第一節 抑菌活性分析方法 一. 紅色物質測定
由於每種色素皆有其獨特之吸收光譜，故藉其光譜的特徵可作為 色素定量分析之用。如圖二所示，此色素共有三個波峰，其波長分別 為：416 nm、502nm、541nm；最大吸收波長為 500nm-505nm 之間，
利用此色素之光譜特性，可藉此定量色素。
二. 抗菌活性檢測
如圖三所示，進行抗菌實驗檢測時，由於抑菌環之大小會受到抗 菌物質的量及檢測菌濃度的影響。本實驗所用的測量方式，是直接在 固態培養基上挖取直徑9 mm 大小的孔洞，於孔洞中加入待測的抗菌 物質；抑菌環大小是以孔洞外圍至抑菌環外環來計算。
三. 薄層色層分析(TLC)
利用 silica gel 60 TLC，以三氯甲烷：甲醇 = 10：1 比例為展 開液，分析各階段產物。如圖四所示，其排列由上至下依序是橙色、
紅色、紫色，顯示其極性以紫色最強，紅色次之，而橙色較偏非極性；
其Rf 值分別為：紫色為 0，紅色為 0.47，而橙色為 0.54。
圖二. RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質菌液之吸收光譜
以分光光度計對紅色物質做全光譜掃描，出現的最大吸收波長值 即為紅色抗菌物質主要吸收波長，經確認紅色吸收波長為 500nm 至 505nm 之間，以 502nm 為吸收最高峰，便以此波長做為測定抗菌物質 之吸收波長。
圖三. RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之抑菌環
取 10ml 未凝固約 40~45℃含 MY 之固態培養基，加入 4μl 之
Bacillus cereus
菌液，倒入培養皿中；待凝固後，在固態培養基上 挖 9 mm 的圓孔，加入 50μ 待測物質，將此培養皿置入 30℃培養箱 約 20 小時，觀測其抑菌環大小；抑菌環(雙箭號)的測量方式為以孔 洞的最外圍為始，單邊量取至透明區域接觸至始有Bacillus cereus
生長的區域為終。圖四. RP-46黴菌生產紅色抗菌物質薄層色層分析圖
以 slica gel 60 TLC 片作分析，展開液為三氯甲烷：甲醇= 10：1
第二節 培養基探討
在實驗初期是將RP-46黴菌培養在MY固態培養基上，且生長情 形良好，於是抗菌物質生產初期便是以MY液態培養基進行生產，且 有不錯的生產量。但隨著培養時間的增加，培養液的顏色由橙色、紅 色漸漸轉變為紫色，甚至轉變為黑紫色；顯見培養液中具有複雜的成 分。有鑒於培養基的複雜將嚴重影響後續的純化步驟，故在不減少產 量的前提下，決定更進一步尋找其最佳的生產條件，盼能在純化流程 上使其更簡單。故利用異於MY培養基的生長條件，使此RP-46黴菌 在生長過程的培養液顏色變化固定在紅色階段，使培養基可以維持在 更簡化的狀態下，兼具利於純化與減少成本的兩大優點。
一. 抗菌物質之生產天數測定與 pH 的改變
透過吸光值測量與抗菌活性測試，連續監測培養液的變化，決定 抗菌物質最大產量的培養天數。如圖五所示，此培養液伴隨著天數的 增加吸光值不斷改變，且在第六天出現最大值；再對照抗菌活性的結 果，亦在第六天有最好的抗菌活性表現。比對吸光值與抗菌活性的變 化，可判斷此抗菌物質的產量與抗菌活性成正比，故在第六天出現最 大產量與最佳抗菌活性。再觀察整個培養過程 pH 的變化，由一開始 培養基未加入菌體時為6，在加入菌體培養兩天後微量下降至最低約
OD502
Clear zone size (mm) pH
Clear zone size (mm)
10 10
5，爾後隨著培養天數的增加 pH 開始持續上升，至第九天時 pH 可高 達8，藉此可判斷菌體在生長過程中會釋放具弱鹼性的代謝物質，使 培養液由弱酸性轉化為弱鹼性。
二. 碳源及其濃度的影響
如表一所示，不同碳源對抗菌物質生成的影響中，以葡萄糖、蔗 糖與果糖有較好的培養效果，而麥芽糖、乳糖、纖維素及澱粉則無助 益，尤其以纖維素為最差，並沒有具活性的抗菌物質生成。此外，在 不添加任何碳源時，亦沒有抗菌性質的表現，經由這點可看出碳源對 於抗菌物質生成具極大影響，而且是不可或缺的成分。其中在葡萄 糖、蔗糖與果糖選用的比較上，我們利用較少體積的抗菌物質，去作 抑菌環的測試，相較之下，果糖作為碳源的培養基，可以得到相對較 好的效果，所以選用果糖作為培養基中的碳源成分。再進一步檢討果 糖的添加濃度，如表二所示，1.5%果糖的培養基所生產的抗菌物質，
相較之下有不錯的活性，而更高濃度的果糖未有更好的生產效果，於 是選用1.5%果糖作為最適碳源的添加濃度。
三. 氮源及其濃度的影響
由於此抗菌物質的生產，會隨著天數的增加，伴隨著顏色漸漸由 淺入深，由早期的橙色、紅色、紫色、至晚期逐漸成為黑紫色，在改
表一. 碳源種類對 RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之影響
Carbon sources (1%) OD502 Clear zone size (mm)
None 1.1 0
Cellulose 1.1 0
Fructose 10.0 10
Glucose 8.6 10
Lactose 2.2 5
Maltose 5.6 8
Starch 5.3 8
Sucrose 8.5 10
基礎培養液：0.5% peptone, 0.3% malt extract 和 0.3% yeast extract 培養條件 : 於 30℃下震盪培養 6 天
抑菌環 (mm) ：每個樣本各取 50μl 粗培養液作抗菌活性測試，並測 量其抑菌環
OD502：每個樣本之培養液經 10 倍稀釋後，以分光光度計測量 502 nm 之吸收值，表內數值為吸收值乘以 10 倍之推算值
表二. 果糖濃度對 RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之影響
Fructose conc.(%) OD502 Clear zone size (mm)
0 0.5 0
0.5 7.4 6
1.0 9.6 10
1.5 10.6 10.5
2.0 9.2 10
2.5 8.7 10
3.0 8.7 10
基礎培養液：0.5% peptone, 0.3% malt extract 以及 0.3% yeast extract.
培養條件 : 於 30℃下震盪培養 6 天
變碳源後，對此現象亦無太大改善，故我們便著手於改變氮源，試圖 改變此現象。如表三所示，不同碳源對抗菌物質生成的影響中，以麥 芽抽出物、酵母抽出物、蛋白萃取物皆有不錯的培養效果，但觀察其 培養基之顏色，酵母抽出物與蛋白萃取物為氮源的培養液皆有變紫的 現象；而以麥芽抽出物培養的培養液，則可維持呈現紅色，於是便選 擇麥芽抽出物作為培養基中的氮源。再進一步檢討麥芽抽出物的添加 濃度，如表四所示，1.5%的麥芽抽出物的培養基所生產的抗菌物質，
相較之下可有相當高的活性，於是選用1.5%的麥芽抽出物作為最適氮 源的添加濃度。
四. 無機鹽類的影響
由於金屬離子常在細胞的生理上具重要的功能，故實驗中亦經由 無機鹽類的添加，期盼RP-46 黴菌能將其加以利用，並促進抗菌物質 的生成。然而如表五所顯示，添加無機鹽類的實驗結果卻不盡理想，
大部分的無機鹽類都僅能維持原有的抗菌活性表現，而氯化鐵、氯化 錳以及氯化鋅，更是對抗菌物質的生產有負面的影響；就整體來看，
不添加何無機鹽類的培養基，在抗菌物質的生產上有較好的效果；依 照本實驗的實驗結果，我們決定了生產RP-46 抗菌物質的培養基，並 不需要無機鹽類的添加。
表三. 氮源種類對 RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之影響
Nitrogen sources (0.5%) OD502 Clear zone size (mm) Ammonium sulfate 0.3 1
Casien 5.5 9
Malt extract 5.9 10
None 2.8 9
Peptone 3.0 9
Soybean 2.3 8
Tryptone 5.5 10
Urea 0.3 0
Yeast Extract 6.2 10 基礎培養基：1.5% fructose.
培養條件 : 於 30℃下震盪培養 6 天
表四. 麥芽抽出物濃度對 RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之影響 Malt Extract conc.(%) OD502 Clear zone size(mm)
0 5.2 9
0.25 6.8 9
0.50 6.2 10
0.75 6.6 10
1.00 7.7 10
1.25 8.2 10
1.50 9.8 10.5 2.00 9.0 10.5 2.50 8.7 10.5 3.00 8.6 10.5 基礎培養基：1.5% fructose.
培養條件 : 於 30℃下震盪培養 6 天
表五. 無機鹽種類對 RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之影響 Inorganic salts sources
(0.05%)
OD502 Clear zone size (mm)
None 9.6 10.5
CaCl2 5.0 8.0
FeCl3 0.7 0
KCl 6.0 8.0
MgCl2 4.6 7.5
MnCl2 0.9 3.0
NaCl 8.0 10
ZnCl2 0.4 0
基礎培養基：1.5% fructose 1.5% malt extract 培養條件 : 於 30℃下震盪培養 6 天
藉由前面一連串培養基探討的實驗，我們選擇了 1.5%果糖 1.5%
A B
圖六. 不同培養基對 RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之薄層色層分析 圖
A：1.5% fructose 與 1.5% malt extract 培養基；
B：MY 培養基
(TLC 展開液為三氯甲烷：甲醇 = 10：1)
產出的粗培養液，其pH 值接近 6.5 左右，可能是因為 MY 其中含的
去除油脂物，避免污染紅色的有機層部分。
(2) 減壓濃縮
將以三氯甲烷萃取之有機層，經減壓濃縮趕去三氯甲烷，抽至全 乾後，以少量之正己烷洗下，此時抗菌物質為不溶解狀態，呈現粉末 的現象；久置後，會沉澱於底部；與粗培養液相比，回收率為78%。
(3) Silica gel 60 管柱層析
將正己烷洗下之粉末，通過玻璃管柱，分別以不同比例之乙酸乙 酯與正己烷 (10：3，10：2，10：1)沖洗，在乙酸乙酯：正己烷 = 10：
3 時，可見到黃色部分緩緩自頂部往下層移動，等黃色部分流至底部 時，再更換溶劑為 10：2 之比例，此時黃色部分會全部流出，而另一 橘色部分會往底部流動，待其到達底部時，更換溶劑為10：1，讓橘 色部分完全流出，再用三氯甲烷：甲醇 = 6：4 沖洗，此時可觀察到 一紅色部分緩緩下降，當其流至底部時，有一些結晶物質流出，將這 些結晶物連同些許液體另外保存，待全部紅色液體流完後，顏色會逐 漸變淡；最後以甲醇沖洗，可得一紫色溶液，將自結晶之後所得到的 三氯甲烷：甲醇 = 6：4 沖洗部分收集起來，利用減壓濃縮抽乾後，
再以甲醇回溶，回收率為45%。
(4) LH-20 gel filtration column
將上述經甲醇回溶的部分，再通過以甲醇溶液混合膠體填充配置 好的LH-20 gel filtration column，並以甲醇沖洗之。隨著甲醇的流動 不斷將產物往下帶，玻璃柱內會出現三種色帶，如圖七所示，由上至 Sephadex LH-20 膠體過濾管柱，於有色素流出的後期，可得一活性頗 高的紅色物質，由流出的順序判定，此紅色物質的分子應在較大的範
表六. RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質之純化表
Step
Total volume (ml)
Total activity (mm)
Yield (%) Crude extract 1000 11000 100 Chloroform extract 750 8625 78 Silica gel column 500 5000 45 LH-20 gel filtration
column
230 3410 31
各步驟所得液體之抑菌環 (mm) ×液體之體積 (ml)
回收率(%) = ---× 100 粗培養液之抑菌環(mm) × 粗培養液之體積 (ml)
圖七. 利用 LH-20 分子篩管柱純化紅色抗菌物質照片圖 箭頭標示甲醇之流向
A B C
圖八. RP-46 黴菌生產紅色抗菌物質純度與抗菌活性薄層色層分析圖 A：25% 硫酸水溶液處理；B：純化後之紅色抗菌物質；C：抗菌 活性分析。(TLC 展開液為三氯甲烷：甲醇 = 10：1)
質，並無其他物質被顯現出來；且未經過處理的 TLC 片在抗菌活性 檢測上，出現明顯抗菌區塊，其抗菌位置即為紅色抗菌物質的位置所 在。在相互比對下，可確定該抗菌物質已被成功自RP-46 黴菌生成的 菌液中單離出來。故說明經此純化過程，可完全純化出此一紅色抗菌
質，並無其他物質被顯現出來；且未經過處理的 TLC 片在抗菌活性 檢測上，出現明顯抗菌區塊，其抗菌位置即為紅色抗菌物質的位置所 在。在相互比對下，可確定該抗菌物質已被成功自RP-46 黴菌生成的 菌液中單離出來。故說明經此純化過程，可完全純化出此一紅色抗菌