有原料來源、成本價格、以 及生產條件等等因素的影響，使得商品化的過程不易；而以素有生物 的工廠---微生物來取代生產，則一切的問題皆可迎刃而解，故能夠利 用微生物，找到新的生產方式或是新的食用色素，便成了現今相當重 要的課題。 第四節 帶有紅色色素的抗菌物質 一. Actinorhodin Actinorhodin為德國科學家Brockmann，自Streptomyces coelicolor 所得到的色素(Brockmann, 1950)；actinorhodin具有pH指示劑的功能， 在pH值小於8.5以下為紅色，在pH值大於8.5為藍色(Brockmann, 1955)，並具有許多異構物(α-、β-、γ-、δ-、ε- actinorhodin)(Christiansen, 1970)，且有抗菌活性，主要針對革蘭氏陽性菌抑制(Wright and Hopwood, 1976)。

二. Violamycin

Violamycin為一種帶有紅色色素的抗菌物質(Fleck et al., 1974) ，是由Streptomyces 所生產的；是由數種醣苷類組成的物質，主要帶 有六種相關的aglycones結構(Fleck, 1975)。依照不同的糖基的數量， 可分為violamycin A (VA)、violamycin BI (VBI)以及violamycin BII (VBII)。Violamycin會與DNA結合，與DNA反應的強度，依序是VA、 VBII、VBI， 其主要是藉由抑制菌體RNA合成，以達到抑菌的效果。

三. Prodigiosins

Prodigiosins於1929年自Serratia marcescens中被純化出，而其結 構(Wasserman et al., 1960)以及合成過程(Rapoport and Holden, 1962) ，直至1960年代才被確定；其具有pyrrolylpyrromethene (prodiginine) 的中心，與不同的烷基替代物。Prodigiosins為鮮紅色的自然物質，包

含了Serratia marcescens、Pseudomonas magnesiorubra

、

Vibrio

psychroerythrus(Gerber, 1975)、以及兩種革蘭氏陰性海生菌(Gerber and Gauthier, 1979)都會產生這種物質。

Prodigiosins的家族成員都具有抗生素(Boger and Patel, 1988)、抗 瘧疾(Castro, 1967；Kim et al., 1999)、免疫抑制劑以及細胞毒性物質 (Melo et al., 2000；Tsuji et al., 1990；Tsuji et al., 1992)的能力。其功用 相當的多，目前被發現的包括了(1) pH 指示劑，(2) 細胞週期的抑制

劑，(3) 切割DNA，(4) mitogen活化蛋白磷酸酵素的調節劑(Ricardo et al., 2003)。；科學家D’Alessio(1996, 2000)積極的研發新的低毒性的化 合物，主要應用於治療癌症方面，為一新興的抗癌藥物(Montaner et al., 2003；Perez-Tomas et al., 2003)。 四. Hipposudoric acid Hipposudoric acid自河馬的皮下腺(Eltringham, 1999)分泌物所萃 取出，其常存外於河馬的皮膚上，為一紅色色素，其pH值偏鹼性( pH 8.5~10.5)，目前研究發現可抑制Psudomonas aeruginosa 和Klebsiella

pneumoniae兩種致病菌的生長(Yoko et al., 2004)，為一具有抗菌活性 物質；不過，其性質並不穩定。 第五節 研究動機 在西元1958年，美國通過聯邦食品、藥物、化粧品管理法，其中 有所謂狄蘭尼條款(Delaney Clause)，其中明確規範了在任何食品中， 若含有任何致癌物質，經過實驗室以動物或是人體證實，便會被嚴禁 上市。此條款的落實，不僅保障了動物餵養上，飼料添加物的安全性， 也避免含有毒添加物的產品流入市面，危害人類的身體健康。近來， 這個條款受到部分人士的質疑，他們認為隨著檢測儀器的更靈敏，及 理論上各種毒物總有一個臨界量在低於此量的情況下為無害。去年在

參眾兩院全面的支持下，將少數從狄蘭尼條款限制名單中除名，而代 以新的「合理」安全標準，但並無關於有可能危害性的食品添加物被 通過。 在日常生活中，卻存在著一個有致癌危機的食品添加物流通於市 面上—亞硝酸鹽類(nitrite)，這也是長久以來，存在於狄蘭尼條款外的 唯一例外。亞硝酸鹽類常用來作肉類食物防腐及預防肉毒桿菌 (Clostridium botulinum)生長(Engel, 1977)的防腐劑，並有保色功能， 常見的有香腸、臘肉、培根、火腿、熱狗等肉類製品。肉毒桿菌會產 生非蛋白質降解酵素的神經毒素(Sugiyama, 1980)，經實驗發現這種 神經毒素會引發人類或是動物數種組織的病變，包括腦、胰臟、腎上 腺、唾液腺及其他的一些器官(Bohnel and Gessler, 2005)，並有致死的 危險性。 醫學研究發現含亞硝酸鹽食物與含胺類食物合吃，在腸胃中容易 產生亞硝胺(nitrosamines)(Issenberg, 1976)。亞硝胺是一種相當普遍的 致癌物質具有強烈毒性。在動物實驗中，亞硝胺有強烈肝毒性會引起 肝炎、肝硬化、鼻癌、肺癌(Dahl, 1986)，且會造成口腔癌、食道癌、 氣管癌、肝癌及胰臟癌等(Magee, 1996)。食物中的亞硝胺，最主要會 引起腸胃道(Chhabra et al., 1996)及肝臟的癌症。 一直以來，便有許多科學家，找尋能夠在肉類食品中，避免添加

亞硝酸鹽類的方法(Dahle, 1979)。Ｒayman 等人(1981)提出，乳酸鏈球 菌素(nisin)可作為一種有效的替代物，減少火腿中發色劑的用量。乳 酸鏈球菌素是從乳酸鏈球菌發酵產物中提煉的一種多肽抗菌素類物 質，為一種白色易流動的粉末，使用時需溶於水或液體中，是一種世 界公認的安全的天然生物性食品防腐劑和抗菌劑，乳酸鏈球菌素能夠 抑制部分革蘭氏陽性菌的生長，並且乳酸鏈球菌素本身呈酸性，能降 低周圍介質的ｐＨ值，因而能降低殘留的亞硝酸鹽的含量，減少亞硝 胺的形成。雖然其有抑制肉毒桿菌之活性，但其效果有限，且顏色為 白色，需另外添加紅色色素，故未能直接取代亞硝酸鹽類於肉類食品 中扮演的角色。 本實驗室自行篩選出RP-46 黴菌，可分泌大量色素於胞外，此色 素以紅色為主；抗菌活性檢測，偶然間發現此紅色色素針對革蘭氏陽 性菌，具有抑菌活性，為一抗菌物質；進而搜尋先前文獻，未見有由 黴菌生產之紅色抗菌物質發表，遂引起我們的研究興趣，希望能藉由 一連串純化步驟，確定其物性與作用機制，期望能藉由其紅色色素與 抗菌活性兩大特質，有機會能取代目前長期使用於食品中，抑制肉毒 桿菌的亞硝酸鹽類，減少其對人體的傷害；並能藉由開發新型抗生 素，試圖針對目前多種致病菌具有抗藥性，而導致無藥可用的窘況， 解決目前的人類危機。

第六節 研究目的 著重於RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之最適生產時間，與最適培 養基之探討；並藉由單純化培養基，減少其他產物之生成，簡化純化 步驟；再經過一連串的分離純化後，能得到較純之紅色抗菌物質，而 對其相關物性性質與作用機制加以研究，並朝向其結構解析努力，最 後探討其市場運用可能性。

第二章 材料與方法

第一節 菌種來源 RP-46 菌，為本實驗室前人自台北地區篩選保存之菌，於 MY 固體培養基中培養，菌體會產生白色菌絲，成絨毛狀，於三天培養可 明顯看見色素分泌於培養基中，經五天培養可觀察色素充滿整個培養 基，如圖一所示，經型態判定為黴菌(mold)。 第二節 分析方法 一. 紅色物質測定 以分光光度計對紅色物質做全光譜掃描，出現的最大吸收波長值 即為紅色抗菌物質主要吸收波長，在此波長下的吸光值會與抗菌物質 的量成正相關，藉此可對紅色抗菌物質作定量的偵測。經確認紅色吸 收波長為500nm 至 505nm 之間，以 502nm 為吸收最高峰，便以此波 長做為測定抗菌物質之吸收波長。 二. 抗菌活性檢測 取 10ml 未凝固約 40~45℃含 MY 之固態培養基，加入 4µl 經約 24 小時以 MY 液態培養基培養之 Bacillus cereus 菌液，混合均勻後， 倒入培養皿中；待凝固後，在固態培養基上挖9 mm 的圓孔，加入 50µl

待測物質，將此培養皿置入30℃培養箱約 20 小時，觀測其抑菌環大 小；抑菌環的測量方式為以孔洞的最外圍為始，單邊量取至透明區域 接觸至始有 Bacillus cereus 生長的區域為終，並以此計算活性。 抑菌環 (mm) ×液體之總體積 (ml) 活性定義= --- 測試抑菌環之液體體積(µl) 三. 薄層色層分析(TLC)

利用 silica gel 60 TLC，以三氯甲烷(chloroform)：甲醇(methanol) = 10：1 比例為展開液，分析各階段產物，並計算其 Rf 值。Rf 值， 即指將原本點滴位置(原點)至色點之距離，除以點滴位置(原點)至展

開液在TLC 板所行的最前端的距離。

第三節 培養基探討 一. 生產天數測定

以MY(1% glucose、0.5% peptone、0.3% malt extract、0.3% yeast

extract)培養基培養，作一長時間培養，連續監測其 pH 值變化、顏色 變化以及抗菌物質生成量，找出其最適生長時間。

分別加入1%不同碳源至液態基礎培養基(0.5% peptone、0.3% malt extract、0.3% yeast extract)，對種菌進行培養，測試其抗菌物質 強度，挑出最佳的碳源做不同比例添加，選出最適的添加量。 三.氮源及其濃度的影響 分別加入1%不同氮源至液態基礎培養基(1.5% fructose)，對種菌 進行培養，測其抗菌物質強度，挑出最佳氮源做不同比例添加，選出 最適添加量。 四. 無機鹽類的影響 分別加入0.05%的各種無機鹽類加入液態基礎培養基中，測其抗 菌物質強度，探討其對抗菌物質生成的影響。 第四節 抗菌物質的生產與純化 一.抗菌物質的生產 種菌以固態培養基(MY)培養 5 天後，待其培養基呈現紅色，且 菌絲仍為白色，覆蓋培養基之時，切割約1.5cm x 1.5cm 面積大小， 置入含有最適培養基50 ml 之凹底錐形瓶中培養，以 30℃、轉速 150 rpm 進行培養 6 天後，以濾網過濾菌液，所得之紅色澄清液即為粗萃 取之抗菌物質(crude extract)。

二. 抗菌物質的純化 (1) 三氯甲烷(chloroform)萃取 將抗菌物質原液與 1.5 倍體積的三氯甲烷震盪混合，收集下層(有 機層)。 (2) 減壓濃縮 將以氯仿萃取之有機層，經減壓濃縮趕去氯仿，抽至全乾後， 以 少量之正己烷(hexane)洗下。 (3) Silica gel 60 管柱層析 將正己烷洗下之粉末，通過silica gel 60 管柱，分別以不同比例 之乙酸乙酯(ethyl acetate)與正己烷 (10：3，10：2，10：1)沖洗，再 用三氯甲烷：甲醇= 6：4 沖洗，可沖出一結晶部分，最後以甲醇沖堤； 將自結晶之後，以三氯甲烷：甲醇 = 6：4 所得到的沖洗部分收集起 來，利用減壓濃縮抽乾後，再以甲醇回溶。

(4) LH-20 Gel filtration column

將上述經甲醇回溶的部分，再通過以甲醇溶液混合膠體填充配置

好的LH-20 gel filtration column，column 尺寸為 2.2 cm x 55cm，以甲

以TLC 片展開。 第五節 抗菌物質的純度 利用silica gel 60 TLC，以三氯甲烷：甲醇 = 10：1 比例為展開 液進行分析，再以25% 硫酸(sulfuric acid)水溶液顯色，並配合抗菌 活性檢測(取 10ml 未凝固約 40~45℃含 MY 之固態培養基，加入 4µl 經約24 小時以 MY 液態培養基培養之 Bacillus cereus 菌液，混合均 勻後倒入培養皿中；待凝固後，在固態培養基上挖9 mm 的圓孔，加 入50µl 待測物質；將此培養皿至入 30℃培養箱約 20 小時，就產物之 抗菌性及純度進行觀察與測量)，證明其活性。 第六節 抗菌物質之性質研究 一. pH 值對抗菌物質之顏色的影響 取過濾後的粗萃取培養菌液，慢慢微量加入 1M NaOH(aq)，以pH meter紀錄經改變後抗菌物質溶液的pH值，並觀察其顏色變化，且於 可見光下測 400~600 nm的波形改變，瞭解在不同pH值的環境下對紅 色抗菌物質的影響。 二. 抗菌物質之萃取溶劑 取 500 µl的過濾後的粗培養菌液置於 1.5 ml 離心管內，加入等體

積的不同有機溶劑，經劇烈震盪，使其充分混合後，分別觀察其有無 分層現象，並將有分層現象的有機層與水層，分別作OD504的測定與 抗菌測試。 三. 抗菌物質之溫度安定性 將較純之抗菌物質，以不同溫度水浴60 分鐘，再做抗菌活性測 試。 四.抗菌物質之有機溶液溶解能力 將較純之抗菌物質100µl，乾燥後分別加入不同有機溶液 200 µl，震盪後靜置 2 小時，再做抗菌活性測試。 五.抗菌物質之最小抑制濃度(MIC) 將抗菌物質(OD504=16)做系列稀釋，取 50µl添加於相同濃度 Staphylococcus aureus菌液培養基中(NAM 950µl)，於 30℃培養箱中， 以150 rpm培養 12 小時，以分光光度計測OD600之吸收值，觀察並紀 錄抗生物質濃度對該菌生長之影響。 六. 抗菌物質之抑制圖譜 取欲測試的不同菌種，置於適合該菌生長之液體培養基中24 小

時，比照活性測試，取4µl 已培養之不同待測菌種之菌液，於 10 ml 該菌之固態培養基中，待其凝固後，在固態培養基上挖取9 mm 的圓 孔，加入50µl 較純之抗菌物質；將此培養皿至入 30℃培養箱約 20 小時，觀測其是否有抑制圈產生，以及抑制圈之大小。 七.抗菌物質之抑制效應 將抗菌物質添加於含Staphylococcus aureus菌液之液態培養基 中，於30℃之培養箱中以 150 rpm培養約 12 小時，以分光光度計測 OD600之吸收值，接著將菌體離心後，以無菌水沖洗數次以除去抗生 物質，重新加入新的培養基，於30℃之培養箱中以 150 rpm培養約 12 小時，再以分光光度計測OD600之吸收值，觀察並紀錄各步驟中，菌 量的變化情形以瞭解抗生物質抗菌方式與特性。 八. 抗菌物質對肉品染色效果 將切片的猪肉片浸置在不同濃度的紅色抗菌溶液 10 ml中，其 OD502值分別為 1~5，浸泡一小時後，取出肉片並靜置數小時，觀察 肉品顏色的轉變並記錄之。 九. 抑菌環與吸光值之對應關係 將經純化後的紅色抗菌物質，以甲醇作稀釋，使其OD504值分別

為0.1~1，取各不同OD504值之各管 50µl，作抗菌實驗，量取其抑菌環

大小。

十. 紅色抗菌物質之固定

將以幾丁寡醣為材質作成的bead 依序分為四組，(1)bead 未處

理，(2) bead 加上紅色抗菌物質，(3)bead 分別加入 glutardialdehyde (1%)以及紅色抗菌物質，(4) bead 分別加入 polyethylenimine (PEI) (4%) 、glutardialdehyde (1%)以及紅色抗菌物質；實驗在加入藥品或 紅色抗菌物質後，皆搖盪一小時使其反應，在觀察其變化。

十一.紅色抗菌物質之固定與時間的關係

以幾丁寡醣材質的bead 分別加入 polyethylenimine (PEI) (4%)、

glutardialdehyde (1%) 以及紅色抗菌物質，但時間分別延長為 2、3、 4 個小時的震盪搖晃反應時間，觀察其固定情況。 十二. 紅色抗菌物質之固定與 pH 值的關係 將已固定紅色抗生素之bead，分別加入 pH 4 及 pH 7 之緩衝溶 液中，觀察其顏色變化。 第七節 LC-MASS 定分子量

將純化所得的紅色抗菌物質，送交高雄大學應化系何永皓老師有 機生化質譜實驗室定其分子量。 第八節 材料 一. 化學試劑 1 以下試藥購自Sigma 公司： 葡萄糖(glucose)、麥芽糖(maltose)、乳糖(lactose)、果醣 （fructose）、纖維素(cellulose)、大豆粉（soybean flour）、 polyethylenimine (PEI)。 2 以下試藥購自Merck 公司： 蔗糖(sucrose)、澱粉(soluble starch)、酪蛋白(casein)、尿素 (urea)、硫酸銨(ammonium sulfate)、異辛烷(isooctane)、丙 酮(acetone) 、甲醇(methanol) 、乙醇(ethanol) 、異丙醇 (2-propanol)、正己烷(n-hexane)、乙酸乙酯（ethyl acetate）、 1-丁烯（ 1-butanol）、氯仿(chloroform) 、氯化鈣(calcium chloride) 、氯化鉀(potassium chloride) 、氯化鈉(sodium chloride)、glutardialdehyde。

麥芽抽出物(malt extract)、酵母抽出物(yeast extract)、洋菜 膠(agar)、蛋白萃取物(bacto-peptone)、胰化蛋白(tryptone)、營 養培養液(nutrient broth)及營養洋菜膠(nutrient agar)。

4.以下試藥購自Shcariau 公司 MRS broth

二. 管柱及其材質 1 Column 購自Schott

2 Silica gel 60 TLC 購自Merck 3 LH-20 購自Pharmacia Biotech

三. 菌種

1 Bacillus subtilis 為本實驗室從土壤中篩選之菌株，保存於MY 培養基。

2 Candida albicans CCRC 26512由台北榮民總醫院皮膚科提供，保存 於MY培養基。。

3 Clostridium botulinum ATCC 7928菌種與相關之實驗，由三峽預防醫 學研究所所提供與操作。

存於NAM 培養基。

5 Lactobacillus sp.(LP 33)乳酸菌由高雄大學微生物生化實驗室自市 售LP 33優酪乳篩選出，保存於MRS 培養基。

6 Staphylococcus aureus ATCC 29213由高雄大學微生物生化實驗室 提供，保存於NAM 培養基。 四. 培養基 1. 菌種保存用固態培養基(MY plate) Glucose 1.0 % Yeast extract 0.3 % Malt extract 0.3 % Peptone 0.5 % Agar 1.5 % 2. MRS 培養基 MRS broth 52 g 3. NAM 培養基 Nutrium broth 23.5 g NaCl 0.5% 2 生產用培養基

Fructose 1.5 % Malt extract 1.5 %

第九節 儀器

（一） 分光光度計 BECKMAN COULTER DU 640

（二） 震盪混合器 FISHER SCIENTIFIC VOTEX GENIE 2 （三） 電子天平 METTLER TOLEDO B303-S

（四） 迴旋震盪培養箱 FIRSTEC SCIENTIFIC S306R （五） 減壓濃縮機 HEIDOLPH CABOROTA 4000 （六） 微量離心機 PANTECH UFO 2100

（七） 超純水製造系統 JIUH HSING INSTRUMENT UPW 100IVS

（八） 製冰機 JIUH HSING INSTRUMENT BREMA ICEMAKERS

（九） 分液收集器 AMERSHAM （十） 烘箱 CHANNEL （十一） 乾燥箱 RISEN RHD452 （十二） 高壓滅菌釜 HIRAYAMA HA-300P （十三） pH METER HORIBA F-52 （十四）微波爐 NATIONAL NE-C30B

第三章 結果與討論

第一節 抑菌活性分析方法 一. 紅色物質測定 由於每種色素皆有其獨特之吸收光譜，故藉其光譜的特徵可作為 色素定量分析之用。如圖二所示，此色素共有三個波峰，其波長分別 為：416 nm、502nm、541nm；最大吸收波長為 500nm-505nm 之間， 利用此色素之光譜特性，可藉此定量色素。 二. 抗菌活性檢測 如圖三所示，進行抗菌實驗檢測時，由於抑菌環之大小會受到抗 菌物質的量及檢測菌濃度的影響。本實驗所用的測量方式，是直接在 固態培養基上挖取直徑9 mm 大小的孔洞，於孔洞中加入待測的抗菌 物質；抑菌環大小是以孔洞外圍至抑菌環外環來計算。 三. 薄層色層分析(TLC) 利用 silica gel 60 TLC，以三氯甲烷：甲醇 = 10：1 比例為展 開液，分析各階段產物。如圖四所示，其排列由上至下依序是橙色、 紅色、紫色，顯示其極性以紫色最強，紅色次之，而橙色較偏非極性； 其Rf 值分別為：紫色為 0，紅色為 0.47，而橙色為 0.54。

圖二. RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質菌液之吸收光譜

以分光光度計對紅色物質做全光譜掃描，出現的最大吸收波長值 即為紅色抗菌物質主要吸收波長，經確認紅色吸收波長為 500nm 至 505nm 之間，以 502nm 為吸收最高峰，便以此波長做為測定抗菌物質 之吸收波長。

圖三. RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之抑菌環 取 10ml 未凝固約 40~45℃含 MY 之固態培養基，加入 4μl 之

Bacillus cereus

菌液，倒入培養皿中；待凝固後，在固態培養基上 挖 9 mm 的圓孔，加入 50μ 待測物質，將此培養皿置入 30℃培養箱 約 20 小時，觀測其抑菌環大小；抑菌環(雙箭號)的測量方式為以孔 洞的最外圍為始，單邊量取至透明區域接觸至始有

Bacillus cereus

生長的區域為終。

圖四. RP-46黴菌生產紅色抗菌物質薄層色層分析圖

第二節 培養基探討 在實驗初期是將RP-46黴菌培養在MY固態培養基上，且生長情 形良好，於是抗菌物質生產初期便是以MY液態培養基進行生產，且 有不錯的生產量。但隨著培養時間的增加，培養液的顏色由橙色、紅 色漸漸轉變為紫色，甚至轉變為黑紫色；顯見培養液中具有複雜的成 分。有鑒於培養基的複雜將嚴重影響後續的純化步驟，故在不減少產 量的前提下，決定更進一步尋找其最佳的生產條件，盼能在純化流程 上使其更簡單。故利用異於MY培養基的生長條件，使此RP-46黴菌 在生長過程的培養液顏色變化固定在紅色階段，使培養基可以維持在 更簡化的狀態下，兼具利於純化與減少成本的兩大優點。 一. 抗菌物質之生產天數測定與 pH 的改變 透過吸光值測量與抗菌活性測試，連續監測培養液的變化，決定 抗菌物質最大產量的培養天數。如圖五所示，此培養液伴隨著天數的 增加吸光值不斷改變，且在第六天出現最大值；再對照抗菌活性的結 果，亦在第六天有最好的抗菌活性表現。比對吸光值與抗菌活性的變 化，可判斷此抗菌物質的產量與抗菌活性成正比，故在第六天出現最 大產量與最佳抗菌活性。再觀察整個培養過程 pH 的變化，由一開始 培養基未加入菌體時為6，在加入菌體培養兩天後微量下降至最低約

OD502

Clear zone size (mm) pH 12 圖五. RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質的生產週期 將RP-46 黴菌培養於MY液態培養基中，以 150 rpm震盪、於 30℃ 下培養；每天測量其OD502、抑菌環與pH值。 pH 12 Clear zon e si ze (mm) 10 10 8 8 50 2 6 6 OD 4 4 2 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Time(Day)

5，爾後隨著培養天數的增加 pH 開始持續上升，至第九天時 pH 可高 達8，藉此可判斷菌體在生長過程中會釋放具弱鹼性的代謝物質，使 培養液由弱酸性轉化為弱鹼性。 二. 碳源及其濃度的影響 如表一所示，不同碳源對抗菌物質生成的影響中，以葡萄糖、蔗 糖與果糖有較好的培養效果，而麥芽糖、乳糖、纖維素及澱粉則無助 益，尤其以纖維素為最差，並沒有具活性的抗菌物質生成。此外，在 不添加任何碳源時，亦沒有抗菌性質的表現，經由這點可看出碳源對 於抗菌物質生成具極大影響，而且是不可或缺的成分。其中在葡萄 糖、蔗糖與果糖選用的比較上，我們利用較少體積的抗菌物質，去作 抑菌環的測試，相較之下，果糖作為碳源的培養基，可以得到相對較 好的效果，所以選用果糖作為培養基中的碳源成分。再進一步檢討果 糖的添加濃度，如表二所示，1.5%果糖的培養基所生產的抗菌物質， 相較之下有不錯的活性，而更高濃度的果糖未有更好的生產效果，於 是選用1.5%果糖作為最適碳源的添加濃度。 三. 氮源及其濃度的影響 由於此抗菌物質的生產，會隨著天數的增加，伴隨著顏色漸漸由 淺入深，由早期的橙色、紅色、紫色、至晚期逐漸成為黑紫色，在改

表一. 碳源種類對 RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之影響

Carbon sources (1%) OD502 Clear zone size (mm)

None 1.1 0 Cellulose 1.1 0 Fructose 10.0 10 Glucose 8.6 10 Lactose 2.2 5 Maltose 5.6 8 Starch 5.3 8 Sucrose 8.5 10

基礎培養液：0.5% peptone, 0.3% malt extract 和 0.3% yeast extract 培養條件 : 於 30℃下震盪培養 6 天

抑菌環 (mm) ：每個樣本各取 50μl 粗培養液作抗菌活性測試，並測 量其抑菌環

OD502：每個樣本之培養液經 10 倍稀釋後，以分光光度計測量 502 nm

表二. 果糖濃度對 RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之影響

Fructose conc.(%) OD502 Clear zone size (mm)

0 0.5 0 0.5 7.4 6 1.0 9.6 10 1.5 10.6 10.5 2.0 9.2 10 2.5 8.7 10 3.0 8.7 10

基礎培養液：0.5% peptone, 0.3% malt extract 以及 0.3% yeast extract.

變碳源後，對此現象亦無太大改善，故我們便著手於改變氮源，試圖 改變此現象。如表三所示，不同碳源對抗菌物質生成的影響中，以麥 芽抽出物、酵母抽出物、蛋白萃取物皆有不錯的培養效果，但觀察其 培養基之顏色，酵母抽出物與蛋白萃取物為氮源的培養液皆有變紫的 現象；而以麥芽抽出物培養的培養液，則可維持呈現紅色，於是便選 擇麥芽抽出物作為培養基中的氮源。再進一步檢討麥芽抽出物的添加 濃度，如表四所示，1.5%的麥芽抽出物的培養基所生產的抗菌物質， 相較之下可有相當高的活性，於是選用1.5%的麥芽抽出物作為最適氮 源的添加濃度。 四. 無機鹽類的影響 由於金屬離子常在細胞的生理上具重要的功能，故實驗中亦經由 無機鹽類的添加，期盼RP-46 黴菌能將其加以利用，並促進抗菌物質 的生成。然而如表五所顯示，添加無機鹽類的實驗結果卻不盡理想， 大部分的無機鹽類都僅能維持原有的抗菌活性表現，而氯化鐵、氯化 錳以及氯化鋅，更是對抗菌物質的生產有負面的影響；就整體來看， 不添加何無機鹽類的培養基，在抗菌物質的生產上有較好的效果；依 照本實驗的實驗結果，我們決定了生產RP-46 抗菌物質的培養基，並 不需要無機鹽類的添加。

表三. 氮源種類對 RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之影響

Nitrogen sources (0.5%) OD502 Clear zone size (mm)

Ammonium sulfate 0.3 1 Casien 5.5 9 Malt extract 5.9 10 None 2.8 9 Peptone 3.0 9 Soybean 2.3 8 Tryptone 5.5 10 Urea 0.3 0 Yeast Extract 6.2 10 基礎培養基：1.5% fructose. 培養條件 : 於 30℃下震盪培養 6 天

表四. 麥芽抽出物濃度對 RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之影響

Malt Extract conc.(%) OD502 Clear zone size(mm)

0 5.2 9 0.25 6.8 9 0.50 6.2 10 0.75 6.6 10 1.00 7.7 10 1.25 8.2 10 1.50 9.8 10.5 2.00 9.0 10.5 2.50 8.7 10.5 3.00 8.6 10.5 基礎培養基：1.5% fructose. 培養條件 : 於 30℃下震盪培養 6 天

表五. 無機鹽種類對 RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之影響 Inorganic salts sources

(0.05%)

OD502 Clear zone size

(mm) None 9.6 10.5 CaCl2 5.0 8.0 FeCl3 0.7 0 KCl 6.0 8.0 MgCl2 4.6 7.5 MnCl2 0.9 3.0 NaCl 8.0 10 ZnCl2 0.4 0

基礎培養基：1.5% fructose 1.5% malt extract 培養條件 : 於 30℃下震盪培養 6 天

藉由前面一連串培養基探討的實驗，我們選擇了 1.5%果糖 1.5% 麥芽抽出物的組合，作為RP-46 抗菌物質的最適生產培養基；在最適 培養基與MY 培養基比較上，就抗菌物質的活性而言，最適培養基所 生產的抗菌物質活性，比利用 MY 培養基生產的略高；但菌液在培養 基經過培養後之顏色外觀上，卻有顯著的不同；MY 培養基經大約 6 天培養後，顏色會逐漸形成黑紫色的外觀，而最適培養基經6 天培養 後的顏色，則仍為紅色。如圖六所示，將兩者生產的粗培養液，以相 同的體積在TLC 片上展開，我們可以觀察到，最適培養基所生產的 物質，不論是上方橙色的部分，或是原點的紫色部分，都比利用MY 培養基所生產的減少了許多，而中間紅色部分的量差別並不大。故我 們藉由培養基的探討，並沒有因此減少紅色抗菌物質的產量，反而讓 它的活性增高，且成功的減少了其他不必要物質的生成，方便我們後 續純化此紅色抗菌物質的進行。有鑑於此，此培養基確定於生產階段 所用。 除此之外，改變培養基成分的結果，也使得原本於MY 培養基中 會呈現黑紫色，甚至渾濁狀態的抗菌物質液，因為成分的單純化而呈 現單一紅色，使得我們後續的純化工作較易進行；由粗培養液的pH 值結果來推測，相較於原始的 MY 培養基，最適培養基培養 6 天所生 產的粗培養液，其pH 值約在 4.65 左右，而以 MY 培養基同樣時間生

A B

圖六. 不同培養基對 RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之薄層色層分析 圖

A：1.5% fructose 與 1.5% malt extract 培養基； B：MY 培養基

產出的粗培養液，其pH 值接近 6.5 左右，可能是因為 MY 其中含的 蛋白酮與酵母抽出物，經RP-46 黴菌作用後，所產生的代謝產物會造 成培養液偏向中性，部分的影響了培養液的顏色外觀；另一可能是， 蛋白酮與酵母抽出物這兩種物質，含有某種成分，會促使紅色抗菌物 質結構發生改變，而產生紫色的外觀；以上這兩點，都需要等結構解 析出才能證實。 第三節 抗菌物質的生產及純化 一. 抗菌物質生產 以1.5 %的果糖及 1.5 %的麥芽抽出物為最適生產培養基，以 30℃、轉速 150 rpm 進行培養 6 天。其粗抗菌物質活性相當穩定，純 化初期50µl 即有約 10 mm 的活性表現，此抗菌物質的活性算是相當 高，此亦為其未來應用上的優勢。 二. 抗菌物質之純化 (1) 三氯甲烷萃取 收集經6 天培養後之菌液，利用濾網過濾所得之澄清液置於分液 漏斗內，以1.5 倍體積三氯甲烷分批震盪混合，發現有類油脂物含於 中間混合層中，而紅色部分被萃取至下層(有機層)，上層(水層)則呈 現咖啡色，靜置後收集下層紅色的部分，並利用多個分液漏斗過濾，

去除油脂物，避免污染紅色的有機層部分。 (2) 減壓濃縮 將以三氯甲烷萃取之有機層，經減壓濃縮趕去三氯甲烷，抽至全 乾後，以少量之正己烷洗下，此時抗菌物質為不溶解狀態，呈現粉末 的現象；久置後，會沉澱於底部；與粗培養液相比，回收率為78%。 (3) Silica gel 60 管柱層析 將正己烷洗下之粉末，通過玻璃管柱，分別以不同比例之乙酸乙 酯與正己烷 (10：3，10：2，10：1)沖洗，在乙酸乙酯：正己烷 = 10： 3 時，可見到黃色部分緩緩自頂部往下層移動，等黃色部分流至底部 時，再更換溶劑為 10：2 之比例，此時黃色部分會全部流出，而另一 橘色部分會往底部流動，待其到達底部時，更換溶劑為10：1，讓橘 色部分完全流出，再用三氯甲烷：甲醇 = 6：4 沖洗，此時可觀察到 一紅色部分緩緩下降，當其流至底部時，有一些結晶物質流出，將這 些結晶物連同些許液體另外保存，待全部紅色液體流完後，顏色會逐 漸變淡；最後以甲醇沖洗，可得一紫色溶液，將自結晶之後所得到的 三氯甲烷：甲醇 = 6：4 沖洗部分收集起來，利用減壓濃縮抽乾後， 再以甲醇回溶，回收率為45%。

(4) LH-20 gel filtration column

將上述經甲醇回溶的部分，再通過以甲醇溶液混合膠體填充配置

好的LH-20 gel filtration column，並以甲醇沖洗之。隨著甲醇的流動

不斷將產物往下帶，玻璃柱內會出現三種色帶，如圖七所示，由上至 下分別為紅色、淡黃色、紫色，因此可由此純化方式分離得到三種不 同顏色之色素產物，且與上一純化步驟之色素顏色出現的排列有異， 故可藉此判斷出三種色素分子的大小並非與極性大小相關，如表六所 示，總回收率為31%。 純化上，我們先以三氯甲烷與粗培養液混合作分層萃取，以除去 其他的雜質，經由減壓濃縮以更換有機溶劑為正己烷，再通過silica gel 60 管柱層析，此過程可得一紅色結晶與部份純化之紅色抗菌物質 液，此現象可說相當的罕見；之後將部份純化之紅色抗菌物質液通過 Sephadex LH-20 膠體過濾管柱，於有色素流出的後期，可得一活性頗 高的紅色物質，由流出的順序判定，此紅色物質的分子應在較大的範 圍。 第四節 抗菌物質的純度 將以上各純化步驟所得之抗菌物質，利用 silica gel 60 TLC，以三 氯甲烷：甲醇 = 10：1 比例為展開液進行分析，展開後作不同處理 ， 以25% 硫酸水溶液顯色和抗菌活性檢測。如圖八所示，其為單一物

表六. RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之純化表 Step Total volume (ml) Total activity (mm) Yield (%) Crude extract 1000 11000 100 Chloroform extract 750 8625 78

Silica gel column 500 5000 45

LH-20 gel filtration column 230 3410 31 各步驟所得液體之抑菌環 (mm) ×液體之體積 (ml) 回收率(%) = ---× 100 粗培養液之抑菌環(mm) × 粗培養液之體積 (ml)

圖七. 利用 LH-20 分子篩管柱純化紅色抗菌物質照片圖 箭頭標示甲醇之流向

A B C

圖八. RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質純度與抗菌活性薄層色層分析圖 A：25% 硫酸水溶液處理；B：純化後之紅色抗菌物質；C：抗菌 活性分析。(TLC 展開液為三氯甲烷：甲醇 = 10：1)

質，並無其他物質被顯現出來；且未經過處理的 TLC 片在抗菌活性 檢測上，出現明顯抗菌區塊，其抗菌位置即為紅色抗菌物質的位置所

在。在相互比對下，可確定該抗菌物質已被成功自RP-46 黴菌生成的

菌液中單離出來。故說明經此純化過程，可完全純化出此一紅色抗菌 物質，並也證明了此一抗菌物質帶有紅色色素外觀。

而自silica gel column 得到的紅色結晶，經長時間靜置，如圖九

所示，可得一紅色三角形之晶體結構，經甲醇溶解，利用silica gel 60 TLC，以三氯甲烷：甲醇= 10：1 比例為展開液進行分析，亦可得 一紅色單一區塊，而我們發現在UV 光下，其也有吸收波長，如圖十 所示，在OD365時，亦僅看到單一螢光區塊，與肉眼看到的紅色區塊 位置相同，顯示紅色結晶物質是純度相當高的紅色抗菌物質。 第五節 抗菌物質之性質研究 一. 抗菌物質之 pH 值對顏色的影響 取過濾後的粗培養菌液，慢慢微量加入1M NaOH (aq)，紀錄改變 後抗菌物質溶液的pH 值，並觀察其顏色，於可見光下測 400~600 nm 的波形，瞭解在不同 pH 值的環境下抗菌物質的變化。結果如圖十一 所示，原抗菌物質液其pH 值約 4.65，隨著 pH 值的增加，當 pH 值 為7 時，顏色逐漸自紅色加深為深紅色，待 pH 值為 8.5 時，此時完

圖十. 紅色結晶液之薄層色層分析圖

TLC 展開液為三氯甲烷：甲醇 = 10：1，以 365nm 照射分析

全呈現紫色的外觀；隨後pH值的持續升高，使抗菌物質液由淺紫變 為深紫，最後呈現渾濁的黑紫色；而最大吸收峰值，也由原先的502 nm，隨著pH值的升高，以及顏色的改變，漸漸移轉為 541nm；證明 本紅色抗菌物質在不同的pH值下會呈現不同的外觀顏色，與不同的 吸收波長；再利用1 M HCl (aq)滴定回至中性、酸性，則顏色又依序恢 復至先前的淺紫色、最後回紅色的外觀，故判斷本紅色抗菌物質具有 作為pH值指示劑的應用潛力。 二. 不同有機溶劑對抗菌物質的萃取能力 取500 µl的過濾後的粗培養菌液置於 1.5 ml 離心管內，加入等體 積的不同有機溶劑，經劇烈震盪，使其充分混合後，分別觀察其有無 分層現象，並將有分層現象的有機層與水層，分別作OD504的測定與 抗菌測試。於本實驗中，除了戊醇(amyl alcohol)、丁醇(butanol)、三 氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、異辛烷(isooctane)這幾種有機溶劑可與 菌液產生分層的現象，其他的有機溶劑則會與菌液混合；如表七所 示，其中，僅有戊醇、丁醇、三氯甲烷、乙酸乙酯這些有機溶劑，可 將紅色抗菌物質萃取至於有機層，其中戊醇、丁醇這兩種有機溶劑有 較好之萃取效果。 就以有機溶劑分層萃取而言，我們的作法是利用 1.5 倍體積的三

表七. 不同有機溶劑對 RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之萃取能力

Solvent Solvent layer

(mm) Aqua layer (mm) OD504 Amyl alcohol* 25 5 5.808 Butanol* 13 7 6.566 Chloroform 11 5 5.171 Ethyl acetate 9 8 5.379 Hexane 0 11 — Isooctane 0 12 — *代表此有機溶劑本身即有抗菌活性 將 RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質與各種有機溶劑以等體積震 盪混合，並取 50μl 有機層與水層溶液作抗菌實驗，並測量其抑菌 環；OD504 nm：將各個有機層樣本經 10 倍稀釋後，以分光光度計測 量 504 nm 之吸收值，表內數值為吸收值乘以 10 倍之推算值。

氯甲烷作萃取，但就後來的有機溶劑分層萃取的實驗來看，相較於三 氯甲烷，戊醇以及丁醇都有較好的萃取能力，但由於這兩種有機溶劑 都具有很強的殺菌能力，其抑菌環皆超過1 cm 以上，為避免干擾實 驗數據，故以三氯甲烷作為純化過程中，萃取用的有機溶劑，但若以 量的觀點而言，未來可用戊醇或是丁醇，以提高回收率。 三. 抗菌物質之溫度安定性 將較純之抗菌物質，各以不同溫度水浴60 分鐘，再做抗菌活性 測試。結果圖十二所示，此抗菌物質即使在100℃的環境下，仍具有 高達87%的抗菌活性(相較於室溫環境)，故此抗菌物質具有相當良好 的耐熱性。 四.抗菌物質之有機溶液溶解能力 將較純之抗菌物質100µl，乾燥後分別加入不同有機溶液 200 µl，震盪後靜置 2 小時，再做抗菌活性測試。結果如表八所示，觀 察此抗菌物質對不同有機溶劑的溶解度，發現在甲醇中有較明顯的溶 解狀況，丙酮(acetone)次之，而其他有機溶劑的溶解狀況都不顯著， 甚至完全不溶。再比較各抗菌活性的檢測結果，此抗菌物質同樣在甲 醇中出現較好的抗菌活性，丙酮次之，而戊醇、丁醇雖然有不錯的抗 菌活性，但推測是因為溶劑本身的抗菌性質與較低的表面張力所造

表八. 不同有機溶劑對 RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之溶解能力

Solvent Solubility Clear zone size (mm)

Acetone ++++ 8 Acetonitrile* +++ 6.5 Amyl alcohol* + 17 Butanol* + 8 Chloroform - 2 Ethyl acetate +++ 1.5 Ethanol* ++ 0.5 Hexane - 0 Isooctane - 0 Isopropanol* - 1 Methanol +++++ 10 Water +++ 2.5 *代表此有機溶劑本身即有抗菌活性 將 100μl RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質溶液風乾後，加入各種 有機溶劑 200μl 震盪混合；靜置 2 小時後，觀察其溶解情形，並取 50μl 溶液作抗菌實驗，並測量其抑菌環。

0% 20% 40% 60% 80% 100% 30℃ 40℃ 50℃ 60℃ 70℃ 80℃ 90℃ 100℃ Temperature P er cen ta ge o f cl ear zo ne s iz e 圖十二. 紅色抗菌物質的熱安定性 將RP-46黴菌生產紅色抗菌物質在不同溫度下水浴1小時，之後取 50μl溶液作抗菌實驗，測量其抑菌環，以室溫之抑菌活性為100%。

成。就結果顯示此抗菌物質易溶於甲醇溶液中且不被破壞其抗菌活 性，故推斷其為較偏極性之物質。 五.抗菌物質之最小抑制濃度(MIC) 純化之紅色抗菌物質連續稀釋後，分別添加於含1µl OD600為0.1 之Staphylococcus sp.菌液培養基中(NAM 950µl)，培養12小時後測 OD600，結果如圖十三所示，於紅色抗菌物質稀釋8倍時，其OD600 有 略微上升之趨勢，表示紅色抗菌物質對於Staphylococcus aureus 開始 不具抑制效果，在稀釋32倍後，Staphylococcus aureus 的菌量趨於平 緩，故最小抑制濃度應在稀釋8倍時的紅色抗菌活性濃度。 六.抗菌物質之抑制圖譜(spectrum) 藉由抗菌活性測試，比較抗菌物質對不同菌種的抗菌能力，用以 瞭解其抑制菌種的種類及是否具專一性。結果如表九所示，此抗菌物 質在實驗中僅對枯草桿菌、葡萄球菌、肉毒桿菌(圖十四)及乳酸菌有 明顯抑制作用，其他測試的菌種則不被抑制。綜合本實驗結果，判斷 此抗菌物質主要對革蘭氏陽性菌有專一性的抑制生長能力。 七. 抗菌物質之抑制效應 本實驗利用回覆性方式探討，瞭解此抗菌物質之抗菌特性是屬於

表九. RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之抑菌圖譜

Strain Antibiotic activity (mm)

Gram(+) bacteria Bacillus sp.

Staphylococcus sp. ATCC 29123 Clostridium botulinum ATCC 7928 *Lactobacillus sp. (LP33) 11 10 + 7 Gram(-) bacteria E. coli ATCC 25922 Pseudomonas sp. ATCC 27853 - - Fungus Candida albicans CRCC 26512 - * LP33 菌是由市售 LP33 優酪乳所篩選出

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 1/ 1024 _1/512 _1/256 _1/128 1/64 1/32 1/16 1/ 8 1/ 4 1/ 2 1 OD 600 Dilution of Antibiotics 圖十三. RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質針對

Staphylococcus sp.之

最小抑制濃度(MIC) 將 RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質(50μl 抑菌環為 14mm)利用甲醇 做系列稀釋之後，以 49μl稀釋的抗菌物質，與含有經培養後其OD600為 0.1 之Staphylococcus sp. 1μl，一起加入 950μl NAM中震盪培養 (30℃、150 rpm)；培養 12 小時後，於OD600測其吸光值。

圖十四. RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質對

Clostridium botulinum

之 抑制情形

1, 2 : 為二重複實驗，抗菌物質濃度為OD504=10

生長停滯性抑制或完全殺死性抑制。將抗菌物質添加 Staphylococcus aureus 菌液之 NAM 液態培養基中，培養約 12 小時後，移除抗生物 質，加入新的NAM 培養基(不含抗菌物質)，再培養約 12 小時，比較 前後菌量的生長情形。結果如圖十五所示，比較前後差異，紅色抗菌 物質移除後的吸光值為移除前的6 倍，且對照未加菌的控制組，其吸 光值與加入抗菌物質的菌液接近，表示菌體在紅色抗菌物質存在的情 況下，有被抑制生長的現象，待移除抗菌物質後，吸光值明顯的增加， 菌量出現明顯生長狀況。因此，就實驗結果判斷，此抗菌物質的作用 機制為生長停滯性抑制而非殺死性抑制。 八. 抗菌物質對肉品保色效果 將切片的猪肉片浸置在不同濃度的紅色抗菌溶液中，一段時間後 將肉取出並閒置數小時，觀察肉品顏色的轉變並記錄之，最後將肉片 以清水洗滌，紀錄洗滌前後肉片顏色。結果如圖十六所示，經紅色抗 菌物質溶液處離過的肉片明顯較未處理的鮮紅，且隨著濃度的增加紅 色色度增強效果更明顯；而肉片經水洗滌後，顏色並未因此而退去， 故此紅色抗菌色素對肉品有明顯且穩定的附著能力，可同時兼具保色 性與抗菌能力，更加肯定在肉品加工上的優勢。 九. 抗菌環與吸光值之對應關係

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 12 24 Time (hours) O D 6 00nm Control Experiment 圖十五. RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質針對

Staphylococcus sp.之抑

制效應 取RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質 49μl，與含有經培養後其OD600 為 0.1 之Staphylococcus sp. 1μl，一起加入 950μl NAM中震盪培 養(30℃、150 rpm)；培養 12 小時後，於OD600測其吸光值。之後利用 無菌水清洗以移除抗生物質，加入新鮮的NAM培養基 1 ml，培養 12 小時後，再測其OD600之變化。(control：無Staphylococcus sp.添加)

A

B

圖十六. RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質對肉品的染色效果

將肉片浸泡於不同OD502值(1~5)之紅色抗菌物質粗養液中 1 小

如圖十七所示，當OD504值介於 0.3~0.9 之間時。紅色抗菌物質 其抗菌活性與OD504成正比，其R2為 0.93，顯示紅色抗菌物質的吸光 值，與抗菌活性幾呈線性關係。 十. 紅色抗菌物質之固定 未經處理的bead 呈白色，bead 僅加入紅色抗菌物質，以水清洗 時，會將大部份色素洗去，bead 呈淡粉紅色，顯然紅色抗菌物質沒有

固定在bead 上。而 bead 加上 glutardialdehyde 之後，會先呈現褐色，

而最後以水清洗多餘的色素時，會將大部份的原先在bead 上的色素 洗去，但其顏色較上一組明顯。加入polyethylenimine(PEI)後，顏色 不變，再加入glutardialdehyde 後呈粉紅色，加入色素搖晃後呈紫色， 以水清洗多餘的色素後，bead 仍為紫色，但置於水溶液中，色素會慢 慢釋出至水中，顯示紅色抗菌物質已固定在bead，但結合仍不夠緊密。 十一.紅色抗菌物質之固定與時間的關係

以bead 分別加入 PEI (4%)、glutardialdehyde (1%) 以及紅色抗菌物

質，但時間分別延長為 2、3、4 個小時的震盪搖晃反應時間﹔反應 2

小時，再以水沖去多餘之色素時，較不會有色素從bead 中溶出。浸

泡在水中，置入冰箱隔夜，水仍為澄清﹔反應3、4 個小時間隔者，

-1 0 1 2 3 4 5 6 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1. OD 504nm Cl ear zone si ze (mm) 2 圖十七.紅色抗菌物質抗菌環與吸光值之對應關係圖 將紅色抗菌物質，以甲醇作稀釋，使其OD504值分別為 0.1~1，取 各不同OD504值之各管 50μl，作抗菌實驗，量取其抑菌環大小。

色素固定的效果越好。 十二. 紅色抗菌物質之固定與 pH 值的關係 將已固定紅色抗生素之bead，分別加入 pH 4 及 pH 7 之緩衝溶 液中，結果如圖十八所示，於pH 4 環境下，bead 會呈現紅色﹔而於 pH 7 之緩衝溶液，bead 會呈現深紅色﹔當 bead 置於水中，則呈現紫 色﹔此結果與紅色抗菌物質液於不同pH 值下，所表現的結果一致﹔ 此實驗顯示紅色抗菌物質沒有因為固定在bead 上，而使其性質改變， 增加其在應用上的便利性與可能性。 第六節 LC-MASS 定分子量 將純化所得的紅色抗菌物質，送交本校應化系 LC-MASS 定其分 子量，如圖十九所示圖譜，判讀其分子量為336 g/mole。

A B C

圖十八. RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之固定化在不同 pH 值之顏色 變化

第四章 結論與展望

綜合實驗結果，得知由 RP-46 黴菌所生產的紅色抗菌物質，在物 理性質及化學性質上： 1.在OD365下有螢光產生 2.具有相當好的耐熱性 3.其分子量為 336 g/mole 4.相較於其他的有機溶劑，在甲醇的溶解下有較好的溶解度 5.在抗菌圖譜上，主要是針對革蘭氏陽性菌抑制 6.其抗菌機制是為停滯性抑制，而非殺死性抑制 7.此紅色抗菌物質具有 pH 值指示劑的功能，於 pH ＜ 8.5 為紅色， pH 為 8.5 時為紫色，pH ＞8.5 為紫黑色 8.可以固定在 bead 上 9.對肉品的保色效果也相當的好，不會因水分的沖洗而脫色 綜合菌種及以上各項性質，發現RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質應 與先前文獻發表過的物質，並不相同；在細菌抗藥性越發嚴重的今天 ，不啻是一項相當令人興奮的事；而其多功能的用途，更說明了其極 具學術研究及應用價值。 目前所使用的紅色色素，如胭脂樹籽紅對光與pH 值敏感；而藏

紅花素雖然性質穩定，但缺點是其價格昂貴；辣椒紅本身帶有辛辣 味，亦不適合；蕃茄紅易氧化降解而無法便利使用；甜菜紅對熱、氧 氣及光線都很敏感，都會造成降解退色作用，使其在應用上受到限 制；胭脂蟲紅的染色強度很低，使其在應用上受到限制；以上紅色色 素欲使用於加工後的肉品著色上，皆有一定的問題存在；而紅麴色素 由紅麴菌產生，可大量生產，且食用的歷史相當的悠久，經實驗的証 明並沒有毒性的問題，但其分泌為內泌型色素，在取得上較費力，況 且在亞硝鹽類於肉製品應用的替代上，由於紅麴色素本身並無抗菌活 性，僅能做保色作用，故必須搭配其他抗菌物質，如乳酸鏈球菌素， 以抑制肉品中肉毒桿菌的生長，在使用上甚是不便。 而其他具有紅色色素的抗菌物質，如 actinorhodin，其雖能抑制 革蘭氏陽性菌，但卻必須在高劑量下才能作用(Wright and Hopwood, 1976)；而 violamycin，因其使用時間已相當長久，使得多數菌種對其 產生抗藥性；prodigiosins 雖然具有相當多的功能性，但由於其具毒 性(Melo et al., 2000)，故不適合添加於食品當中；最後是近來發現的 hipposudoric acid(Yoko et al., 2004)，其性質尚未完全得知，加上性質 並不穩定，也不適合作為肉類食品中，亞硝鹽類之替代物。

本實驗室所發現的 RP-46 紅色抗菌物質，其生產菌種推測為黴 菌，且紅色色素分泌於胞外，在取得上相當的容易，經實驗證明紅色

色素即為抗菌物質，且其性質相當的穩定，能夠耐高溫，其抗菌圖譜 專一針對革蘭氏陽性菌具抑制性，包含 Bacillus cereus、Staphylococcus aureus 等菌，而對 Clostridium botulinum 亦有相當好的效果；綜合以

上性質，的確具有替代亞硝鹽類於肉製品應用的可能性。只要能進一 步做毒性測試，證明其毒性不高，或許其出現於人類日常生活中是指 日可待的。 細菌可能會引發各種疾病，嚴重的可能會致癌(Lax, 2005)，所以 人類利用許許多多的藥物，企圖抑制疾病的發生，其中當然包括了抗 生素；在抗生素使用氾濫的今天，由於人類把抗生素視為萬靈丹的濫 用，許多原本對抗生素敏感的細菌，都開始產生了抗藥性，如院內感 染嚴重的Staphylococcus aureus等(Woodford, 2005)，以及會產生肺結 核的肺結核桿菌，這些都是人類相當害怕的敵人；唯有不斷開發新的 藥物，去抵抗每天不斷改變的新菌種，這樣人類才有保障；而研發新 的抗生素，也是其中非常重要的一環；RP-46黴菌所產生的紅色抗菌 物質，是未見於文獻中一種嶄新的抗菌物質，或許此一藥物的研發， 可以稍稍紓緩日益嚴重的病菌抗藥性的問題；最後，由於其本身還具 有pH指示劑的功能，並且可以固定在以幾丁寡醣為材質的beads上， 在未來的開發運用上，又多了一項可能；一種集合紅色色素、抗菌物 質、pH指示劑多功能的物質，意味含多元的可能性，或許再不久的

日子裡，RP-46黴菌生產的紅色抗菌物質，不僅能在學術上佔有一席 之地，也可能在生活中實際的運用。